黑木耳Auricularia heimuer是一種主要生長(zhǎng)在櫟樹(shù)倒木上的食藥兩用的大型真菌(Wu et al. 2014;戴玉成等2021),具有較高的營(yíng)養(yǎng)與保健價(jià)值(趙玉紅等 2016),其富含多糖、黃酮和多酚類等活性物質(zhì),具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、調(diào)節(jié)血脂、降壓和降血糖等功效(Fan et al. 2007;Wu et al. 2019)。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,肥胖等問(wèn)題日益突出,目前較常見(jiàn)的肥胖治療方法為藥物治療(徐春花等 2021)與運(yùn)動(dòng)減肥控制體重,藥物治療易產(chǎn)生安全性問(wèn)題(崔家玉和謝曉慧 2016;沈煥玲和張螢 2018);運(yùn)動(dòng)減肥則需要較長(zhǎng)的時(shí)間周期,且常常因?yàn)闊o(wú)法堅(jiān)持而失敗(王鴻偉等 2021)。因此從天然食物中尋找安全有效的抗肥胖成分對(duì)肥胖的預(yù)防和治療具有重要的意義。而黑木耳食藥同源,有益身體健康,可以作為一種解決肥胖病的新思路。近年來(lái),學(xué)者對(duì)于黑木耳的研究主要針對(duì)提高木耳多糖的提取率、優(yōu)化提取工藝(侯靜宇等 2020)。而針對(duì)其減肥功效方面及其他活性成分的研究較少(趙二勞等 2018),本文針對(duì)黑木耳在營(yíng)養(yǎng)性肥胖預(yù)防方面的作用進(jìn)行研究,旨在為肥胖病人提供合理的膳食,為開(kāi)發(fā)有效的抗肥胖功能食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 動(dòng)物

選取雄性ICR小鼠,清潔級(jí),5周齡,體重(15±2) g,動(dòng)物合格證：SCXK (滬) 2017-0005,上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 材料和儀器

黑木耳粉：子實(shí)體由北大荒營(yíng)銷股份有限公司提供,生產(chǎn)日期為2019年5月2日。黑木耳干品經(jīng)粉碎后,60目過(guò)篩;奧利司他膠囊：魯南制藥集團(tuán),生產(chǎn)日期為2019年9月11日,產(chǎn)品批號(hào)為H20143119;總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、高密度脂蛋白(HDL-C)試劑盒、低密度脂蛋白(LDL-C)試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼料購(gòu)于閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易有限責(zé)任公司,本次實(shí)驗(yàn)分為3種動(dòng)物飼料：基礎(chǔ)飼料,高脂飼料,添加黑木耳粉的高脂飼料。

基礎(chǔ)飼料組分：玉米、豆粕、小麥麩、小麥次粉、魚(yú)粉、大豆油、石粉、碳酸氫鈣、鹽、氮化膽堿、賴氨酸、多種維生素和多種礦物元素。

高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料78.8%、蛋黃粉10%、豬油10%、膽固醇1%和膽鹽0.2%。

黑木耳粉高脂飼料配方(吳娟等 2010)：基礎(chǔ)飼料68.8%、蛋黃粉10%、豬油10%、黑木耳粉10%、膽固醇1%和膽鹽0.2%。

48只5周齡健康雄性ICR小鼠同室分籠飼養(yǎng),12 h光照、12 h黑暗,自由采食飲水,控制溫度(23±2) ℃,相對(duì)濕度(50±10)%。以基礎(chǔ)飼料飼喂一周,使小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

小鼠適應(yīng)一周后,隨機(jī)分為4組,即正常對(duì)照組(CK)、高脂組(HFD)、陽(yáng)性藥物對(duì)照組(PD)、黑木耳粉添加組(AH),每組12只小鼠。

CK組用基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng),AH組用黑木耳粉高脂飼料飼養(yǎng),HFD、PD組用高脂飼料飼養(yǎng)。2周時(shí),高脂組小鼠的體重顯著高于對(duì)照組小鼠體重,說(shuō)明造模成功(李婧等 2013)。從第2周開(kāi)始進(jìn)行灌胃,每天灌胃時(shí)間固定,灌胃劑量為0.1 mL/10 g·bw,CK組、HFD組和AH組每日灌蒸餾水;PD組灌胃奧利司他,濃度為50 mg/kg·bw (Hariri & Thibault 2010)。

每天更換墊料清洗籠具,記錄飲食量和體重,每天循環(huán)光照或黑暗各12 h,所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵照“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南”進(jìn)行。

1.2.2 小鼠生理指標(biāo)的檢測(cè)

小鼠體重和Lee’s指數(shù)：對(duì)小鼠每天定時(shí)稱量體重并記錄;Lee’s指數(shù)綜合反映了體重和體長(zhǎng)的關(guān)系,能較好體現(xiàn)小鼠的肥胖程度(劉井如等 2013)。每日定時(shí)稱量小鼠體重,每周對(duì)小鼠體長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量(鼻尖至肛門距離),結(jié)合小鼠體重計(jì)算Lee’s指數(shù),Lee’s指數(shù)按公式(1)計(jì)算(蘇坤霞 2018)：

小鼠樣品收集：實(shí)驗(yàn)結(jié)束(9周)后,小鼠禁食不斷水12 h,眼球采血后注入麻醉劑脫頸處死。收集血液后解剖小鼠,將小鼠皮下脂肪、附睪脂肪、肝臟、脾和腎臟組織完整取下,用0.9%生理鹽水清洗器官后稱重。附睪脂肪、一部分肝臟儲(chǔ)存在10%福爾馬林中,用于組織切片分析;一部分肝臟放入凍存管中經(jīng)液氮冷凍處理,放入-80 ℃冰箱保存,用于代謝組學(xué)的分析。

對(duì)皮下脂肪、附睪脂肪、肝臟、脾和腎臟組織的重量進(jìn)行記錄,得出臟器指數(shù),臟器指數(shù)按公式(2)計(jì)算(李國(guó)華等 2005)：

1.2.3 小鼠血脂指標(biāo)的測(cè)定

小鼠血脂指標(biāo)的測(cè)定：9周末,用眼球采血方式獲得小鼠全血,室溫靜置0.5 h后4 ℃、5 000 r/min離心10 min,吸取上層血清,根據(jù)試劑盒的操作步驟和要求測(cè)定小鼠血清中葡萄糖(glucose,GLU)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的含量。

1.2.4 小鼠肝臟指標(biāo)的測(cè)定

取一部分肝臟用生理鹽水清洗后放入離心管中,按重量體積比為1:9加入9倍體積的無(wú)水乙醇,用勻漿機(jī)在冰水浴下進(jìn)行充分研磨,勻漿結(jié)束后4 ℃、5 000 r/min離心10 min,吸取上清液,根據(jù)試劑盒的操作步驟和要求測(cè)定小鼠肝臟中TC、TG、HDL-C和LDL-C的濃度(黃文麗等 2019)。

1.2.5 小鼠肝臟和附睪脂肪切片分析

將肝臟組織和附睪脂肪用10%福爾馬林固定24-48 h,用梯度乙醇70%-100%脫水處理,二甲苯洗脫,石蠟包埋,切片(5 μm),用蘇木精和伊紅染色組織切片,并在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.6 腸道菌群的測(cè)定

采用CTAB法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度,取適量的樣本DNA于離心管中,使用無(wú)菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因DNA為模板,使用帶Barcode的特異引物、Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer (New England Biolabs)和高效高保真酶進(jìn)行16S V4和18S V4區(qū)DNA的PCR擴(kuò)增。引物序列：515F (5?-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3?)和806R (5?-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3?),528F (5?-GCGGTAATTCCAGCTCCA-3?)和706R (5?-AATCCRAGAATTTCACCTCT-3?)。

PCR產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè);對(duì)檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化,采用酶標(biāo)定量,根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣,充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,對(duì)目的條帶使用膠回收試劑盒(Qiagen)回收產(chǎn)物。

使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR定量,文庫(kù)合格后,使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù),進(jìn)行拼接、過(guò)濾,得到有效數(shù)據(jù)。然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs (operational taxonomic units)聚類和物種分類分析,基于其結(jié)果,進(jìn)行多樣性指數(shù)分析,并在各分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析和物種豐度差異分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各組測(cè)定值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異按方差分析進(jìn)行檢驗(yàn),并用最小顯著差法檢驗(yàn)作兩兩比較,以P<0.05為顯著差異,以P<0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重和Lee’s指數(shù)

不同組小鼠的體重變化情況見(jiàn)圖1。經(jīng)過(guò)一周適應(yīng)期,小鼠體重增加到(27±1) g,此時(shí)小鼠體重組間無(wú)顯著性差異(P>0.05);灌胃一周后,HFD組與CK組之間有顯著差異(P<0.05),表明高脂飼料能夠引起小鼠體重增長(zhǎng)或脂肪細(xì)胞代謝紊亂(李婧等 2013),說(shuō)明造模成功;灌胃4周后,與HFD組相比,CK組、PD組和AH組體重分別減少了5.84、3.37和2.08 g,HFD組與CK組之間有極顯著差異(P<0.01);與PD組、AH組之間有顯著差異(P<0.05)。灌胃6周后,與HFD組相比,CK組、PD組和AH組體重分別減少7.69、4.82和2.95 g,HFD組與AH組之間有顯著差異(P<0.05),與CK組、PD組之間有極顯著差異(P<0.01);灌胃8周結(jié)束時(shí),與HFD組相比,CK組、PD組和AH組體重分別減少9.43、6.26和3.47 g,HFD組與CK組、PD組之間有極顯著差異(P<0.01);與AH組之間有顯著差異(P<0.05)。綜上所述,黑木耳粉直接喂養(yǎng)小鼠對(duì)肥胖有一定的預(yù)防效果。

圖1 不同組小鼠體重變化情況

與CK組對(duì)比,*P<0.05,**P<0.01;與HFD組對(duì)比,# P<0.05,## P<0.01,下同

Fig. 1 Changes of body weight in different treatment groups of mice.

*P<0.05 and **P<0.01 compared with the CK group; # P<0.05 and ## P< 0.01 compared with the HFD group. The same below.

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不同組小鼠Lee’s指數(shù)變化情況見(jiàn)表1。灌胃剛開(kāi)始時(shí)各組間無(wú)明顯差異(P>0.05);CK組與HFD組在灌胃第一周有顯著差異(P<0.05),第二周有極顯著差異(P<0.01)。Lee’s指數(shù)的變化趨勢(shì)與體重變化趨勢(shì)基本一致。

表1 小鼠Lee’s指數(shù)變化表

Table 1 Changes of Lee’s index in mice

處理組
Treatment
groups 不同周數(shù)Lee’s指數(shù)
Lee’s index at different weeks 0周
0 week 1周
1 week 2周
2 week 3周
3 week 4周
4 week 5周
5 week 6周
6 week 7周
7 week 8周
8 week CK 14.27±
0.21 14.66±
0.29 14.79±
0.25 15.19±
0.35 15.17±
0.29 15.20±
0.23 15.38±
0.27 15.48±
0.33 15.44±
0.35 HFD 14.38±
0.28 15.00±
0.22* 15.39±
0.23** 15.59±
0.35** 15.82±
0.46** 15.86±
0.35** 16.10±
0.42** 16.25±
0.40** 16.25±
0.51** PD 14.28±
0.19 14.68±
0.33# 15.13±
0.44 15.46±
0.36 15.45±
0.47# 15.48±
0.38# 15.66±
0.40## 15.73±
0.48## 15.72±
0.37## AH 14.44±
0.28 14.99±
0.37 15.31±
0.39 15.48±
0.48 15.60±
0.51 15.63±
0.46 15.87±
0.36 15.89±
0.52## 15.90±
0.52##注：與CK組對(duì)比,*P<0.05,**P<0.01;與HFD組對(duì)比,#P<0.05,##P<0.01,下同Note: *P<0.05 and **P<0.01 compared with the CK group; #P<0.05 and ##P<0.01 compared with the HFD group. CK, normal control group; HFD, high fat treatment group; PD, positive control group; AH, Auricularia heimuer fruiting body powder treatment group. The same below.

2.2 黑木耳對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

附睪脂肪指數(shù)、皮下脂肪指數(shù)、肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和脾臟指數(shù)見(jiàn)圖2。HFD組的附睪脂肪指數(shù)明顯高于CK組(P<0.01) (圖2A),表明營(yíng)養(yǎng)型肥胖使小鼠附睪脂肪指數(shù)升高;與HFD組相比,AH組能夠顯著降低附睪脂肪指數(shù)(P<0.05),表明黑木耳粉代替物能夠降低營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠的附睪脂肪指數(shù)。HFD組的皮下脂肪指數(shù)明顯高于CK組(P<0.01) (圖2B),表明營(yíng)養(yǎng)型肥胖使小鼠皮下脂肪指數(shù)升高;AH組對(duì)皮下脂肪指數(shù)無(wú)明顯作用。HFD組的肝臟指數(shù)明顯高于CK組(P<0.01) (圖2C),表明營(yíng)養(yǎng)型肥胖使小鼠肝臟指數(shù)升高;與HFD組相比,AH組能夠明顯降低肝臟指數(shù)(P<0.01),表明黑木耳粉代替物能夠降低營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠的肝臟指數(shù)。營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠腎臟和脾臟指數(shù)不會(huì)顯著增加(P>0.05),HFD組、CK組、AH處理組和PD組均無(wú)顯著變化(圖2D,2E),與顧施健等(2010)的報(bào)道一致。

圖2 不同組的小鼠臟器指數(shù)

A：附睪脂肪指數(shù);B：皮下脂肪指數(shù);C：肝臟指數(shù);D：腎臟指數(shù);E：脾臟指數(shù)

Fig. 2 Organ index of mice in different treatment groups.

A: Epididymal fat index; B: Subcutaneous fat index; C: Liver index; D: Kidney index; E: Spleen index.

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以上結(jié)果表明,黑木耳粉代替部分膳食能夠有效降低營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠的附睪脂肪指數(shù)和肝臟指數(shù),說(shuō)明黑木耳粉代替部分膳食在降低營(yíng)養(yǎng)型肥胖方面也有一定的功效。

2.3 小鼠血脂指標(biāo)的檢測(cè)

肥胖會(huì)引起血脂異常,肥胖癥患者往往伴隨GLU、TC、TG、LDL-C升高和HDL-C大幅減少等問(wèn)題(原萌謙等 2016),因此本研究檢測(cè)了各組小鼠的血脂指標(biāo),以此判定出其對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同組小鼠血清五項(xiàng)指標(biāo)的含量

A：葡萄糖;B：膽固醇;C：甘油三酯;D：低密度脂蛋白膽固醇;E：高密度脂蛋白膽固醇

Fig. 3 Content of five indexes in serum of different treatment group of mice.

A: GLU; B: TC; C: TG; D: LDL-C; E: HDL-C.

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血清中GLU含量是判斷機(jī)體健康的重要指標(biāo)(Berry et al. 2010),具有十分重要的意義。CK組GLU含量最低,HFD組最高(圖3A),HFD組與CK組之間有極顯著差異(P<0.01),表明營(yíng)養(yǎng)型肥胖會(huì)使血清GLU的含量上升;AH組GLU含量比HFD組低(P<0.01),AH組在一定程度上降低了血清GLU濃度,說(shuō)明黑木耳粉有一定降低血清葡萄糖的功能。

TC升高會(huì)造成冠心病和缺氧性腦卒中等疾病,其濃度與冠心病的發(fā)病率呈正相關(guān)(Maxfield & Tabas 2005)。HFD組與CK組相比,血清TC明顯上升(P<0.01) (圖3B),表明營(yíng)養(yǎng)型肥胖會(huì)使血清中TC的含量上升;與HFD組相比,PD組能夠顯著降低血清中TC的含量(P<0.05),AH組含量TC無(wú)顯著降低。

高脂飼料會(huì)引起小鼠TG水平的升高(王品等 2021),TG濃度過(guò)高會(huì)造成心腦血管疾病,過(guò)量的TG會(huì)導(dǎo)致肥胖從而引發(fā)慢性并發(fā)癥(Yuan et al. 2007)。HFD組與CK組相比,血清中TG水平明顯上升(P<0.01) (圖3C),表明營(yíng)養(yǎng)型肥胖會(huì)使血清TG含量上升;與HFD組相比,PD組、AH組能顯著降低血清TG的含量(P<0.01),表明AH組有一定降低血清中TG濃度的效果。

LDL-C是運(yùn)輸內(nèi)源性膽固醇進(jìn)入組織細(xì)胞的主要載體,研究發(fā)現(xiàn)若LDL-C的含量過(guò)多,會(huì)使其攜帶的膽固醇沉積于動(dòng)脈壁上,引起動(dòng)脈粥樣硬化等,造成心血管疾病危害人體健康(Nakamura et al. 2020),冠心病發(fā)病幾率與LDL-C水平呈正相關(guān)(LaRosa et al. 1990)。與CK組相比,HFD組血清中的LDL-C顯著升高(P<0.01) (圖3D),表明營(yíng)養(yǎng)型肥胖會(huì)使小鼠體內(nèi)的LDL-C含量明顯升高;AH組與HFD組相比無(wú)明顯差異,AH組無(wú)明顯效果。

HDL-C在機(jī)體中負(fù)責(zé)將膽固醇等轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟,從而使外周膽固醇得到清除(Rashid & Genest 2007)。與CK組相比,HFD組血清中的HDL-C顯著降低(P<0.01) (圖3E),表明營(yíng)養(yǎng)型肥胖會(huì)使小鼠體內(nèi)的HDL-C含量明顯降低;PD組、AH組小鼠的HDL-C均顯著高于HFD組(P<0.01),表明黑木耳粉能夠顯著增加營(yíng)養(yǎng)型肥胖小鼠體內(nèi)的HDL-C含量,產(chǎn)生的HDL-C能夠?qū)⒀鼙趦?nèi)膜沉積下來(lái)的TC、TG、LDL-C等物質(zhì)運(yùn)送到肝臟進(jìn)行分解排出,這種趨勢(shì)也與TC、TG、LDL-C的含量變化保持一致,AH組有顯著提升HDL-C的功效。

以上結(jié)果表明黑木耳粉能夠緩解肥胖小鼠的高脂血癥,具有降血糖、降血脂和調(diào)節(jié)脂肪代謝紊亂等功效。

2.4 小鼠肝臟指標(biāo)的檢測(cè)

小鼠肝臟中膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的含量(圖4)。

圖4 不同組小鼠肝臟4項(xiàng)指標(biāo)的含量

A：膽固醇;B：甘油三酯;C：低密度脂蛋白膽固醇;D：高密度脂蛋白膽固醇

Fig. 4 Content of four indexes in liver of different treatment group of mice.

A: TC; B: TG; C: LDL-C; D: HDL-C.

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HFD組小鼠肝臟TC含量明顯高于CK組,有顯著差異(P<0.05),TG、LDL-C含量明顯高于CK組,HDL-C明顯低于CK組,均有極顯著差異(P<0.01) (圖4),表明營(yíng)養(yǎng)型肥胖會(huì)使肝臟TC、TG和LDL-C含量上升,使肝臟內(nèi)HDL-C含量下降。與HFD組相比,AH組對(duì)于TC、TG和LDL-C含量變化無(wú)明顯效果(P>0.05);但AH組能夠顯著提高肝臟HDL-C含量,與HFD組之間有極顯著差異(P<0.01)。

以上結(jié)果表明黑木耳粉對(duì)預(yù)防肥胖小鼠脂肪代謝紊亂有一定的功效。

2.5 黑木耳粉處理對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞和脂肪細(xì)胞形態(tài)的影響

正常的人體或小鼠體內(nèi)能量的攝入和輸出通常保持動(dòng)態(tài)平衡,不會(huì)在肝臟內(nèi)產(chǎn)生積累。而當(dāng)體內(nèi)攝入富含脂肪的食物過(guò)多時(shí),會(huì)導(dǎo)致甘油三酯不能被完全轉(zhuǎn)出,在肝臟細(xì)胞內(nèi)形成積累,出現(xiàn)脂肪空洞甚至脂肪肝。

對(duì)各組小鼠的肝臟切片進(jìn)行染色后,正常組小鼠肝臟細(xì)胞大小基本一致,細(xì)胞核清晰可見(jiàn);高脂模型組小鼠肝臟出現(xiàn)脂肪變性且有大量脂滴積累,細(xì)胞核模糊,具體表現(xiàn)為細(xì)胞明顯增大且肝臟組織中有大小不一的脂肪空泡,表明高脂飲食使小鼠肝臟中積累大量脂肪,破壞了小鼠肝臟內(nèi)正常的脂質(zhì)代謝。AH組中,可見(jiàn)小鼠脂肪細(xì)胞變小,脂滴減小,細(xì)胞核漸漸清晰,AH組的脂肪細(xì)胞與CK組相近,AH組的小鼠能夠抑制脂肪肝形成(圖5);表明AH組抑制脂肪肝和肝臟脂肪積累方面也有明顯的效果。

圖5 黑木耳粉對(duì)小鼠肝臟組織形態(tài)的影響(400×)

A：正常對(duì)照組;B：模型組;C：陽(yáng)性藥物組;D：黑木耳粉膳食代替組

Fig. 5 Effects of Auricularia heimuer fruiting body powder (AH) on liver tissue morphology of mice (400×).

A: CK group; B: HFD group; C: PD group; D: AH group.

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肥胖的形成分為兩個(gè)方面,一方面是脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加,另一方面是體積的增大(伍家利等 2017)。對(duì)不同組小鼠的附睪脂肪切片觀察,CK組小鼠的細(xì)胞形狀規(guī)則,大小基本一致,細(xì)胞的輪廓清晰;高脂模型組小鼠脂肪細(xì)胞形態(tài)變圓,體積直徑明顯增大,細(xì)胞邊緣模糊,表明高脂飲食使小鼠附睪脂肪體積增大,細(xì)胞排列不規(guī)則。AH組小鼠附睪脂肪細(xì)胞直徑與HFD組相比明顯減小,形狀較規(guī)則(圖6),這表明AH組能夠抑制因營(yíng)養(yǎng)型肥胖而引起的附睪脂肪細(xì)胞增大,減少脂肪的積累。

圖6 黑木耳粉對(duì)小鼠附睪脂肪細(xì)胞形態(tài)的影響(400×)

A：正常對(duì)照組;B：模型組;C：陽(yáng)性藥物組;D：黑木耳粉膳食代替組

Fig. 6 Effects of AH on adipocyte morphology in epididymis of mice (400×).

A: CK group; B: HFD group; C: PD group; D: AH group.

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2.6 黑木耳粉處理對(duì)小鼠腸道菌群的影響

采用α多樣性分析法對(duì)不同處理組的物種多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià),包括Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)。3組之間無(wú)顯著性差異 (表2)。因此,CK組、HFD組與AH組的微生物多樣性并未受到影響。

表2 各組小鼠腸道菌群α多樣性分析

Table 2 The analysis of alpha diversity of intestinal microbial flora in various treatment groups of mice

處理組
Treatment groups Shannon Simpson Chao1 Coverage CK 7.280±0.135 0.979±0.005 1 664.587±238.419 0.995±0.001 HFD 6.902±0.030 0.971±0.007 1 791.672±144.796 0.994±0.001 AH 6.830±0.175 0.971±0.007 2 003.027±209.917 0.992±0.001

從門水平上,3組小鼠的腸道菌群在門水平上的優(yōu)勢(shì)菌群均為厚壁菌門Firmicutes、擬桿菌門Bacteroidetes和變形菌門Proteobacteria。CK組的厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門分別占 46.62%、38.62%和4.60%,HFD組分別占43.48%、33.18%和9.86%,而AH組分別占41.93%、38.66%和7.62% (圖7)。與CK組小鼠相比,高脂模型組小鼠變形菌門相對(duì)豐度顯著提高(P<0.05)。說(shuō)明高脂飲食增加小鼠腸道菌群中變形菌門的相對(duì)豐度,經(jīng)過(guò)AH干預(yù)之后,變形菌門相對(duì)豐度降低(P<0.05)。

圖7 樣品在門水平上的群落結(jié)構(gòu)分布圖

Fig. 7 Distribution of sample microbial community structure at phylum level.

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從屬水平上,CK組的優(yōu)勢(shì)菌屬主要有螺桿菌屬Helicobacter 7.68%、擬桿菌屬Bacteroides 2.02%,HFD組的優(yōu)勢(shì)菌屬主要有螺桿菌屬Helicobacter 9.24%、擬桿菌屬Bacteroides 7.32%和Dubosiella 4.14%,AH組的優(yōu)勢(shì)菌屬主要有艾克曼菌屬Akkermansia 8.59%、Alloprevotella 3.74%和Ruminiclostridium 3.19% (圖8)。經(jīng)過(guò)高脂飲食以及AH干預(yù)后的小鼠腸道菌群發(fā)生了明顯的變化。與CK組相比,HFD組的螺桿菌屬相對(duì)豐度增加(P>0.05),擬桿菌屬相對(duì)豐度極顯著增加(P<0.01);與HFD組相比,AH組的螺桿菌屬與擬桿菌屬相對(duì)豐度極顯著降低(P<0.01)。AH組的艾克曼菌屬相對(duì)豐度極顯著高于CK組與HFD組(P<0.01),艾克曼菌是一種腸道有益菌,具有降脂減肥和緩解腸道炎癥的效果。說(shuō)明喂食黑木耳粉后,高脂飲食導(dǎo)致的小鼠腸道菌群紊亂得到了一定的改善。

圖8 樣品在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)分布圖

Fig. 8 Distribution of sample microbial community structure at genus level.

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通過(guò)LEFSe的方法比較3組間差異細(xì)菌(圖9)。結(jié)果表明,3組腸道菌群差異顯著,并且AH組菌群中的韋榮球菌科Erysipelotrichaceae、韋榮球菌目Erysipelotrichales、韋榮球菌綱Erysipelotrichia、伯克霍爾德氏菌科Burkholderiaceae、γ-變形菌綱Gammaproteobacteria、阿克曼菌科Akkermansiaceae、疣微菌目Verrucomicrobiales和疣微菌綱Verrucomicrobia相對(duì)豐度顯著高于其他組。

圖9 各組小鼠腸道菌群特異性生物標(biāo)志物

Fig. 9 Specific biomarkers of intestinal microbial flora in various treatment groups of mice.

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3 結(jié)論與討論

黑木耳作為藥食同源的食用菌,含有多種活性成分,具有抗腫瘤、降血脂等藥理功效(Derrien et al. 2017)。本研究通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)探索黑木耳粉代替部分膳食預(yù)防肥胖的作用,以小鼠體重、Lee’s指數(shù)、血脂指標(biāo)、肝臟指標(biāo)、肝臟細(xì)胞和附睪脂肪細(xì)胞為指標(biāo),主要結(jié)論如下：

AH組小鼠體重與Lee’s指數(shù)較HFD組相比明顯降低,說(shuō)明黑木耳粉對(duì)于在小鼠體型控制方面效果較好,有降低小鼠體重的效果。解剖小鼠后發(fā)現(xiàn)AH組小鼠附睪脂肪指數(shù)和肝臟指數(shù)都有明顯的降低,而皮下脂肪指數(shù)、腎臟指數(shù)和脾臟指數(shù)無(wú)明顯變化,說(shuō)明黑木耳粉對(duì)腎臟、脾臟不會(huì)產(chǎn)生不良影響。對(duì)小鼠的血清和肝臟指標(biāo)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：AH組能夠降低肥胖小鼠血清內(nèi)的GLU、TG的含量,提高血清HDL-C的含量,其余項(xiàng)目無(wú)明顯變化;AH組肝臟內(nèi)的HDL-C有提高,其余項(xiàng)目無(wú)明顯變化。對(duì)肝臟細(xì)胞和附睪脂肪細(xì)胞染色觀察發(fā)現(xiàn),AH組能夠抑制小鼠脂肪肝形成,控制附睪脂肪細(xì)胞增大,減少脂肪的積累。這一結(jié)果與張廷婷等(2021)的黑木耳多糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比,黑木耳粉降低血清TC、LDL-C效果沒(méi)有黑木耳多糖明顯,其他項(xiàng)目均與黑木耳多糖表現(xiàn)出相同的效果?？赡艿脑蚴?一方面,與不同的黑木耳品種有關(guān)(李振等 2021);另一方面,與實(shí)驗(yàn)時(shí)添加的黑木耳粉用量偏低有關(guān),進(jìn)一步提高黑木耳粉用量可能會(huì)明顯提高抗肥胖的效果,需要進(jìn)一步深入研究。本研究發(fā)現(xiàn),高脂飲食會(huì)導(dǎo)致小鼠腸道菌群豐度發(fā)生改變,與彭買姣等(2019)的研究結(jié)果一致。經(jīng)黑木耳粉干預(yù)后,擬桿菌門相對(duì)豐度增加,變形菌門相對(duì)豐度降低,螺桿菌屬與擬桿菌屬相對(duì)豐度降低,艾克曼菌屬的相對(duì)豐富增加,表明黑木耳粉的攝入一定程度上促進(jìn)了有益微生物的生長(zhǎng),可能對(duì)肥胖的預(yù)防效果起到積極的作用。后續(xù)將進(jìn)一步深入研究艾克曼菌在黑木耳粉調(diào)控血脂中的藥理作用機(jī)制。

綜上所述,黑木耳對(duì)于肥胖有一定的預(yù)防作用,本研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用黑木耳提供參考。

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