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1、(10)授權(quán)公告號(hào) CN 101946812 B (45)授權(quán)公告日 2013.06.05 CN 101946812 B *CN101946812B* (21)申請(qǐng)?zhí)?201010268343.8 (22)申請(qǐng)日 2010.08.30 A01N 65/28(2009.01) A01P 1/00(2006.01) A61K 36/61(2006.01) A61P 31/12(2006.01) A61K 127/00(2006.01) (73)專利權(quán)人 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研 究所 地址 510030 廣東省廣州市海珠區(qū)新港西路 231 號(hào) (72)發(fā)明人 郭志勛 李卓佳 馮娟 王瑞旋 (7。

2、4)專利代理機(jī)構(gòu) 廣州知友專利商標(biāo)代理有限 公司 44104 代理人 宣國(guó)華 CN 101653517 A,2010.02.24, 全文 . S.Direkbusarakom,et alEfficacy of guava(Psidium guajava) extract against some fish and shrimp pathogenic agents. Disease in Asian Aquaculture. .1997, 第 359-363 頁(yè) . 王瑞旋 , 等 . 中草藥對(duì)海水動(dòng)物致病菌體外 抑制作用的初步研究 . 南方水產(chǎn) .2009, 第 5 卷 ( 第 6 期 ), 。

3、第 19-24 頁(yè) . (54) 發(fā)明名稱 番石榴葉及其提取物的用途 (57) 摘要 本發(fā)明公開了番石榴葉及其提取物在制備預(yù) 防或治療對(duì)蝦白斑綜合癥病毒藥物中的應(yīng)用， 本 發(fā)明采用的番石榴葉資源豐富、 成本低、 加工方 便、 較少抗藥性和藥物殘留、 毒副作用小， 本發(fā)明 所述的番石榴葉或番石榴葉提取物可以有效的殺 滅水中的對(duì)蝦白斑綜合癥病毒， 以降低該病毒在 水中的傳播的可能性， 達(dá)到預(yù)防該病毒傳播的目 的。 (51)Int.Cl. (56)對(duì)比文件 審查員 靳瑩瑩 權(quán)利要求書 1 頁(yè) 說(shuō)明書 6 頁(yè) (19)中華人民共和國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局 (12)發(fā)明專利 權(quán)利要求書1頁(yè) 說(shuō)明書6頁(yè) (10)。

4、授權(quán)公告號(hào) CN 101946812 B CN 101946812 B *CN101946812B* 1/1 頁(yè) 2 1. 番石榴葉及其提取物在制備用于預(yù)防或治療對(duì)蝦白斑綜合癥病毒藥物中的應(yīng)用。 2. 如權(quán)利要求 1 所述的應(yīng)用， 其特征在于 ： 所述的番石榴葉提取物為其水提取物。 3. 如權(quán)利要求 1 或 2 所述的應(yīng)用， 其特征在于 ： 使用時(shí)調(diào)整養(yǎng)殖水體中番石榴葉或其 提取物的質(zhì)量濃度范圍是 1-100g/ 噸水。 權(quán) 利 要 求 書 CN 101946812 B 2 1/6 頁(yè) 3 番石榴葉及其提取物的用途 技術(shù)領(lǐng)域 0001 本發(fā)明涉及一種番石榴葉及其提取物在制備用于預(yù)防或治療對(duì)蝦白。

5、斑綜合癥病 毒 WSSV 藥物中的應(yīng)用， 屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域。 背景技術(shù) 0002 經(jīng)過(guò)近三十年的快速發(fā)展， 對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)已成為我國(guó)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的重要組成部分， 在 提高沿海地區(qū)農(nóng)漁民就業(yè)和經(jīng)濟(jì)收入中發(fā)揮了重要的作用。但是， 隨著規(guī)模的不斷擴(kuò)大和 環(huán)境的惡化， 對(duì)蝦病害問(wèn)題也日趨嚴(yán)重， 給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)者帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失自從 1974 年 Couch 報(bào)道首例對(duì)蝦桿狀病毒 (BP) 以來(lái)， 已發(fā)現(xiàn)的對(duì)蝦疾病病原包括病毒、 細(xì)菌、 真菌、 立 克次氏體和寄生蟲等達(dá) 40 多種， 眾多疾病當(dāng)中危害較大的是病毒病和細(xì)菌病， 而其中危害 最嚴(yán)重的是對(duì)蝦白斑綜合癥病毒 (White Spot Syndrome。

6、 Virus， WSSV)， 每年給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè) 造成巨大經(jīng)濟(jì)損失， 至今仍未得到完全控制， 成為目前對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要障礙 之一。1995 年被國(guó)際獸疫局、 聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織以及亞太地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展網(wǎng)絡(luò)中心將其列 為需要報(bào)告的水生動(dòng)物病毒性疫病之一。 0003 在傳統(tǒng)的防治方法中， 主要是利用化學(xué)消毒劑對(duì)水體進(jìn)行消毒， 以阻斷其在水中 的傳播， 但是化學(xué)消毒劑在殺滅病毒的同時(shí)， 對(duì)細(xì)菌、 藻類以及其他生物可能也有殺滅做 用， 破壞了蝦池生態(tài)平衡， 不利于對(duì)蝦生存環(huán)境的穩(wěn)定。 發(fā)明內(nèi)容 0004 本發(fā)明的目的在于提供番石榴葉或其提取物在制備用于預(yù)防或治療對(duì)蝦白斑綜 合癥病毒藥物中的應(yīng)用。番。

7、石榴葉提取物資源豐富、 成本低、 加工方便、 較少抗藥性和藥 物殘留、 毒副作用小， 且可有效殺滅水體中的對(duì)蝦白斑綜合癥病毒， 降低該病毒在水中的傳 播。 0005 實(shí)際上， 本發(fā)明番石榴葉及其提取物在制備預(yù)防或治療對(duì)蝦白斑綜合癥病毒藥物 中的應(yīng)用。 0006 本發(fā)明所述的番石榴葉提取物可以是番石榴葉水提取物， 先將番石榴葉粉 碎， 然 后加水提取后， 高壓滅菌、 離心除渣， 得番石榴葉水提取物的原液， 實(shí)際使用時(shí)調(diào)整養(yǎng)殖水 體中番石榴葉提取物的質(zhì)量濃度范圍是 1-100g/ 噸水。 0007 本發(fā)明所述的番石榴葉還可以是番石榴葉原材料， 使用時(shí)將其粉碎后直接拋灑于 養(yǎng)殖水體或者與飼料混合投喂。

8、對(duì)蝦， 并調(diào)整養(yǎng)殖水體中番石榴葉粉末的質(zhì)量濃度范圍是 1-100g/ 噸水。 0008 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是 ： 本發(fā)明采用的番石榴葉資源豐富、 成本低、 加工方便、 較少抗藥 性和藥物殘留、 毒副作用小等特點(diǎn)， 本發(fā)明制備的番石榴葉或番石榴葉提取物可以有效的 殺滅水中的對(duì)蝦白斑綜合癥病毒， 以降低該病毒在水中的傳播的可能性， 達(dá)到預(yù)防該病毒 傳播的目的。 說(shuō) 明 書 CN 101946812 B 3 2/6 頁(yè) 4 具體實(shí)施方式 0009 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明， 以下試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均為市售 或采用常規(guī)手段制備獲得。 0010 實(shí)施例 1 番石榴葉粉末的制備 0011 取番石榴。

9、葉 10g， 按常規(guī)方法粉碎、 過(guò)篩后制得番石榴葉粉末， 滅菌后分裝即可， 使 用時(shí)直接拋灑入海水養(yǎng)殖水體中并使養(yǎng)殖水體中番石榴葉粉末的濃度為 1-100g/ 噸水即 可。 0012 實(shí)施例 2 番石榴葉水提取物的制備 0013 取番石榴葉藥材 1g， 經(jīng)粉碎過(guò)篩后， 加入 99mL 水浸泡， 室溫浸泡 24 小時(shí)， 然后， 121高壓滅菌20min， 5000g離心15min除掉藥渣， 作為儲(chǔ)備液密封4保存?zhèn)溆茫?藥物的濃 度相當(dāng)于 10mg/mL， 使用時(shí)直接拋灑入海水養(yǎng)殖水體中并使養(yǎng)殖水體中番石榴葉提取物的 濃度為 1-100g/ 噸水即可。 0014 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，。

10、 但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制， 其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、 修飾、 替代、 組合、 簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式， 都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍。 0015 以下通過(guò)試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證番石榴葉及其提取物作為抗對(duì)蝦白斑綜合癥 WSSV 的新用 途。 0016 一、 番石榴葉提取物與其它原料對(duì)對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的影響對(duì)比 0017 1.1 試驗(yàn)原料的制備 0018 稱取番石榴葉 1g 加入 99ml 蒸餾水， 室溫浸泡 24h， 然后， 121高壓滅菌 20min， 5000g 離心 15min 除掉藥渣， 作為儲(chǔ)備液密封 4保存?zhèn)溆茫?藥物的濃度相當(dāng)于 10mg/m。

11、L。 0019 同時(shí)采用以下單味原料作為對(duì)比， 稱取丁香、 板藍(lán)根、 辣蓼、 百部、 金銀花、 蒼術(shù)、 黃 岑、 苦辣皮、 白芪、 穿心蓮等 10 種超微粉碎的原料各 1 克， 分別加入 99ml 蒸餾水， 室溫浸泡 24h， 然后， 121高壓滅菌 20min， 5000g 離心 15min 除掉藥渣， 作為儲(chǔ)備液密封 4保存?zhèn)?用， 藥物的濃度相當(dāng)于 10mg/mL。 0020 1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦的養(yǎng)殖 0021 實(shí)驗(yàn)用蝦為凡納賓對(duì)蝦 Litopenaeus Vannamei， 購(gòu)自海南省陵水黎族自治縣某 蝦場(chǎng)， 體重約 8 克， 在海南陵水熱帶水產(chǎn)研究中心陵水新村試驗(yàn)場(chǎng)內(nèi)暫養(yǎng)一周， 實(shí)驗(yàn)前。

12、將 0.5m3的玻璃缸清洗干凈， 用 0.5的高錳酸堿溶液浸泡 1h 消毒， 然后沖洗干凈。放蝦前一 天注入海水并連續(xù)充氣。養(yǎng)殖海水經(jīng)自然經(jīng)沉淀后沙濾， 保持連續(xù)充氣， 每天上午虹吸糞 便， 隔天換水， 換水量約為 1/3-1/2， 溫度 28-32， 鹽度 32-33， 溶解氧 6.6-7.0mg/L， 氨氮 0.3-0.5mg/L。完全適應(yīng)后挑選體色健康、 大小均勻的凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用蝦每天 分三次投料， 08:00， 17:00和22:00， 投料量為蝦重的5-8， 并根據(jù)攝食情況適當(dāng)調(diào)節(jié)投 喂量。 0022 1.3 WSSV 感染病毒液的制備 0023 選取具典型 WSSV 病。

13、癥， 并經(jīng) PCR 檢驗(yàn)為 WSSV 陽(yáng)性的凡納濱對(duì)蝦， 取肌肉組織 0.1g， 加入 1ml 沙濾海水， 冰浴勻漿， 然后， 再用海水稀釋到 1000 倍， 作為病毒粗提液。 0024 1.4 注射液的制備 0025 12種原料儲(chǔ)備液各取1ml， 分別加入9ml的病毒粗提液， 混勻， 0.22m硝酸纖維素 說(shuō) 明 書 CN 101946812 B 4 3/6 頁(yè) 5 濾膜過(guò)濾除菌， 室溫放置 24h， 作為病毒注射液， 藥物的濃度相當(dāng)于 1mg/mL ； 另外， 取各種原 料儲(chǔ)備液加入 9 倍體積的海水， 過(guò)濾除菌后作為陰性對(duì)照注射液 ； 最后， 分別把海水、 1ml 海 水加 9ml 病毒。

14、粗提液過(guò)濾除菌后作為空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照注射液。 0026 1.5 人工感染實(shí)驗(yàn) 0027 把注射液分別注射對(duì)蝦， 每尾對(duì)蝦注射 50L， 分別養(yǎng)在玻璃鋼桶中， 每天 觀察死 亡情況。 0028 1.6 WSSV 的檢測(cè) 0029 取 0.1g 對(duì)蝦肌肉組織， 加入 PBS 緩沖液 (8gNaCl， 0.2gKCl， 1.44gNa2HPO4和 0.24g KH2PO4， 加水定容至1L， 用HCl調(diào)節(jié)溶液PH值至7.4， 高溫高壓滅菌20min備用)1mL， 冰浴勻 漿， 6000rpm 離心 5min。取上清液 50L 加入 1L 蛋白酶 K(10mg/ml)， 煮沸 15min， 立即放 。

15、于冰上 5min 后， 8000rpm 離心 10min。上清液用作 PCR 檢測(cè)模板， 利用中山大學(xué)提供的 WSSV 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。 0030 表 1 抗對(duì)蝦白斑綜合癥病毒原料篩選結(jié)果 0031 0032 注 ： 單獨(dú)藥名為陰性對(duì)照組 ； 藥名后加 V 為實(shí)驗(yàn)組 0033 如上表 1 所示， 人工感染 WSSV 后的第四天， 陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)蝦開始出現(xiàn)死亡， 第五、 說(shuō) 明 書 CN 101946812 B 5 4/6 頁(yè) 6 六天為死亡高峰期， 到第七天死亡率達(dá)到 100， 而空白對(duì)照沒(méi)有出 現(xiàn)死亡。對(duì)于實(shí)驗(yàn)的 11 種藥物， 陰性對(duì)照組都沒(méi)有出現(xiàn)死亡， 蒼術(shù)、 黃岑、 白芪、 穿心蓮組。

16、中的對(duì)蝦死亡速度比陽(yáng) 性對(duì)照組快， 番石榴組中只有 2 尾對(duì)蝦死亡， 而其余各組對(duì)蝦死亡情況與對(duì)照組相似。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明番石榴對(duì) WSSV 具有殺滅作用。 0034 二、 不同濃度番石榴葉提取物對(duì)對(duì)蝦白斑綜合癥病毒殺毒效果的影響 0035 番石榴葉的制備方法、 對(duì)蝦養(yǎng)殖、 WSSV 感染病毒液的制備和注射液的制備等參考 1.1。 0036 本實(shí)驗(yàn)針對(duì)具有殺毒作用的原料， 包括兩個(gè)方面的內(nèi)容 ： 1、 保持藥物病毒和原料 的相對(duì)濃度不變， 把按照 1.4 中的方法制備的注射液系列稀釋 10， 100， 1000 倍后， 室溫放 置24小時(shí)， 人工感染對(duì)蝦 ； 2、 保持病毒的濃度不變， 把番石榴。

17、葉提取物稀釋10， 100， 1000倍 后， 按照 1.4 中的方法制備注射液， 人工感染對(duì)蝦， 觀察死亡情況。 0037 表 2 WSSV 濃度不變時(shí)不同濃度番石榴的殺毒效果 ( 單位 ： mg/mL) 0038 0039 注 ： 單獨(dú)藥名為陰性對(duì)照組 ； 藥名后加 V 為實(shí)驗(yàn)組。 0040 如上表2所示， 當(dāng)保持病毒濃度不變， 只改變藥物的濃度時(shí)， 人工感染W(wǎng)SSV后的第 三天， 陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)蝦開始出現(xiàn)死亡， 第五天死亡率達(dá)到 100， 而空白對(duì)照對(duì)蝦死亡 1 尾。 10-4和 10-6mg/mL 的陰性對(duì)照各死亡一尾對(duì)蝦， 可能是由于應(yīng)激造成的 ； 只有濃度為 10-3mg/ mL 的。

18、實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦沒(méi)有出現(xiàn)死亡， 而其余各實(shí)驗(yàn)組死亡情況同陽(yáng)性對(duì)照組相似 ( 見表 2)。以 上結(jié)果表明， 在目前的病毒濃度下， 只有當(dāng)藥物濃度達(dá)到10-3mg/mL以上時(shí)， 才能殺滅病毒。 0041 以下為保持藥物病毒和原料的相對(duì)濃度不變， 把按照 1.4 中的方法制備的注射液 系列分別稀釋 10 和 100 倍后， 其相應(yīng)濃度分別為 10-4和 10-5mg/mL， 室溫放置 24 小時(shí)， 人工 感染對(duì)蝦， 模擬實(shí)際養(yǎng)殖水體中病毒和番石榴葉的濃度， 結(jié)果如下表 3 所示。 0042 表3 WSSV和番石榴相對(duì)濃度不變同時(shí)降低時(shí)的殺毒效果(藥物濃度單位 ： mg/mL) 0043 說(shuō) 明 書 CN 。

19、101946812 B 6 5/6 頁(yè) 7 0044 注 ： 單獨(dú)藥名為陰性對(duì)照組 ； 藥名后加 V 為實(shí)驗(yàn)組 0045 如上表 3 所示， 當(dāng)病毒和藥物的相對(duì)濃度保持不變， 把混合液稀釋， 無(wú)論是空白對(duì) 照還是陰性對(duì)照組的對(duì)蝦都出現(xiàn)少量死亡， 而陽(yáng)性對(duì)照組的對(duì)蝦死亡速度也較慢， 即使人 工感染后 13 天， 仍有少量對(duì)蝦存活， 特別是稀釋度為陽(yáng)性對(duì)照組存活率達(dá)到 35.7。各 實(shí)驗(yàn)組的對(duì)蝦也出現(xiàn)少量的死亡， 但同各陰性對(duì)照組相比幾乎沒(méi)有差異。以上結(jié)果可以說(shuō) 明藥物對(duì)病毒的殺滅效果與病毒和藥物的相對(duì)濃度相關(guān)， 在達(dá)到能夠殺滅病毒的相對(duì)濃度 時(shí)， 同時(shí)降低在水中的絕對(duì)濃度， 藥物的殺毒效果不受影。

20、響。 0046 三、 藥物處理時(shí)間對(duì)殺毒效果的影響 0047 藥物的制備、 對(duì)蝦養(yǎng)殖、 對(duì)蝦人工感染實(shí)驗(yàn)、 WSSV 感染病毒液的制備和注射液的制 備等參考 1.1。 0048 下表 4 中的結(jié)果表明， 用番石榴提取液處理病毒 6h 以內(nèi)對(duì) WSSV 的感染活性基本 沒(méi)有影響， 而當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到 12h 以上時(shí)， WSSV 失活， 番石榴葉或其水提取液對(duì)對(duì)蝦白斑綜 合癥病毒粗提液處理 12h 以上可以殺死該病毒。 0049 表 4 藥物處理時(shí)間對(duì)殺毒效果的影響 0050 說(shuō) 明 書 CN 101946812 B 7 6/6 頁(yè) 8 0051 注 ： 單獨(dú)藥名為陰性對(duì)照組 ； 藥名后加 V 為實(shí)驗(yàn)組 0052 以上為采用番石榴葉水提取物進(jìn)行的效果試驗(yàn)， 其它如番石榴葉粉末等采用上述 公開的試驗(yàn)方法也可達(dá)到相同效果和類似結(jié)果， 此處不再一一列舉。 說(shuō) 明 書 CN 101946812 B 8 。

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