外泌體作為細胞間通信的關鍵媒介，近年來已成為生命科學和醫(yī)學研究的熱點。這些納米級的細胞外囊泡攜帶蛋白質、核酸和脂質等生物活性分子，在疾病診斷、治療和預后評估中展現出巨大潛力。

2025年6月23日，北京泓九生命科學研究院聯(lián)合中國科學院生物物理研究所主導制訂了植物源性細胞外囊泡分離純化團體標準，T/CIET 1686-2025植物源性細胞外囊泡（PDEVs）分離純化工藝技術規(guī)范。并助力山西原生肽科技有限公司斬獲國內行業(yè)首個“黃芪外泌體”食品生產許可資質，實現了“黃芪外泌體”相關技術在食品領域應用的合法合規(guī)化落地，更標志著該技術從實驗室邁向產業(yè)化應用的突破，推動了“黃芪外泌體”從科研成果走向市場應用奠定了關鍵基礎。

本文將系統(tǒng)介紹九種主要的外泌體分離純化技術，從經典的超速離心法到新興的微流控技術，揭示各種方法的科學原理、獨特優(yōu)勢與應用局限，為外泌體研究者提供全面的技術參考。

1、差速超速離心法

差速超速離心法基于外泌體與其他細胞成分在尺寸和密度上的差異，通過一系列遞增離心力的超速離心步驟，逐步去除非外泌體成分，最終實現外泌體的沉淀和回收。

該方法首先通過低速離心（300-2000×g）去除細胞和細胞碎片，隨后通過中等速度離心（10000-20000×g）去除大的細胞器和微粒，最后通過超高速離心（100000-200000×g）將外泌體沉淀下來。整個過程通常需要多次重復離心步驟以提高純度。

差速超速離心的主要優(yōu)勢在于能夠處理大體積樣本且無需引入外源試劑，避免了化學污染。該方法已被廣泛應用于各種生物樣本，如細胞培養(yǎng)上清、血清、血漿的外泌體分離。然而，這種方法需要昂貴的超速離心設備，操作復雜耗時，且高離心力可能損傷外泌體結構完整性，影響下游功能分析。

2、密度梯度離心法

密度梯度離心法是在差速離心基礎上進一步發(fā)展的高分辨率分離技術。該方法將超速離心與密度梯度介質相結合，如蔗糖或碘克沙醇，利用外泌體特定密度范圍（1.13-1.21 g/mL）實現精細分離。

具體操作流程包括：首先進行樣品預處理去除大顆粒雜質；然后制備連續(xù)或不連續(xù)密度梯度；將外泌體粗提物緩慢加于梯度頂部；進行長時間超速離心（通?！?6小時）；最后在目標密度區(qū)間收集外泌體富集層，并通過稀釋后再次超速離心去除梯度介質。

密度梯度離心法的突出優(yōu)勢是能夠有效分離外泌體與非囊泡顆粒（如蛋白質聚集體），獲得高純度外泌體制備物。密度梯度的緩沖作用還能減少離心力對外泌體的機械損傷，更好地保持其結構和功能完整性，非常適合功能學研究和內容物分析。

3、超濾離心法

超濾離心法利用截留分子量（MWCO）確定的超濾膜，根據外泌體的大小和分子量實現分離富集。該方法通常采用0.1、0.22和0.45微米系列膜過濾器先去除細胞、碎片和較大微粒，然后使用適當孔徑的超濾膜（通常為10-1000 kD）分離可溶性蛋白質和聚集性蛋白質。

超濾離心法的操作簡單省時，樣本處理量大，且不影響外泌體的生物活性。該方法特別適用于濃縮已通過其他方法分離的外泌體，也可作為主要分離技術使用。一種高級形式是切向流過濾（TFF），通過平行于膜表面的流動減輕膜污染，實現更大規(guī)模的外泌體分離純化。

4、免疫磁珠法

免疫磁珠法基于抗原-抗體特異性結合原理，利用表面固定CD9、CD63、CD81等外泌體特異性抗體的磁珠作為固相載體，從復雜樣本中特異性捕獲并分離外泌體。

該方法操作流程包括：樣品預處理去除大顆粒雜質；抗體與磁珠偶聯(lián)；樣品與偶聯(lián)磁珠孵育使外泌體特異性結合；磁性分離并洗滌去除非特異性結合物；最后通過適當條件，例如低pH緩沖液，來洗脫捕獲的外泌體。

免疫磁珠法的最大優(yōu)勢是能夠分離特定亞型的外泌體，純度極高，非常適合qPCR、Western blot等高靈敏度分析和功能研究。該方法操作相對簡單，不需要昂貴儀器設備，且能保持外泌體形態(tài)完整。作為一種溫和的分離方法，它在分離純化后能很好地保持外泌體功能。

5、PS親和法

PS親和法是一種新興的外泌體分離技術，基于外泌體膜表面暴露的磷脂酰絲氨酸（PS）與特定配體（如Annexin V或Tim4蛋白）之間的高親和力結合實現分離。

該方法將PS結合蛋白與磁珠或其他固相載體結合，利用親和原理特異性捕獲外泌體囊泡外的PS。與免疫磁珠法類似，PS親和法獲得的外泌體形態(tài)完整，純度極高。由于不使用變性劑，不影響外泌體的生物活性，分離的外泌體可直接用于細胞共培養(yǎng)和體內注射研究。

2016年9月《Scientific Reports》發(fā)表的研究表明，PS法可提取相當高純度的外泌體，為該方法提供了科學依據。該方法可以方便地獲得高純度的外泌體和其他來自細胞培養(yǎng)基和體液的細胞外囊泡，通過正常的微濾方法即可獲得高產量。

6、分子尺寸排阻色譜法

分子尺寸排阻色譜法（SEC）是一種基于顆粒尺寸大小而非分子量的分離方法，利用多孔球狀填料形成的色譜柱，使不同尺寸的分子以不同速率流出，實現外泌體的溫和分離。

當樣品流經SEC柱時，較小的蛋白質等雜質進入多孔中被滯留，而粒徑較大的外泌體（30-150 nm）不會進入多孔而較快流出，從而在特定洗脫體積內被收集。外泌體介于大蛋白與更大細胞外囊泡之間，可通過精確控制洗脫條件實現有效分離。

SEC法的最大優(yōu)勢是分離過程溫和無損傷，外泌體結構保持完整，非常適合功能學研究、標志物檢測和內容物分析。操作相對簡便，無需超速離心設備，分離效果較好，能有效去除蛋白污染。研究表明，SEC法的分離效率和純度均優(yōu)于離心法。

7、微流控分離法

微流控分離法是利用微納米級尺寸的管道處理和操控流體的技術，基于免疫親和力、大小和密度等外泌體物理和生物化學性質，實現微尺度分離，還可整合電泳和電磁操作等創(chuàng)新分選機制。

基于免疫親和力的微流控技術通常在微流控裝置底部涂有針對CD9、CD63和CD81等外泌體表面標志物的抗體，特異性捕獲外泌體。此外，還有基于聲學、介電泳等技術根據外泌體大小進行分離的微流控方法。

微流控技術的突出優(yōu)勢是自動化程度高，所需樣本量少，分離速度快，在外泌體生物學功能研究和疾病臨床診斷中具有極大潛力。然而，該方法缺乏標準化和大規(guī)模臨床樣本測試，也缺乏相關的方法驗證而難以大規(guī)模應用。需要專門的昂貴設備，采樣效率低，通道經常堵塞也是實際應用中的挑戰(zhàn)。

8、聚合物沉淀法

聚合物沉淀法利用聚乙二醇（PEG）等聚合物與疏水性蛋白和脂質分子結合共沉淀，通過競爭性結合水分子降低外泌體溶解度，使其在低速離心條件下從生物樣本中沉淀出來。

該方法操作簡單，時間短，通常低于4小時，無需昂貴設備，適用于實驗室常規(guī)分離，適合大體積樣本，如血清、尿液等。目前大多數快速分離外泌體的商品化試劑盒都是基于此方法開發(fā)，如ExoQuick、TEI等。

然而，聚合物沉淀法可能會同時沉淀包括脂蛋白的非囊泡污染物，外泌體純度較低。聚合物材料的混雜可能會影響下游分析，如Western blot和電鏡鑒定。在沉淀前對樣本進行預處理去除細胞碎片，結合尺寸排阻色譜或過濾膜有效去除蛋白聚合物及大分子囊泡，可提高外泌體純度。

9、商品化試劑盒法

商品化外泌體提取試劑盒為研究人員提供了操作簡便、標準化的分離方案。目前市面上的大多數試劑盒基本采用親和法和沉淀法原理，在適當條件下充分孵育后，通過簡單離心即可分離外泌體。

基于聚合物共沉淀的試劑盒，例如ExoQuick、TEI，可用于提取多種體液中的外泌體。通常將聚合物沉淀劑與樣品4℃共孵育30分鐘，然后室溫1500g離心30分鐘，即可獲得外泌體沉淀。與超速離心法比較，試劑盒法更簡便、耗時短，且能獲得更高的外泌體產量。

最后：外泌體分離技術的未來發(fā)展方向

隨著外泌體研究的深入和應用范圍的擴展，外泌體分離技術正朝著更高純度、更高效率、更低成本和更好標準化的方向發(fā)展。多種技術的聯(lián)合應用已成為提高外泌體產量和純度的有效策略，如超濾結合尺寸排阻色譜、聚合物沉淀結合密度梯度離心等。

自動化、微流控和芯片技術的發(fā)展將大大提高外泌體分離的效率和可重復性，為臨床診斷和治療應用奠定基礎。新材料和新原理的引入，如新型親和配體、智能響應材料等，也將為外泌體分離技術帶來新的突破。

北京泓九生命科學研究院正逐步把科研成果從實驗室?guī)虍a業(yè)應用。未來，研究院將繼續(xù)在國際合作、技術創(chuàng)新與成果轉化的道路上深耕前行，為提升人類健康水平、推動生命科學產業(yè)發(fā)展貢獻力量。

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