導讀   細菌發(fā)酵劑在乳制品的發(fā)酵過程中起著至關(guān)重要的作用，然而，關(guān)于不同發(fā)酵速率的乳酸乳球菌乳亞種之間代謝差異的認識十分有限。本研究通過超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用法分析了17個乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcus lactis subsp. lactis)菌株的發(fā)酵能力和代謝概況。代謝組學結(jié)果顯示，快速組(發(fā)酵時間<16h)和慢速組(發(fā)酵時間≥16h)之間的代謝物存在顯著差異。在快速組中，分別有98種代謝物增加、55種代謝物減少?？焖俳M富含肽類和脂類，并且肽類、酯類和三丁酸甘油酯可以作為生物標志物來區(qū)分組別。本研究結(jié)果表明，三丁酸甘油酯在調(diào)節(jié)菌種生長方面發(fā)揮著作用。這項研究從代謝方面對乳酸乳球菌乳亞種菌株之間不同產(chǎn)酸率的原因提供了一個新的見解。    

論文ID

原名：Metabolomics analysis reveals differences in milk metabolism and fermentation rate between individual Lactococcus lactis subsp. lactis strains

譯名：代謝組學分析揭示牛奶發(fā)酵過程中的代謝差異和單個乳酸乳球菌乳亞種菌株間的發(fā)酵速率差異

期刊：Food Research International

IF：7.425

發(fā)表時間：2022.9.14

通訊作者：孫志宏

通訊作者單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室

DOI號：10.1016/j.foodres.2022.111920

實驗設計

將全脂奶粉(11.5%)懸浮在蒸餾水(82%)中，溶解后加入蔗糖，經(jīng)過均質(zhì)、巴氏滅菌、冷卻之后將牛奶分裝到無菌燒杯中。將測試的17株乳酸乳球菌乳亞種(活細胞數(shù)為5×106CFU/mL)接種到牛奶中，在37℃下培養(yǎng)至pH值達到4.60，然后停止發(fā)酵(每個樣品有三個重復)。在接種后和發(fā)酵后使用M17瓊脂平板澆注法立即測定發(fā)酵乳中的活菌數(shù)，以確?；罴毎麛?shù)達到5×106 CFU/mL。發(fā)酵的牛奶被分裝并儲存在-80℃環(huán)境中。使用時將樣品解凍、離心之后取上清液加入乙腈，靜置離心之后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮9 h，再加乙腈溶液，用0.22-μm的微孔膜進行過濾，將濾液收集在樣品瓶中。同時，每6個樣品采集一次質(zhì)控樣品。預處理后的酸奶樣品通過UPLC-Q-TOF MSE進行分析，并采用反向UPLC系統(tǒng)在液相中進行梯度洗脫。使用MassLynx4.1工作站采集UPLC-Q-TOF MSE獲得的原始數(shù)據(jù)，并使用Progenesis QI進行處理，獲得所有代謝物的定量數(shù)據(jù)。通過監(jiān)督偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，篩選出差異代謝物。根據(jù)差異代謝物的質(zhì)荷比、保留時間和片段信息，檢索Chemspider、人類代謝組數(shù)據(jù)庫(HMDB)、METLIN、KEGG數(shù)據(jù)庫，獲得參考代謝物并完成鑒定。

圖1 實驗設計圖。

前言

發(fā)酵乳是一種由發(fā)酵劑生產(chǎn)的營養(yǎng)豐富、對健康有益的功能性乳制品。發(fā)酵乳富含蛋白質(zhì)、鈣、鉀、各種維生素和對身體有益的代謝物，如生物活性肽和胞外多糖，其中一些可以改善炎癥并調(diào)節(jié)宿主代謝。然而，發(fā)酵乳發(fā)酵后的酸化會使產(chǎn)品質(zhì)量惡化，使得發(fā)酵乳的儲存期縮短。傳統(tǒng)發(fā)酵劑通常是Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricu和Streptococcus thermophilus，它們在乳制品發(fā)酵過程中產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物，如乳酸、肽、游離氨基酸和脂肪酸等。乳酸乳球菌乳亞種也是商業(yè)上使用的發(fā)酵劑，具有發(fā)酵乳糖的能力和蛋白質(zhì)分解活性，并產(chǎn)生胞外多糖。它對發(fā)酵乳制品最終的香氣、質(zhì)地和酸度有著舉足輕重的貢獻，并且乳酸乳球菌乳亞種具有更好的益生效果。為了改善發(fā)酵乳的風味、質(zhì)量和安全性，必須探索發(fā)酵乳的代謝情況。盡管許多研究已經(jīng)調(diào)查了發(fā)酵乳的代謝特征，但有關(guān)單個乳酸乳球菌乳亞種的發(fā)酵速率和代謝特征之間關(guān)系的知識是有限的。因此，本實驗研究了在不同發(fā)酵速率下發(fā)酵牛奶的代謝特征，以揭示其與菌株代謝和生理學的關(guān)系。 超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜高能分析法(UPLC-Q-TOF MSE)是代謝分析中常用的分析平臺。該平臺具有高質(zhì)量、高精度、高分辨的特點，可以準確地對代謝物進行定量和定性分析，因此成為非靶向代謝物測定的首選。為了深入探討不同乳酸乳球菌乳亞種生產(chǎn)的發(fā)酵乳的發(fā)酵特性，本研究對17種不同的發(fā)酵乳進行了代謝組學研究。通過使用UPLC-Q-TOF MSE對發(fā)酵乳中的代謝物進行鑒定，發(fā)現(xiàn)各個乳酸乳球菌乳亞種菌株的代謝特征(即發(fā)酵速率)隨其固有的代謝能力而變化。這項研究為一種常用發(fā)酵劑產(chǎn)酸率的控制因素提供了新的認識，并為篩選潛在的工業(yè)菌株提供了方法。

結(jié)果

1 單個乳酸乳球菌乳亞種菌株發(fā)酵時間的差異

為了確定發(fā)酵乳中的活菌數(shù)，在接種和發(fā)酵后分別記錄發(fā)酵乳的菌落總數(shù)，并監(jiān)測每個發(fā)酵乳整個發(fā)酵過程的時間(表1)。結(jié)果顯示，發(fā)酵乳中乳酸乳球菌乳亞種的初始濃度為106 CFU/mL，當發(fā)酵達到終點時(pH=4.6)，濃度達到109 CFU/mL。以往研究表明，這17個乳酸乳球菌乳亞種可以產(chǎn)酸，所以在發(fā)酵過程中，隨著菌株的生長pH值逐漸下降，這意味著每個菌株的發(fā)酵要求與其產(chǎn)酸能力有關(guān)。然后根據(jù)發(fā)酵時間將發(fā)酵乳分為兩組：快速組(發(fā)酵時間<16h)和慢速組(發(fā)酵時間≥16h)，隨后的分析都是基于這種分組進行的。

表1 單一菌種的發(fā)酵特性信息(即發(fā)酵過程中細菌密度的變化和牛奶發(fā)酵所需的時間)。

2 PLS-DA和差異代謝物分析

用UPLC-Q-TOF MSE平臺來比較不同的乳酸乳球菌乳亞種發(fā)酵乳的代謝譜。為了比較發(fā)酵乳的代謝水平差異，采用PLS-DA對發(fā)酵乳中的代謝物進行監(jiān)督分析(圖2A)，并用R2Y(適配性)和Q2(預測性參數(shù))來驗證PLS-DA模型的準確性和預測性(圖2B)。R2Y和Q2都大于0.7，表明PLS-DA模型具有良好的準確性和可預測性。此外，每個平行樣本都有聚類，在快速組和慢速組之間觀察到明顯的分離趨勢。PLS-DA分析中的質(zhì)控樣品也被聚在一起，反映了儀器良好的穩(wěn)定性和可重復性。因此，在發(fā)酵結(jié)束時，快速組和慢速組發(fā)酵乳樣品的代謝特征具有明顯的差異。計算兩組代謝物的P值和差異倍數(shù)值，并以P＜0.05、差異倍數(shù)＞2和P＜0.05、差異倍數(shù)＜0.5為閾值繪制火山圖(圖2C)，以此確定兩組的差異代謝物。離原點越遠，這個變量的貢獻越大，而差異越大越有可能是一個潛在的標志物。最終，初步確定了153個差異代謝物。在快速組中，分別確定了98個增加(紅點)和55個減少(綠點)的代謝物(表S2)。

圖2 發(fā)酵結(jié)束時快速發(fā)酵組和慢速發(fā)酵組之間的代謝組學差異。

(A)用偏最小二乘判別分析法(PLS-DA)分析發(fā)酵結(jié)束時快速和慢速發(fā)酵組之間的代謝物數(shù)據(jù)。(B)PLS-DA模型的驗證指標，R2Y和Q2。(C)火山圖說明了發(fā)酵后快速和慢速發(fā)酵組的代謝物。(原文圖1) 

3 差異代謝物功能通路分析

功能通路分析可以將代謝物的變化與特定的代謝途徑聯(lián)系起來。圓圈的顏色代表富集的程度，顯著性從紅色(最顯著)到黃色(最不顯著)進行收縮。橫軸代表影響值富集因子，縱軸代表P值的大小。在本研究中，功能通路分析顯示，153個代謝物主要富集在7個代謝途徑中(圖3)，即脂肪酸生物合成、脂肪酸降解、苯丙氨酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，肌醇磷酸酯代謝、二甲苯降解，以及氨酰-tRNA生物合成途徑。雖然在苯丙氨酸代謝途徑中只涉及一種差異代謝物，但兩組之間存在顯著差異(P=0.03)。

圖3 快速發(fā)酵組和慢速發(fā)酵組之間差異代謝物的富集途徑。

圓圈的大小表示有多少代謝物被富集，圓圈越大，富集的代謝物就越多。圓圈的顏色代表富集的顯著性，紅色越深，該途徑的富集越顯著，橫軸代表富集因子，縱軸代表P值的大小。(關(guān)于本圖例中對顏色的解釋，請參考本文的網(wǎng)絡版)。(原文圖2) 

4 差異代謝物的鑒定和分析

為了鑒定差異代謝物，利用MSE數(shù)據(jù)采集方法獲得母離子和相應的片段信息。根據(jù)保留時間和質(zhì)荷比，通過Progenesis QI軟件篩選，共鑒定出37種代謝物，包括6種酯類、26種肽類、1種酰胺類和4種其他代謝物。分析各發(fā)酵乳中差異代謝物的含量發(fā)現(xiàn)，快速組脂類和肽類的含量高于慢速組(圖4A)。為了全面研究單株乳酸乳球菌乳亞種發(fā)酵乳代謝物的變化，以及不同樣品之間的關(guān)系和代謝物數(shù)量的差異，對代謝譜進行了比較分析，并構(gòu)建熱圖來比較和識別不同發(fā)酵乳中差異代謝物的分布(圖4B)。在快速組和慢速組之間確定的差異代謝物的豐度是明顯不同的。肽類和酯類是快速組和慢速組之間的主要差異代謝物。快速發(fā)酵組的牛奶含有許多肽，如ser-trp、phe-ile、asp-arg-his、leu-phe-leu和ile-ile-phe-tyr，以及各種酯，如棕櫚酸乙酯、乳酸乙酯和三丁酸甘油酯。這些酯類使發(fā)酵乳具有獨特的風味，并提高最終產(chǎn)品的質(zhì)量?？焖俳M的四肽含量高于慢速組(圖4C)。分析不同代謝途徑的代謝物的豐度發(fā)現(xiàn)，快速組含有較高的苯丙氨酸和色氨酸。在快速組出現(xiàn)的肽中，重要的氨基酸是脯氨酸、精氨酸和苯丙氨酸(圖4D)，苯丙氨酸也是快速組和慢速組差異代謝物富集途徑中的主要物質(zhì)。

圖4 快速組和慢速組單一菌株發(fā)酵乳中差異代謝物的富集圖。

(A)不同的乳酸乳球菌乳亞種單一菌株發(fā)酵乳中鑒別出的差異代謝物的分布。(B)氨基酸出現(xiàn)的頻率。(C)瀑布圖顯示肽類代謝物的比例。(原文圖3)

5 發(fā)酵時間和差異代謝物的網(wǎng)絡圖分析

發(fā)酵乳發(fā)酵速率的不同是由許多因素造成的，如菌株的產(chǎn)酸能力和接種劑量。因此，在本研究中通過控制接種劑量研究了發(fā)酵乳中的差異代謝物。在差異代謝物之間觀察到強烈的相關(guān)性(R>0.68，R<-0.68；P<0.05)，表明發(fā)酵乳的代謝物可以相互影響。大多數(shù)強相關(guān)關(guān)系是在多肽之間觀察到的，一些多肽也與三丁酸甘油酯表現(xiàn)出強相關(guān)關(guān)系(圖5)。三丁酸甘油酯、thr-arg-gly-his、asp-thr-thr-lys和leu-val-leu與發(fā)酵時間明顯負相關(guān)(P<0.001，R=-0.8192；P<0.001，R=-0.7097；P<0.001，R=-0.6900；P<0.001，R=-0.6827；表S3)。而大多數(shù)肽類和酯類在快速組中富集，這進一步表明，酯類和肽類可能調(diào)節(jié)發(fā)酵時間。因此，不同代謝物的變化改變了不同發(fā)酵劑的發(fā)酵環(huán)境，直接或間接地影響發(fā)酵時間。

圖5 網(wǎng)絡圖顯示了發(fā)酵時間和差異代謝物之間的Spearman相關(guān)性。

圓圈的大小表示豐度的大小，圓圈越大，豐度越大。紅色代表發(fā)酵時間，黃色代表三丁酸甘油酯，橙色代表二肽，紫色代表三肽，綠色代表四肽。發(fā)酵時間和差異代謝物之間的重要關(guān)聯(lián)由弧形線連接，線的顏色表示相關(guān)的強度，與顏色方案保持一致。顏色代表1和-1之間的Spearman相關(guān)系數(shù)數(shù)值大于0表示正相關(guān)，反之亦然。(原文圖4)。

6 代謝物的多變量接受者操作特性(ROC)分析

ROC曲線是評估一個或多個生物標志物預測性能的圖形工具，表示一個生物標志物區(qū)分兩組的能力。使用隨機森林算法來計算影響率，繪制該物質(zhì)和曲線下面積(AUC)的折線圖(圖6A)。AUC值越接近于1，預測結(jié)果越好。在本研究中，83個代謝物的AUC有很高的影響率，超過1.00，排在84名的代謝物的影響因子為0.968(圖6B，表S4)。根據(jù)差異倍數(shù)和P值，將機器篩選的前83個代謝物與聯(lián)合篩選的代謝物進行比較。在兩組結(jié)果之間的重疊部分出現(xiàn)了14種差異代謝物(圖6C，表S5)，標紅的是那些根據(jù)P值和差異倍數(shù)值篩選的差異代謝物與用機器篩選的代謝物的重疊部分。所鑒定的差異代謝物具有良好的代表性，這可能為在快速組和慢速組之間快速分類菌株提供了一種新的方法。這14種代謝物包括11種肽類和3種酯類，進一步表明肽類和酯類的含量與發(fā)酵速率有關(guān)。

圖6 代謝物的接受者操作特性(ROC)分布在快速組和慢速組之間存在顯著差異。

(A)代謝物數(shù)量和相應的ROC圖。(B)ROC曲線。(C)機器模型篩選出的差異代謝物，紅色字體表示與P值和差異倍數(shù)值篩選出的差異代謝物重疊的代謝物。(原文圖5)。

討論

乳酸乳球菌乳亞種是一種工業(yè)發(fā)酵劑，被美國FDA認為是“GRAS”(一般是安全的)。這種發(fā)酵劑發(fā)酵性能良好，并為發(fā)酵產(chǎn)品提供風味。不同的乳酸乳球菌乳亞種菌株具有獨特的特征。以往的一項研究分析了227個乳酸乳球菌乳亞種菌株的表型和功能基因，發(fā)現(xiàn)各菌株之間的發(fā)酵特性(如發(fā)酵時間、粘度和游離氨基酸氮)存在明顯差異，這種差異引起了碳水化合物利用和乳酸生產(chǎn)基因的強烈品系特異性選擇。為了進一步探討不同的乳酸乳球菌乳亞種在發(fā)酵乳中的代謝差異，從227個菌株中選出17個菌株，用于牛奶發(fā)酵，并進一步研究它們所需的發(fā)酵時間和代謝情況。 

在這項研究中，采用UPLC-Q-TOF MSE研究乳酸乳球菌乳亞種在不同發(fā)酵速率下發(fā)酵乳的代謝特征?？焖俳M富含各種酯類和肽類，尤其是三丁酸甘油酯，它可能是一個潛在的發(fā)酵速率的生物標志物。酯類有助于為發(fā)酵牛奶提供風味，酸奶的醇類可以與游離氨基酸結(jié)合形成酯類。在本研究中，酯類如丁酸戊酯和棕櫚酸乙酯在快速組中被富集。因此，快速組發(fā)酵的牛奶的味道可能比慢速組的要好。 在發(fā)酵過程中，LAB將牛奶蛋白水解為肽、氨基酸和其他代謝產(chǎn)物，不同菌株的發(fā)酵特性在一定程度上有所不同，導致了發(fā)酵乳中肽譜的差異。共鑒定出26種差異豐富肽，大多數(shù)肽的含量在快速組中高于慢速組，只有兩種差異性肽在慢速組中富集。快速產(chǎn)酸菌株能有效地產(chǎn)生乳酸，使牛奶酸化，從而提高蛋白酶等酶的活性，并迅速將蛋白質(zhì)降解為短肽。

盡管本研究沒有評估這些肽在發(fā)酵乳中的功能，但發(fā)酵乳中的肽已被證明表現(xiàn)出許多有益作用。因此，益生菌驅(qū)動肽的產(chǎn)生可以被認為是促進發(fā)酵乳營養(yǎng)價值的關(guān)鍵過程。LAB不能同化氮源，它們在牛奶中的生長依賴于其蛋白質(zhì)分解系統(tǒng)降解蛋白質(zhì)和肽的能力，以滿足氨基酸的需求。通過研究乳酸菌對肽和氨基酸的消耗，發(fā)現(xiàn)乳酸菌的生長依賴于低聚肽，LAB生長的98%的氮源由低聚肽組成，但二肽和三肽運輸系統(tǒng)在使用各種氮源中的作用仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)L. gasseri在牛奶中的生長需要肽來提供氮源，而不是蛋白質(zhì)或游離氨基酸，因此，相對較小的肽可能是L. gasseri乳糖培養(yǎng)基中更合適的氮源。乳清肽提取物(1%，w/v)可以刺激Lactobacillus acidophilus和Bifidobacterium animalis的增殖。通過對227株乳酸菌的全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，pepO、pepF、oppC和oppD基因與菌株發(fā)酵速率顯著相關(guān)。

這些研究表明，牛奶肽代謝物譜可能影響乳酸乳球菌乳亞種菌株的生長，從而控制發(fā)酵時間。 脂肪分解是指通過脂肪酶和酯酶降解脂肪，這對發(fā)酵食品的成熟和風味產(chǎn)生至關(guān)重要。以前的研究未能確定在碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪/酯混合環(huán)境中生長的菌株首先利用的確切能量來源，但一項研究發(fā)現(xiàn)，一些基因(特別是直接參與核糖分解代謝磷酸轉(zhuǎn)酮酶途徑以及丙酮酸替代途徑的基因的轉(zhuǎn)錄)在額外的碳水化合物或其他代謝物的存在下會減少，這些基因的過量表達可能會影響菌株的生長。有研究報道了L. sakei La22在含三丁酸甘油酯和橄欖油的培養(yǎng)基中生長相關(guān)基因的表達，發(fā)現(xiàn)在三丁酸甘油酯和橄欖油同時存在的情況下，各種應激反應基因的表達均發(fā)生了改變，而當該菌株在只有三丁酸甘油酯存在的情況下生長時，有更多參與脂質(zhì)代謝的基因過度表達。在本研究中，三丁酸甘油酯在快速組中富集，在慢速組中幾乎沒有。

因此，存在于發(fā)酵乳中的肽和三丁酸甘油酯代謝物使乳酸乳球菌乳亞種菌株暴露在不同的環(huán)境中，影響相關(guān)基因的表達，從而影響單個菌株的生長和發(fā)酵時間。在后續(xù)研究中，蛋白質(zhì)組學和轉(zhuǎn)錄組學可用于探索不同環(huán)境下菌株的生物學功能，這有助于篩選出有工業(yè)價值的潛在發(fā)酵菌株。

結(jié)論

綜上所述，由于各個乳酸乳球菌乳亞種的發(fā)酵能力不同，觀察到明顯的代謝組學差異。快速組富含各種肽類和酯類，這些代謝物含量的差異影響著發(fā)酵乳的風味、質(zhì)量和益生特性，并且可能是控制發(fā)酵速率的一個重要因素。此外，三丁酸甘油酯可以調(diào)節(jié)乳酸乳球菌乳亞種的生長。本研究的結(jié)果可作為評估乳酸乳球菌乳亞種作為發(fā)酵菌株潛力的參考信息。

編譯：九卿臣，編輯：微科盟居居、江舜堯。

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