摘 要：研究 12 種植物精油的主要成分及其對 3 種常見雞源致病菌( 雞大腸桿菌、雞白痢沙門菌及雞金黃色葡萄球菌) 的抑制作用，采用微量二倍稀釋法測定各精油對 3 種致病菌的最小抑菌濃度( MIC) ，在質(zhì)量濃度0. 391 ～ 25. 000 mg /mL 內(nèi)，各精油對各致病菌均表現(xiàn)出抑制活性，且百里香酚和香芹酚復配后的協(xié)同作用明顯，為進一步對植物精油的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。
關鍵詞：植物精油; 最小抑菌濃度; 致病菌; 復配; 協(xié)同作用
作者：魏磊，李曉，王偉，王學方，郭唯，董建軍

幼仔飼養(yǎng)已成為現(xiàn)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)中最重要最關鍵的環(huán)節(jié)之一。幼仔的發(fā)病率及病死率很高，是由于其消化系統(tǒng)發(fā)育不健全，免疫力低下，加之各種應激反應所致?？股睾突瘜W合成抗菌藥物的廣泛應用明顯改善了這種局面，但近年來引起畜禽產(chǎn)品的藥物殘留和耐藥菌株產(chǎn)生的問題越來越為社會所關注，因此在當前飼料添加劑行業(yè)中，尋找和研究優(yōu)質(zhì)、安全、高效及穩(wěn)定的抗生素替代品迫在眉睫［1 － 2］。近年來新型抗菌殺菌添加劑的研究越來越多，尤其是以天然植物提取物( 毒副作用低、無有害藥殘及不易產(chǎn)生抗藥性等特點) 作為飼料添加劑備受重視。

研究表明，植物精油生物活性廣泛，具有抗菌消炎、抗腫瘤、抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛、祛痰止咳和改善胃腸功能等功效［3］。我國植物精油資源豐富，是一種很有開發(fā)潛力及應用前景的飼料添加劑，因此進行深入研究，開發(fā)獸用植物新產(chǎn)品具有較大的應用價值，且前景廣闊。

研究對市售的 12 種植物精油，包括羅勒油、大蒜油、山蒼籽油、藍桉油、安息香油、檸檬草油、丁香油、百里香油、牛至油、肉桂醛、香芹酚和百里香酚進行主要成分檢測和體外抑菌作用測試，并對它們間的相互作用進行研究，為畜禽用天然植物源殺菌劑的開發(fā)與應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法
1.1 試驗材料與儀器
1.1.1 試驗材料
12 種市售植物精油: 羅勒油、大蒜油、山蒼籽油、藍桉油、安息香油、檸檬草油、丁香油、百里香油、牛至油、肉桂醛、香芹酚和百里香酚; 3 種常見臨床致病菌:雞大腸桿菌 CVCC 1555、雞白痢沙門菌 CVCC 1887和雞金黃色葡萄球菌 CVCC 548，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所; 肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂等均為國產(chǎn); GC －MS 用甲醇為色譜純試劑。
1.1.2 試驗儀器
ME－204 電 子 天 平，無錫一凈超凈工作臺，SYQ－DSX－280B 手提式壓力蒸汽滅菌鍋，Galaxy170S 生化培養(yǎng)箱等，GC－MS－QP2010Ultra氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀。
1.2 試驗方法
1.2.1 12種植物精油 GC－MS 分析
色譜 柱 為 Ｒtx － 5Sil MS 彈性石英毛細管柱( 30. 00 m × 0. 25 mm，0. 25 μm) ; 升溫程序，起始為 60 ℃，以 10 ℃ /min 升至 150 ℃，再以 6 ℃ /min升至 250 ℃，保留 10 min，進樣口溫度為 250 ℃ ;進樣量 1. 0 μL，不分流; 載氣為高純度氦氣，柱內(nèi)載氣流量為 1. 0 mL /min; 質(zhì)譜用 EI 電離源，接口溫度為280 ℃，電子能量 70 eV，離子源溫度 230 ℃;掃描質(zhì)量 35 ～ 600 aum; 倍增器電壓 2 kV; 質(zhì)譜檢索標準庫為 NIST11s. LIB 庫。
1.2.2 藥液制備
將乙醇 － 水( 1∶1) 作溶劑將上述 12 種植物精油配置成質(zhì)量濃度為 200 mg /mL 的母液。
1.2.3 菌株復蘇及菌懸液的制備
將上述 3 種供試菌種進行斜面復蘇，復蘇后接種于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 12 ～ 24 h。直接從平板上挑取已純化的單個菌落，混懸于制備好的液體培養(yǎng)基中，制成濃度為 100 萬 ～ 1 億 CFU/mL 的菌懸液，備用。
1.2.4 單體植物精油最小抑菌濃度( MIC) 的測定
用微量二倍稀釋法測定 12 種植物精油的 MIC。首先用 0. 22 μm 濾膜過濾 1. 2. 1 項的藥液母液，作為樣品原液。用制備好的液體培養(yǎng)基依次倍比稀釋，稀 釋 9 個 質(zhì) 量 濃 度，即質(zhì)量濃度依次為100. 000、 50. 000、 25. 000、 12. 500、 6. 250、 3. 125、1. 563、0. 781 和 0. 391 mg /mL。將稀釋成不同質(zhì)量濃度的藥液依次加入微量MIC 測定板中，每孔 0. 1 mL; 分別加入已稀釋好的各種菌液，每孔 0. 1 mL。每種分別設置陽性對照( 加入 0. 1 mL 菌液和 0. 1 mL 液體培養(yǎng)基) 和陰性對照( 只加液體培養(yǎng)基) 。制備好的微量 MIC 測定板于 37 ℃恒溫箱中培養(yǎng) 24 h 觀察結果，完全沒有細菌生長時的最低濃度即為 MIC。
1.2.5 復配植物精油間協(xié)同作用的測定
根據(jù)單體植物精油 MIC 值，將肉桂醛、香芹酚和百里香酚按一定配比混合，配比和濃度見表 1。
用微量二倍稀釋法測定復配藥液對 3 種致病菌的MIC，再根據(jù)公式 1 計算 2 復配成分的部分抑菌濃度( FIC) 以判定它們間的相互作用。當 FIC≤0. 5 時 2 成分表現(xiàn)為協(xié)同，0. 5 ＜ FIC≤1 時為疊加，1 ＜FIC ＜ 2 時為不相關，F(xiàn)IC≥2 時為頡頏。

2 結果與分析
2.1 12 種植物精油主要成分分析結果
將 12 種植物精油分別溶于色譜甲醇中即為進樣樣品，按 “1. 2. 1”項 GC － MS 方法進行檢測分析，主要成分及其百分含量見表 2。

2.2 單一植物精油的 MIC 測定結果
12 種植物精油對 3 種致病菌的 MIC 測定結果見表 3。結果表明，在質(zhì)量濃度 0. 391 ～ 25. 000 mg /mL內(nèi)，除大蒜油和安息香油外，各植物精油對各致病菌均表現(xiàn)出抑制活性。對于雞大腸桿菌，各精油抑制作用的強弱為牛至油 ＞ 香芹酚 = 肉桂醛 ＞ 丁香油 ＞百里香酚 =百里香油 ＞ 羅勒油 = 山蒼籽油 = 藍桉油 =檸檬草油; 對于雞白痢沙門菌，各精油抑制作用的強弱為牛至油 = 香芹酚 = 肉桂醛 ＞ 百里香酚 = 丁香油 ＞ 百里香油 ＞ 羅勒油 = 山蒼籽油 = 藍桉油 = 檸檬草油; 對于雞金黃色葡萄球菌，各精油抑制作用的強弱為牛至油 = 香芹酚 = 肉桂醛 ＞ 丁香油 ＞ 百里香酚 = 百里香油 ＞ 羅勒油 = 山蒼籽油 = 藍桉油 = 檸檬草油; 因此，牛至油、香芹酚、百里香酚和肉桂醛具有較好的廣譜殺菌活性。從主要成分看，它們主要成 分 分 別 為 76. 8% 香 芹 酚、83. 4% 香 芹 酚、95. 0% 百里香酚和 95. 2% 肉桂醛，因此選擇香芹酚、百里香酚和肉桂醛 3 種精油進行復配研究。

2.3 復配植物精油間協(xié)同作用的測定
根據(jù)單一植物精油的抑菌結果，選擇效果較好的香芹酚、百里香酚和肉桂醛進行復配，對 3 種致病菌的 MIC 測定結果和 FIC 計算結果見表 4。根據(jù)FIC 判定兩復配精油間的相互作用: 對于雞大腸桿菌，各復配組合表現(xiàn)出協(xié)同或疊加作用，其中百里香酚和香芹酚濃度比為 1 ∶ 1 復配時協(xié)同作用最強( FIC = 0. 28) ; 對于雞白痢沙門菌、香芹酚和肉桂醛復配表現(xiàn)為不相關作用，百里香酚和香芹酚濃度比為 2∶1 復配時協(xié)同作用最強( FIC = 0. 41) ; 對于雞金黃色葡萄球菌，只有百里香酚和香芹酚濃度比為2∶1 復配時表現(xiàn)為協(xié)同作用( FIC = 0. 37) ，其余復配組合均表現(xiàn)為疊加或不相關作用。綜上所述，百里香酚和香芹酚復配對抑制 3 種致病菌可產(chǎn)生增效。

3 結論
我國植物精油資源豐富，已廣泛應用于醫(yī)藥、食品、保健品和化妝品等行業(yè)，其作為天然高效的抑菌殺菌物質(zhì)對革蘭陰性菌和陽性菌均有較強的殺滅作用，因此，植物精油類產(chǎn)品作為抗生素的潛在替代品成為研究熱點。研究 12 種市售植物精油( 羅勒油、大蒜油、山蒼籽油、藍桉油、安息香油、檸檬草油、丁香油、百里香油、牛至油、肉桂醛、香芹酚和百里香酚) 對 3 種雞源常見致病菌( 大腸桿菌、雞白痢沙門菌和金黃色葡萄球菌) 的抑制作用，在質(zhì)量濃度 0. 391 ～ 25. 000 mg/mL內(nèi)，除大蒜油和安息香油外，各植物精油對各致病菌均表現(xiàn)出抑制活性，這與胡艷芬等( 2010) ［4］; 王 改琴等( 2014) ［5］的試驗結果相一致。
總的來說，牛至油、香芹酚、百里香酚和肉桂醛這 4 種植物精油抗菌效果最為明顯，其主要成分分別為 76. 8% 香芹酚、83. 4% 香芹酚、95. 0% 百里香酚和 95. 2% 肉桂醛。不同植物精油的抗菌活性強弱不同，這與其含有的化學組分密切相關。據(jù)報道，植物精油組分抗微生物活性大小排序如下: 酚 類( 活性最高) ＞ 肉桂醛 ＞ 醇類 ＞ 醛類 = 酮類 ＞ 酯類 ＞碳氫化合物類［6 － 7］，這與試驗結果相符合。
主要活性成分的抗菌機制已有初步研究。香芹酚和百里香酚互為同分異構體，它們改變了細菌表面蛋白的性質(zhì)，增加菌體細胞膜的通透性，從而使細胞質(zhì)中的離子流失及內(nèi)外水分分配失衡致使細菌細胞死亡［8 － 10］。肉桂醛不影響細胞的結構［11］，其 分子中存在一個醛基，與苯環(huán)共軛，具有親核性，易被細菌表面的親水基吸附而穿入細胞壁，破壞細胞壁多糖結構從而產(chǎn)生抑菌或殺菌作用［12］。
對3 種效果明顯的植物精油間的相互作用也進行研究，百里香酚和香芹酚復配后對 3 種致病菌均表現(xiàn)出較強的協(xié)同作用，具備開發(fā)成為一種復配植物源殺菌劑的潛能。

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