首頁(yè) 資訊重金屬宮內(nèi)暴露對(duì)胎兒DNMT3B基因甲基化的影響

重金屬宮內(nèi)暴露對(duì)胎兒DNMT3B基因甲基化的影響

來源：泰然健康網(wǎng) 時(shí)間：2024年11月23日 23:41

【摘要】目的分析胎兒宮內(nèi)暴露重金屬與臍帶血中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)基因甲基化的關(guān)系。方法本研究基于在山西開展的病例對(duì)照研究，共納入173例無重大體表出生缺陷胎兒。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)儀檢測(cè)臍帶組織中砷(As)、鉛(Pb)、鎘(Cd)、鎳(Ni)四種重金屬的含量，采用MassARRAY時(shí)間飛行質(zhì)譜陣列基因分析平臺(tái)檢測(cè)臍帶血中DNMT3B的甲基化水平。運(yùn)用多重線性回歸模型分析重金屬暴露對(duì)DNMT3B甲基化的影響。結(jié)果臍帶組織中砷、鉛、鎘、鎳含量中位值及四分位間距分別為7.66 (5.24-10.30) ng/g、23.91 (16.74-44.29) ng/g、0.95 (0.47-2.71) ng/g、21.42 (15.61-32.2) ng/g。臍帶血中DNMT3B基因甲基化水平為(7.38±2.66)%。臍帶組織鎘對(duì)DNMT3B甲基化水平有影響(β=0.74, P=0.03)，鎘與砷、鉛、鎳對(duì)DNMT3B甲基化水平的影響均無交互作用。結(jié)論臍帶組織重金屬暴露會(huì)影響胎兒DNMT3B的甲基化水平。

近年來，由于工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展，大量的重金屬進(jìn)入水體及其他環(huán)境系統(tǒng)中，長(zhǎng)期存在于環(huán)境中，并通過食物、污水和空氣等進(jìn)入人體且不斷蓄積，直接危害人體健康[1]。砷(As)、鉛(Pb)、鎘(Cd)、鎳(Ni)是已知的有毒重金屬，具有一定的生殖毒性，且能通過胎盤屏障[2, 3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，砷、鉛、鎘、鎳暴露會(huì)影響胚胎的正常發(fā)育及后代的生長(zhǎng)[4, 5]。然而，其致畸作用的機(jī)制尚不清楚。

目前，越來越多的研究聚焦于環(huán)境暴露引起的表觀遺傳學(xué)改變[6]。表觀遺傳學(xué)是指在不改變DNA序列的前提下，基因表達(dá)發(fā)生的可遺傳的變化，被認(rèn)為是環(huán)境暴露和疾病發(fā)生發(fā)展之間的機(jī)制橋梁[7, 8]。其中，DNA甲基化是研究最廣泛的機(jī)制之一，是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA Methyltransferase, DNMT)的催化下，將S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基添加到DNA分子上[9]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，母親砷、鉛、鎘、鎳暴露會(huì)引起胎兒臍帶血中整體[10]及特異基因甲基化水平的改變，包括砷甲基轉(zhuǎn)移酶基因(As3MT)[11]、印跡基因(H19、HSD11B2、PEG10、MEG3)[12, 13]、DNMT3B基因[14]等。但大部分研究采集母親外周血、尿、指甲等生物標(biāo)本進(jìn)行重金屬暴露測(cè)量，鮮有研究使用臍帶組織測(cè)量重金屬含量。臍帶作為胎兒身體的一部分，測(cè)量其污染物濃度，能更好地評(píng)估胎兒體內(nèi)污染物的真實(shí)暴露水平。為探討一般人群中重金屬含量與DNA甲基化水平的關(guān)系，本研究納入173例無重大體表出生缺陷胎兒，測(cè)量其臍帶組織砷、鉛、鎘、鎳金屬含量，及臍帶血中DNMT3B基因甲基化水平，探索胎兒重金屬內(nèi)暴露對(duì)DNA甲基化水平的影響，為重金屬的致畸作用機(jī)制研究提供依據(jù)。

對(duì)象及方法

一、研究對(duì)象

本研究為橫斷面研究。研究對(duì)象來自北京大學(xué)生育健康研究所于2003年1月至2016年12月在山西省太谷縣、平定縣、昔陽縣、壽陽縣、澤州縣、太原市和長(zhǎng)治市開展的病例對(duì)照研究。研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)無重大體表出生缺陷的正常胎兒或新生兒；(2)母親為山西省常住居民(在本地居住2年以上)，且本次妊娠期間在本地居?。?3)同意參加研究并簽署書面知情同意書。本研究通過北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

二、方法

1. 問卷調(diào)查及標(biāo)本采集：對(duì)調(diào)查員進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范的培訓(xùn)，在終止妊娠或分娩前后，采用結(jié)構(gòu)式問卷對(duì)研究對(duì)象的母親進(jìn)行面對(duì)面調(diào)查。調(diào)查內(nèi)容包括母親基本人口學(xué)特征、生活方式、孕期飲食情況、環(huán)境污染物暴露情況等。胎兒娩出時(shí)，現(xiàn)場(chǎng)采集5～10 cm臍帶組織、臍帶血等標(biāo)本，并用干冰轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。臍帶組織保存在-20℃冰箱，臍帶血以紙血片或血細(xì)胞方式分別保存于-20℃、-80℃冰箱。

2. 臍帶組織重金屬含量檢測(cè)：分離2g左右的濕重臍帶，用鈦合金剪刀將臍帶血管剪開，超純水清洗后放入真空冷凍干燥機(jī)，凍干至約0.2g。在高壓微波消解儀(Ultra WAVE, Milestone, Italy)中用3 mL硝酸溶液和0.5 mL雙氧水消化凍干臍帶。處理1h后，從石英消解管中取1ml樣本加入到EP管中，超純水稀釋至2ml。使用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)檢測(cè)并得到結(jié)果。每批次檢測(cè)同時(shí)制備2份豬肝標(biāo)準(zhǔn)品(GBW 10051)，對(duì)每20個(gè)臍帶樣品進(jìn)行質(zhì)控。砷、鉛、鎘、鎳的檢出限分別0.011 ng/mL、0.002 ng/mL、0.001 ng/mL、0.016 ng/mL。所有樣本的重金屬含量均高于檢出限。

3. 臍帶血DNA提取：用DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit)，按照試劑盒說明書提取臍帶血中的DNA，使用NanoDrop分光光度計(jì)對(duì)DNA樣本的濃度及純度進(jìn)行測(cè)定，并置于-80°C冰箱保存。

4. 臍帶血DNMT3B基因甲基化水平檢測(cè)：選取DNMT3B基因甲基化島區(qū)域?yàn)槟繕?biāo)區(qū)域，使用EpiDesigner網(wǎng)站(http://www.epidesigner.com/)，在線設(shè)計(jì)PCR引物，PCR引物共覆蓋24個(gè)CpG位點(diǎn)，剔除3個(gè)位點(diǎn)不可分析，共21個(gè)可分析位點(diǎn)。正向引物為5′-aggaagagag-GGGTTTTTAGGGGTTTTTTTTG-3′，反向引物為5′-agtaatacgactcactatagggagaaggct-CCCCTCCCACAAAATATATACAATA-3′。取500ng DNA樣本使用試劑盒(EZ DNA Methylation kit，Zymo公司)進(jìn)行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換。處理后的DNA使用Sequenom MassARRAY時(shí)間飛行質(zhì)譜陣列基因分析平臺(tái)進(jìn)行定量分析。先配置5μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃ 4min; 95℃ 20s，58℃ 30s，72℃ 1min(45個(gè)循環(huán))；72℃ 3min。之后使用蝦堿性磷酸酶(SAP)純化PCR產(chǎn)物，條件為37℃ 20min，85℃ 5min。使用T切割轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行堿基特異性酶切反應(yīng)(MassCLEAVE),條件為37℃ 3h。最終產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至384孔板，加入清潔樹脂進(jìn)行脫鹽處理并上機(jī)檢測(cè)。用EpiTYPER軟件進(jìn)行峰值檢測(cè)及甲基化水平定量計(jì)算。甲基化數(shù)值用百分?jǐn)?shù)表示，DNMT3B的甲基化水平為21個(gè)位點(diǎn)的平均值。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照進(jìn)行質(zhì)控。

5. 統(tǒng)計(jì)分析方法：砷、鉛、鎘、鎳金屬濃度用中位值及四分位間距表示，基因甲基化水平用表示。采用Spearman等級(jí)相關(guān)法進(jìn)行相關(guān)分析。對(duì)四種金屬含量進(jìn)行l(wèi)og對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，并采用多重線性回歸模型調(diào)整混雜，分析四種重金屬對(duì)DNMT3B甲基化水平的影響。混雜因素包括母親分娩年齡、孕前BMI、文化程度、職業(yè)、圍孕期葉酸補(bǔ)充情況、主動(dòng)或被動(dòng)吸煙暴露、胎兒孕周及胎兒性別。使用Stata 14.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

本研究共納入173例無重大體表出生缺陷胎兒，均為漢族，男性和女性的比例分別為44.7%、55.3%，平均孕周為(39.8±3.0)周。接受問卷調(diào)查的母親平均分娩年齡為(27.0±4.7)歲，孕前BMI為(23.0±3.6)kg/m2。113(65.3%)人文化程度為初中及以下。大部分人(77.3%)的職業(yè)為農(nóng)民，89(53.0%)人為初產(chǎn)婦。其余孕期環(huán)境因素暴露特征見表1。

表1 母親、胎兒基本人口學(xué)及孕期環(huán)境暴露因素特征
Table 1 Basic demographic characteristics and prenatal environmental exposure among mothers and infants

Characteristics? n(%)Age at delivery (mean±SD)27.0±4.7BMI (mean±SD)23.0±3.6Education level Junior school and lower113(65.3) High school and above60(34.7)Occupation Famer133(77.3) Other39(22.7)Han ethnicity173(100.0)Parity 189(53.0) ≥279(47.0)Folic acid supplementation Yes86(52.4) No78(47.6)Active or passive smoking Yes70(40.7) No102(59.3)Alcohol drinking Yes15(8.8) No156(91.2)Infant gender Male76(44.7) Female94(55.3)Gestational week (mean±SD)39.8±3.0

*The number for some variables data may not equal to total number due to missing value.

臍帶組織中，砷、鉛、鎘、鎳濃度的中位值及四分位間距分別為7.66(5.24～10.30) ng/g、23.91(16.74～44.29) ng/g、0.95(0.47～2.71) ng/g、21.42(15.61～32.2) ng/g。臍帶血中DNMT3B基因平均甲基化水平為(7.38±2.66)%。Spearman等級(jí)相關(guān)法結(jié)果顯示，鎘與DNMT3B甲基化水平存在相關(guān)性(r=0.19， P=0.01)，其余金屬與DNMT3B甲基化水平無相關(guān)性(P>0.05)。4種重金屬的濃度均為偏態(tài)分布，進(jìn)行l(wèi)og對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，分別繪制散點(diǎn)圖。詳見圖1。

圖1 臍帶中砷、鉛、鎘、鎳金屬含量與DNMT3B甲基化水平散點(diǎn)圖
Figure 1 Correlation between concentrations of As, Pb, Cd and Ni in umbilical cord and DNMT3B methylation level

以DNMT3B甲基化水平為因變量，各金屬濃度的log轉(zhuǎn)換值為自變量，調(diào)整混雜因素，進(jìn)行多重線性回歸分析?；貧w結(jié)果顯示，臍帶組織中鎘含量對(duì)DNMT3B甲基化水平的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(β=0.74, P=0.03)。其余金屬對(duì)DNMT3B甲基化水平無顯著影響(P>0.05)。詳見表2。

表2 臍帶中砷、鉛、鎘、鎳金屬對(duì)DNMT3B甲基化水平的影響
Table 2 Effect of umbilical cord As, Pb, Cd and Ni on DNMT3B methylation level

MetalsβSE95% CIArsenic 0.330.53-0.71, 1.37Lead 0.010.65-1.28, 1.30Cadmium 0.740.34 0.06, 1.42?Nickel-0.650.75-2.13, 0.83

*P<0.05

多重線性回歸模型中分別加入鎘與砷、鉛、鎳金屬兩兩配對(duì)的交互項(xiàng)，結(jié)果顯示鎘與砷、鉛、鎳金屬對(duì)DNMT3B甲基化的影響均無顯著交互作用(P>0.05)。詳見表3。

表3 臍帶中重金屬交互作用對(duì)DNMT3B甲基化水平的影響
Table 3 Interaction effect among umbilical cord As, Pb, Cd and Ni on DNMT3B methylation level

MetalsβSE95% CICadmium×Arsenic-1.220.94-3.08, 1.86Cadmium×Lead-2.031.10-4.21, 0.15Cadmium×Nickel 0.361.30-2.20, 2.93

討論

本研究為橫斷面研究，以無重大體表出生缺陷的胎兒為研究對(duì)象，分析一般人群中重金屬暴露對(duì)胎兒DNA甲基化水平的影響。結(jié)果顯示，控制混雜因素后，臍帶組織鎘含量增加，會(huì)引起臍帶血中DNMT3B甲基化水平升高。未發(fā)現(xiàn)鎘與砷、鉛或鎳對(duì)DNMT3B甲基化水平的交互作用。

砷、鉛、鎘、鎳是生產(chǎn)生活環(huán)境中普遍存在的污染物，可以通過多種途徑進(jìn)入人體，如呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等，對(duì)人類健康造成了很多不良影響[1]。有研究報(bào)道，砷、鉛、鎘、鎳可以通過胎盤屏障，形成宮內(nèi)暴露，引起不良妊娠結(jié)局[2,3]。本研究檢測(cè)了173例胎兒臍帶組織中砷、鉛、鎘、鎳的含量，其中，鉛、鎘含量的中位值分別為23.91 ng/g、0.95 ng/g，略低于日本的一項(xiàng)人群研究報(bào)道的39.9 ng/g、1.16 ng/g[15]。既往研究多采用臍帶血清樣本檢測(cè)砷含量，一項(xiàng)在中國(guó)人群開展的大型隊(duì)列研究(N=3474)報(bào)道臍帶血清砷含量中位值為1.87 μg/L[16]。與臍帶血相比，臍帶組織是胎兒組織的一部分，更能反映胎兒的暴露情況。本研究首次使用臍帶組織檢測(cè)砷的中位值為7.66 ng/g。本研究也首次報(bào)道了臍帶組織中鎳的含量，其中位值為21.42 ng/g。

已有研究發(fā)現(xiàn)，母親孕期砷、鉛、鎘、鎳暴露會(huì)影響胎兒的DNA甲基化水平。本研究以DNMT3B基因?yàn)槟康幕?，檢測(cè)甲基化水平并分析與重金屬的關(guān)系。DNMT3B基因是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)家族的成員之一，其編碼的蛋白酶在合成甲基化(de novo methylation)過程中起重要作用[17]。對(duì)169例居住在鎘暴露區(qū)和100例非暴露區(qū)的泰國(guó)居民的尿鎘濃度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著尿鎘濃度增加，外周血DNMT3B甲基化的水平越高[14]。另一項(xiàng)對(duì)202名阿根廷婦女的研究發(fā)現(xiàn)低水平的尿鎘暴露(0.23 μg/L)與外周血DNMT3B基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[18]。以上研究提示鎘暴露會(huì)影響DNMT3B甲基化及表達(dá)水平，但暴露測(cè)量均使用妊娠婦女尿液標(biāo)本，不能反映胎兒生長(zhǎng)發(fā)育過程中的真實(shí)暴露情況。本研究中，多重線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，控制混雜因素后，DNMT3B甲基化與臍帶鎘含量呈正相關(guān)，隨著鎘暴露水平的增加，DNMT3B甲基化水平升高，提示表觀遺傳改變可能是重金屬致病的重要途徑之一。

本研究還探討了鎘與砷、鉛和鎳金屬之間的交互作用。結(jié)果顯示，鎘與其他三種金屬對(duì)DNMT3B甲基化水平的影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)交互作用。目前有關(guān)金屬交互作用的研究較少，一項(xiàng)母親鎘、砷暴露與后代先天性心臟病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)研究中發(fā)現(xiàn)，鎘和砷對(duì)先天性心臟病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在交互作用[19]。然而，其相互作用的生物機(jī)制尚不清楚。

本研究的優(yōu)勢(shì)在于，相比以往研究，使用臍帶組織測(cè)量胎兒發(fā)育過程中的重金屬內(nèi)暴露。使用臍帶血測(cè)量DNA甲基化水平，DNA甲基化能作為一種生物標(biāo)志物，可運(yùn)用臨床上異常狀態(tài)的早期識(shí)別和診斷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)胎兒臍帶組織重金屬暴露可能會(huì)影響DNMT3B基因甲基化水平，為今后進(jìn)一步探究重金屬與疾病關(guān)聯(lián)的作用機(jī)制提供依據(jù)。此外，胎盤對(duì)重金屬缺乏有效屏障作用，為減少胎兒的宮內(nèi)暴露劑量，應(yīng)采取有效防護(hù)措施、開展合理的孕期健康教育，避免孕婦暴露于環(huán)境重金屬污染。

參考文獻(xiàn)

1 Wu X,Cobbina SJ,Mao G,et al.A review of toxicity and mechanisms of individual and mixtures of heavy metals in the environment.Environ Sci Pollut Res Int,2016,23:8244-8259.

2 Caserta D,Graziano A,Lo Monte G,et al.Heavy metals and placental fetal-maternal barrier:a mini-review on the major concerns.Eur Rev Med Pharmacol Sci,2013,17:2198-2206.

3 Punshon T,Davis MA,Marsit CJ,et al.Placental arsenic concentrations in relation to both maternal and infant biomarkers of exposure in a US cohort.J Expo Sci Environ Epidemiol,2015,25:599-603.

4 Thompson J,Bannigan J.Cadmium:toxic effects on the reproductive system and the embryo.Reprod Toxicol,2008,25:304-315.

5 Wang A,Holladay SD,Wolf DC,et al.Reproductive and developmental toxicity of arsenic in rodents:a review.Int J Toxicol,2006,25:319-331.

6 Martin EM,Fry RC.Environmental Influences on the epigenome:exposure- associated DNA methylation in human populations.Annu Rev Public Health,2018,39:309-333.

7 Marsit CJ.Influence of environmental exposure on human epigenetic regulation.J Exp Biol,2015,218:71-79.

8 朱江輝,任愛國(guó).表觀遺傳流行病學(xué).中國(guó)生育健康雜志,2009,20:378-382.

9 Maunakea AK,Chepelev I,Zhao K.Epigenome mapping in normal and disease States.Circ Res,2010,107:327-339.

10 Tajuddin SM,Amaral AF,Fernandez AF,et al.Genetic and non-genetic predictors of LINE-1 methylation in leukocyte DNA.Environ Health Perspect,2013,121:650-656.

11 Gribble MO,Tang WY,Shang Y,et al.Differential methylation of the arsenic (III) methyltransferase promoter according to arsenic exposure.Arch Toxicol,2014,88:275-282.

12 Goodrich JM,Sanchez BN,Dolinoy DC,et al.Quality control and statistical modeling for environmental epigenetics:a study on in utero lead exposure and DNA methylation at birth.Epigenetics,2015,10:19-30.

13 Vidal AC,Semenova V,Darrah T,et al.Maternal cadmium,iron and zinc levels,DNA methylation and birth weight.BMC Pharmacol Toxicol,2015,16:20.

14 Virani S,Rentschler KM,Nishijo M,et al.DNA methylation is differentially associated with environmental cadmium exposure based on sex and smoking status.Chemosphere,2016,145:284-290.

15 Sakamoto M,Yasutake A,Domingo JL,et al.Relationships between trace element concentrations in chorionic tissue of placenta and umbilical cord tissue:potential use as indicators for prenatal exposure.Environ Int,2013,60:106-111.

16 馮蘭蘭,梁春梅,黃錕,等.孕期和臍帶血清砷水平及其與妊娠期高血壓疾病關(guān)系.中國(guó)公共衛(wèi)生,2018:1-3.

17 Okano M,Bell DW,Haber DA,et al.DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development.Cell,1999,99:247-257.

18 Hossain MB,Vahter M,Concha G,et al.Low-level environmental cadmium exposure is associated with DNA hypomethylation in Argentinean women.Environ Health Perspect,2012,120:879-884.

19 Jin X,Tian X,Liu Z,et al.Maternal exposure to arsenic and cadmium and the risk of congenital heart defects in offspring.Reprod Toxicol,2016,59:109-116.

網(wǎng)址: 重金屬宮內(nèi)暴露對(duì)胎兒DNMT3B基因甲基化的影響 http://www.u1s5d6.cn/newsview41932.html