植物組織中脂肪氧化酶活力的測(cè)定方法

脂肪氧化酶(LOX)是一種含非血紅素鐵的蛋白質(zhì)，專(zhuān)一催化具有順、順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸加氧反應(yīng)，氧化生成具有共軛雙鍵的過(guò)氧化氫物。它廣泛存在于高等植物 體內(nèi)，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、植物的衰老、脂質(zhì)過(guò)氧化作用和光合作用、傷反應(yīng)及其他脅迫反應(yīng)等有關(guān)。

【原理】

根據(jù)基質(zhì)濃度一定、反應(yīng)體系中溶解氧濃度的變化與酶活力大小呈線(xiàn)性相關(guān)的原理進(jìn)行測(cè)定。LOX氧化多元不飽和脂肪酸形成具有共軛雙鍵的過(guò)氧化氫物時(shí)消耗氧氣，溶液中氧濃度的減少速率與酶活力大小成正比，利用氧電極可以精確地測(cè)定酶活力。

【儀器與用具】

氧電極1套;記錄儀1臺(tái);超級(jí)恒溫水浴鍋1臺(tái);離心機(jī)1臺(tái);抽濾器 1套;1ml注射器1支;吸量管：5ml 1支，1ml 1支;吸耳球1個(gè);小研缽1套;剪刀1把。

【試劑】

0.25%亞油酸;Tris-鹽酸緩沖液(25mmol/L，pH7.5);石英砂;0.5mol/L氯化鉀溶液;

【方法】

1.樣品提取 取新鮮植物樣品，擦凈組織表面污物，剪碎混勻，稱(chēng)取0.5g放入研缽中，加入5ml 25mmol/L Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)，于冰浴中研磨，研成均漿，利用高速冷凍離心機(jī) 于0~4℃條件下離心(4000×g)5min，上清液為粗酶提取液。

2.測(cè)定 氧電極的操作方法見(jiàn)儀器的操作手冊(cè)。開(kāi)啟恒溫水浴，調(diào)節(jié)測(cè)定溫度為25℃。

洗凈氧電極反應(yīng)杯，先加入2.5mlTris-鹽酸緩沖液、1ml酶提取液，放松磁力攪拌制動(dòng)器，保溫平衡5~10min，制動(dòng)磁塊，把電極插入反應(yīng)杯中，從狹槽中排出全部空氣，用1ml注射器加長(zhǎng)針頭從狹槽中注入0.25%亞油酸0.2ml，打開(kāi)記錄儀記錄耗氧曲線(xiàn)(走紙速度的大小視酶活力確定，曲線(xiàn)呈45度角為宜)，測(cè)定5min，吸取廢液，清洗反應(yīng)杯進(jìn)行下一個(gè)樣品的測(cè)定。

3.計(jì)算結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)以空氣飽和水中的含氧量為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)電極進(jìn)行標(biāo)定，求算出測(cè)定溫度下，記錄紙每個(gè)小格所代表氧量的變化值。

從樣品測(cè)定曲線(xiàn)上選定耗氧的下降格數(shù)(n)，根據(jù)走紙速度(v)和下降n格走紙的距離(L)，可求出測(cè)定液中耗氧的變化速率(R)：

R(μmol O2/min)=n×μmol O2/格×v/L

根據(jù)提取液體積和樣品重量，即可求出LOX的活力：

LOX(μmol•g﹣1•min﹣1)=R×V/W

式中 V-提取液的體積; W-樣品鮮重。

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