本發(fā)明涉及產(chǎn)左旋肉堿的重組菌及其構(gòu)建方法與應用，屬于生物
技術領域：
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背景技術：
：左旋肉堿(l-carnitine)，又稱l-肉堿或音譯卡尼丁，是一種促使脂肪轉(zhuǎn)化為能量的類氨基酸，紅色肉類是左旋肉堿的主要來源，對人體無毒副作用，極易吸潮。左旋肉堿的主要生理功能是促進脂肪轉(zhuǎn)化成能量，服用左旋肉堿能夠在減少身體脂肪、降低體重的同時，不減少水分和肌肉，在2003年被國際肥胖健康組織認定為最安全無副作用的減肥營養(yǎng)補充品。左旋肉堿的營養(yǎng)價值和醫(yī)用價值以及良好的市場前景，吸引了世界各國科學家對其進行廣泛和深入的研究。目前世界上只有瑞士、意大利、日本等為左旋肉堿的主要生產(chǎn)國。我國大部分左旋肉堿需求還是依靠進口，價格昂貴，亟待研發(fā)新進展，以填補國內(nèi)空白。因此，不斷開發(fā)低成本、高合成率、易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的左旋肉堿合成新路線，顯得尤為重要。左旋肉堿的制備方法很多，其制備可通過從動物肉浸膏中提取、生物合成和化學合成等方法。提取法產(chǎn)量低，純化步驟多，成本高且難以形成規(guī)?；a(chǎn)?；瘜W合成法主要采取2種途徑：(1)先制取出外消旋肉堿，利用拆分劑析出左旋體；(2)以不同的化學物質(zhì)為原料進行合成。生物合成法制備左旋肉堿主要有兩種方法，一是微生物發(fā)酵法，二是利用酶法轉(zhuǎn)化。全細胞生物轉(zhuǎn)化是一種高效、綠色的生物轉(zhuǎn)化過程，已成功運用在多種產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)上，全細胞催化通過細胞壁的保護使酶更加穩(wěn)定，彌補了體外酶法轉(zhuǎn)化酶活不穩(wěn)定的缺點。因此利用全細胞催化方法生產(chǎn)左旋肉堿值得深入研究。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是提供左旋肉堿產(chǎn)量高的重組菌及其構(gòu)建方法與應用。為了解決上述問題，本發(fā)明首先提供了一種產(chǎn)左旋肉堿的重組菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明提供的產(chǎn)左旋肉堿的重組菌的構(gòu)建方法為如下1)或2)：1)包括如下步驟：將γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運蛋白基因?qū)胧荏w菌得到產(chǎn)左旋肉堿的重組菌；2)包括如下步驟：將γ-丁基甜菜堿羥化酶基因?qū)胧荏w菌得到產(chǎn)左旋肉堿的重組菌；所述受體菌為突變型大腸桿菌或野生型大腸桿菌；所述突變型大腸桿菌為下述a1至a7中的任一種：a1、所述突變型大腸桿菌為對所述野生型大腸桿菌進行下述a1、a3和a5的改造后得到的所述野生型大腸桿菌的突變體，將其記作大腸桿菌突變體s7；a2、所述突變型大腸桿菌為對所述野生型大腸桿菌進行下述a1和a5的改造后得到的所述野生型大腸桿菌的突變體，將其記作大腸桿菌突變體s6；a3、所述突變型大腸桿菌為對所述野生型大腸桿菌進行下述a1、a2和a3的改造后得到的所述野生型大腸桿菌的突變體，將其記作大腸桿菌突變體s5；a4、所述突變型大腸桿菌為對所述野生型大腸桿菌進行下述a1和a4的改造后得到的所述野生型大腸桿菌的突變體，將其記作大腸桿菌突變體s4；a5、所述突變型大腸桿菌為對所述野生型大腸桿菌進行下述a1和a3的改造后得到的所述野生型大腸桿菌的突變體，將其記作大腸桿菌突變體s3；a6、所述突變型大腸桿菌為對所述野生型大腸桿菌進行下述a1和a2的改造后得到的所述野生型大腸桿菌的突變體，將其記作大腸桿菌突變體s2；a7、所述突變型大腸桿菌為對所述野生型大腸桿菌進行下述a1的改造后得到的所述野生型大腸桿菌的突變體，將其記作大腸桿菌突變體s1；a1、將所述野生型大腸桿菌基因組中的α-酮戊二酸脫氫酶基因(suca)敲除；a2、將所述野生型大腸桿菌基因組中的異檸檬酸裂合酶基因(acea)敲除；a3、用乙酰輔酶a合成酶基因(acs)替換所述野生型大腸桿菌基因組中的丙酮酸氧化酶基因(poxb)；a4、將所述野生型大腸桿菌基因組中的巴豆甜菜堿還原酶基因(caia)、甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因(caib)、輔酶a連接酶基因(caic)、巴豆甜菜堿coa水合酶基因(caid)、肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導基因(caie)構(gòu)成的caiabcde基因簇敲除；a5、將所述野生型大腸桿菌基因組中的肉堿轉(zhuǎn)運蛋白基因(cait)、巴豆甜菜堿還原酶基因(caia)、甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因(caib)、輔酶a連接酶基因(caic)、巴豆甜菜堿coa水合酶基因(caid)、肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導基因(caie)構(gòu)成的caitabcde基因簇敲除，且將所述caitabcde基因簇上游的操縱子fixabcx基因簇敲除。上述方法中的敲除和替換均可以通過本領域技術人員利用本領域熟知的手段實現(xiàn)，也可以是通過花費創(chuàng)造性勞動實現(xiàn)。在本發(fā)明的具體實施例中，所述敲除和所述替換均通過同源重組實現(xiàn)。進一步的，被導入所述受體菌的所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因編碼的蛋白質(zhì)為b1)或b2)所示的蛋白質(zhì)：b1)由seqidno.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b2)由seqidno.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有γ基丁基甜菜堿羥化酶活性的由b1)衍生的蛋白質(zhì)；被導入所述受體菌的所述肉堿轉(zhuǎn)運蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)為b3)或b4)所示的蛋白質(zhì)：b3)由seqidno.3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b4)由seqidno.3所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有肉堿轉(zhuǎn)運蛋白活性的由b3)衍生的蛋白質(zhì)；所述α-酮戊二酸脫氫酶基因編碼的蛋白質(zhì)為c1)或c2)所示的蛋白質(zhì)：c1)由genbank號為aac73820.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；c2)由genbank號為aac73820.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有α-酮戊二酸脫氫酶活性的由c1)衍生的蛋白質(zhì)；所述異檸檬酸裂合酶基因編碼的蛋白質(zhì)為d1)或d2)所示的蛋白質(zhì)：d1)由genbank號為aac76985.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；d2)由genbank號為aac76985.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有異檸檬酸裂合酶活性的由d1)衍生的蛋白質(zhì)；所述乙酰輔酶a合成酶基因編碼的蛋白質(zhì)為e1)或e2)所示的蛋白質(zhì)：e1)由genbank號為aac77039.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；e2)由genbank號為aac77039.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有乙酰輔酶a合成酶活性的由e1)衍生的蛋白質(zhì)；所述丙酮酸氧化酶基因編碼的蛋白質(zhì)為g1)或g2)所示的蛋白質(zhì)：g1)由genbank號為aac73958.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；g2)由genbank號為aac73958.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有丙酮酸氧化酶活性的由g1)衍生的蛋白質(zhì)；所述巴豆甜菜堿還原酶基因編碼的蛋白質(zhì)為h1)或h2)所示的蛋白質(zhì)：h1)由genbank號為aac73150.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；h2)由genbank號為aac73150.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有巴豆甜菜堿還原酶活性的由h1)衍生的蛋白質(zhì)；所述甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因編碼的蛋白質(zhì)為i1)或i2)所示的蛋白質(zhì)：i1)由genbank號為aac73149.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；i2)由genbank號為aac73149.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶活性的由i1)衍生的蛋白質(zhì)；所述輔酶a連接酶基因編碼的蛋白質(zhì)為j1)或j2)所示的蛋白質(zhì)：j1)由genbank號為aac73148.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；j2)由genbank號為aac73148.2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有輔酶a連接酶活性的由j1)衍生的蛋白質(zhì)；所述巴豆甜菜堿coa水合酶基因編碼的蛋白質(zhì)為k1)或k2)所示的蛋白質(zhì)：k1)由genbank號為aac73147.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；k2)由genbank號為aac73147.2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有巴豆甜菜堿coa水合酶活性的由k1)衍生的蛋白質(zhì)；所述肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導基因編碼的蛋白質(zhì)為l1)或l2)所示的蛋白質(zhì)：l1)由genbank號為aac73146.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；l2)由genbank號為aac73146.2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導活性的由l1)衍生的蛋白質(zhì)；所述fixabcx基因簇中的fixa基因編碼的蛋白質(zhì)為m1)或m2)所示的蛋白質(zhì)：m1)由genbank號為aac73146.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；m2)由genbank號為aac73146.2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有fixa蛋白活性的由m1)衍生的蛋白質(zhì)；所述fixabcx基因簇中的fixb基因編碼的蛋白質(zhì)為n1)或n2)所示的蛋白質(zhì)：n1)由genbank號為aac73153.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；n2)由genbank號為aac73153.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有fixb蛋白活性的由n1)衍生的蛋白質(zhì)；所述fixabcx基因簇中的fixc基因編碼的蛋白質(zhì)為p1)或p2)所示的蛋白質(zhì)：p1)由genbank號為aac73154.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；p2)由genbank號為aac73154.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有fixc蛋白活性的由p1)衍生的蛋白質(zhì)；所述fixabcx基因簇中的fixx基因編碼的蛋白質(zhì)為q1)或q2)所示的蛋白質(zhì)：q1)由genbank號為acc73155.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；q2)由genbank號為acc73155.1所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有fixx蛋白活性的由q1)衍生的蛋白質(zhì)。更進一步的，被導入所述受體菌的所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因為b11)-b13)中的任一種dna分子：b11)seqidno2的cnda分子或基因組dna；b12)在嚴格條件下與b11)限定的dna分子雜交且編碼所述γ-丁基甜菜堿羥化酶的cdna分子或基因組dna；b13)與b11)或b12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述γ-丁基甜菜堿羥化酶的cdna分子或基因組dna；被導入所述受體菌的所述肉堿轉(zhuǎn)運蛋白基因為b31)-b33)中的任一種dna分子：b31)seqidno.4的cnda分子或基因組dna；b32)在嚴格條件下與b31)限定的dna分子雜交且編碼所述肉堿轉(zhuǎn)運蛋白的cdna分子或基因組dna；b33)與b31)或b32)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述肉堿轉(zhuǎn)運蛋白的cdna分子或基因組dna；所述α-酮戊二酸脫氫酶基因為c11)-c13)中的任一種dna分子：c11)大腸桿菌k12基因組序列第758706-761507位所示的cnda分子或基因組dna；c12)在嚴格條件下與c11)限定的dna分子雜交且編碼所述α-酮戊二酸脫氫酶的cdna分子或基因組dna；c13)與c11)或c12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述α-酮戊二酸脫氫酶的cdna分子或基因組dna；所述異檸檬酸裂合酶基因為d11)-d13)中的任一種dna分子：d11)大腸桿菌k12基因組序列第4217109-4218413位所示的cnda分子或基因組dna；d12)在嚴格條件下與d11)限定的dna分子雜交且編碼所述異檸檬酸裂合酶的cdna分子或基因組dna；d13)與d11)或d12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述異檸檬酸裂合酶的cdna分子或基因組dna；所述乙酰輔酶a合成酶基因為e11)-e13)中的任一種dna分子：e11)大腸桿菌k12基因組序列第4285413-4287371位所示的cnda分子或基因組dna；e12)在嚴格條件下與e11)限定的dna分子雜交且編碼所述乙酰輔酶a合成酶的cdna分子或基因組dna；e13)與e11)或e12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述乙酰輔酶a合成酶的cdna分子或基因組dna；所述丙酮酸氧化酶基因為g11)-g13)中的任一種dna分子：g11)大腸桿菌k12基因組序列第909331-911049位所示的cnda分子或基因組dna；g12)在嚴格條件下與g11)限定的dna分子雜交且編碼所述丙酮酸氧化酶的cdna分子或基因組dna；g13)與g11)或g12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述丙酮酸氧化酶的cdna分子或基因組dna；所述巴豆甜菜堿還原酶基因為h11)-h13)中的任一種dna分子：h11)大腸桿菌k12基因組序列第39244-40386位所示的cnda分子或基因組dna；h12)在嚴格條件下與h11)限定的dna分子雜交且編碼所述巴豆甜菜堿還原酶的cdna分子或基因組dna；h13)與h11)或h12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述巴豆甜菜堿還原酶的cdna分子或基因組dna；所述甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因為i11)-i13)中的任一種dna分子：i11)大腸桿菌k12基因組序列第37898-39115位所示的cnda分子或基因組dna；i12)在嚴格條件下與i11)限定的dna分子雜交且編碼所述甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶的cdna分子或基因組dna；i13)與i11)或i12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶的cdna分子或基因組dna；所述輔酶a連接酶基因為j11)-j13)中的任一種dna分子：j11)大腸桿菌k12基因組序列第36271-37824位所示的cnda分子或基因組dna；j12)在嚴格條件下與j11)限定的dna分子雜交且編碼所述輔酶a連接酶的cdna分子或基因組dna；j13)與j11)或j12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述輔酶a連接酶的cdna分子或基因組dna；所述巴豆甜菜堿coa水合酶基因為k11)-k13)中的任一種dna分子：k11)大腸桿菌k12基因組序列第35377-36162位所示的cnda分子或基因組dna；k12)在嚴格條件下與k11)限定的dna分子雜交且編碼所述巴豆甜菜堿coa水合酶的cdna分子或基因組dna；k13)與k11)或k12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼所述巴豆甜菜堿coa水合酶的cdna分子或基因組dna；所述肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導基因為l11)-l13)中的任一種dna分子：l11)大腸桿菌k12基因組序列第34781-35371位所示的cnda分子或基因組dna；l12)在嚴格條件下與l11)限定的dna分子雜交且編碼肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導蛋白的cdna分子或基因組dna；l13)與l11)或l12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導蛋白的cdna分子或基因組dna；所述fixabcx基因簇基因為m11)-m13)中的任一種dna分子：m11)大腸桿菌k12基因組序列第42403-45750位所示的cnda分子或基因組dna；m12)在嚴格條件下與m11)限定的dna分子雜交且編碼fixabcx基因簇的cdna分子或基因組dna；m13)與m11)或m12)限定的dna分子具有90％以上的同一性且編碼fixabcx基因簇的cdna分子或基因組dna。上述嚴格條件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。包括與本發(fā)明的編碼上述蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有90％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列?！巴恍浴笨梢杂萌庋刍蛴嬎銠C軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。上述方法中，所述1)中，所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和所述肉堿轉(zhuǎn)運蛋白基因是通過含有γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達盒的重組表達載體導入所述受體菌中。所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達盒是指能夠在宿主細胞中表達γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運蛋白基因的dna，該dna不但可包括啟動γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運蛋白基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運蛋白基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步的，所述表達盒還可包括增強子序列。更進一步的，啟動所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運蛋白基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為pbad啟動子。在本發(fā)明的一個實施例中，所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和所述肉堿轉(zhuǎn)運蛋白基因是通過重組載體pyb1a-bbox-cait導入所述受體菌中。所述重組載體pyb1a-bbox-cait為將pyb1a載體的bglii和psti酶切位點間的片段替換為seqidno.2所示的γ-丁基甜菜堿羥化酶基因，且將psti和ecori位點間的片段替換為seqidno.4所示的肉堿轉(zhuǎn)運蛋白cait基因，且保持pyb1a載體的其他序列不變后得到的載體。所述2)中，所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因是通過含有γ-丁基甜菜堿羥化酶基因的表達盒的重組表達載體導入所述受體菌中。所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因的表達盒是指能夠在宿主細胞中表達γ-丁基甜菜堿羥化酶基因的dna，該dna不但可包括啟動γ-丁基甜菜堿羥化酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止γ-丁基甜菜堿羥化酶基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步的，所述表達盒還可包括增強子序列。更進一步的，啟動所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運蛋白基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為pbad啟動子。在本發(fā)明的另一個實施例中，所述γ-丁基甜菜堿羥化酶基因是通過重組載體pyb1a-bbox導入所述受體菌中；所述重組載體pyb1a-bbox為將pyb1a載體的bglii和psti酶切位點間的片段替換為seqidno.2所示的γ-丁基甜菜堿羥化酶基因，且保持pyb1a載體的其他序列不變后得到的載體。所述1)和所述2)中，所述pbad啟動子的核苷酸序列同專利cn104805047中的核苷酸序列。上述方法中，所述野生型大腸桿菌為大腸桿菌k12。所述大腸桿菌突變體s1是將大腸桿菌k12的α-酮戊二酸脫氫酶基因(suca)替換為兩端帶有frt位點的卡那霉素抗性基因從而將大腸桿菌k12的α-酮戊二酸脫氫酶基因(suca)敲除(缺失)的大腸桿菌k12突變體。所述大腸桿菌突變體s2是將大腸桿菌突變體s1的異檸檬酸裂合酶基因(acea)替換為兩端帶有frt位點的卡那霉素抗性基因從而將大腸桿菌突變體s1的異檸檬酸裂合酶基因(acea)敲除(缺失)的大腸桿菌k12突變體。所述大腸桿菌突變體s3是將大腸桿菌突變體s1的丙酮酸氧化酶基因(poxb)替換為乙酰輔酶a合成酶基因(acs)和卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。所述大腸桿菌突變體s4是將s1△kan(刪除了卡那霉素抗性基因的大腸桿菌突變體s1)的巴豆甜菜堿還原酶基因(caia)、甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因(caib)、輔酶a連接酶基因(caic)、巴豆甜菜堿coa水合酶基因(caid)、肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導基因(caie)構(gòu)成的基因簇整段替換為卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。所述大腸桿菌突變體s5是將大腸桿菌突變體s2的丙酮酸氧化酶基因(poxb)替換為乙酰輔酶a合成酶基因(acs)和卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。所述大腸桿菌突變體s6是將s1△kan的肉堿轉(zhuǎn)運蛋白基因(cait)、巴豆甜菜堿還原酶基因(caia)、甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因(caib)、輔酶a連接酶基因(caic)、巴豆甜菜堿coa水合酶基因(caid)、肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導基因(caie)以及上游的操縱子基因簇(fixabcx)整段替換為卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。所述大腸桿菌突變體s7是將大腸桿菌突變體s6的丙酮酸氧化酶基因(poxb)替換為乙酰輔酶a合成酶基因(acs)和卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。為了解決上述技術問題，本發(fā)明又提供了上述方法制備的產(chǎn)左旋肉堿的重組菌。在本發(fā)明的具體實施例中，產(chǎn)左旋肉堿的重組菌具體為將pyb1a-bbox-cait導入所述大腸桿菌突變體s1得到的重組菌s1/pyb1a-bbox-cait，pyb1a-bbox-cait導入所述大腸桿菌突變體s2得到的重組菌s2/pyb1a-bbox-cait，pyb1a-bbox-cait導入所述大腸桿菌突變體s3得到的重組菌s3/pyb1a-bbox-cait，pyb1a-bbox-cait導入所述大腸桿菌突變體s4得到的重組菌s4/pyb1a-bbox-cait，pyb1a-bbox-cait導入所述大腸桿菌突變體s5得到的重組菌s5/pyb1a-bbox-cait，pyb1a-bbox-cait導入所述大腸桿菌突變體s6得到的重組菌s6/pyb1a-bbox-cait，pyb1a-bbox-cait導入所述大腸桿菌突變體s7得到的重組菌s7/pyb1a-bbox-cait，pyb1a-bbox-cait導入所述大腸桿菌突變體s7得到的重組菌s7/pyb1a-bbox-cait，pyb1a-bbox導入野生型大腸桿菌k12得到的重組菌k12/pyb1a-bbox，pyb1a-bbox導入所述大腸桿菌突變體s1得到的重組菌s1/pyb1a-bbox，pyb1a-bbox-cait導入野生型大腸桿菌k12得到的重組菌k12/pyb1a-bbox-cait。上述方法制備的產(chǎn)左旋肉堿的重組菌在制備左旋肉堿中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。為了解決上述技術問題，本發(fā)明最后提供了一種制備左旋肉堿的方法。本發(fā)明提供的制備左旋肉堿的方法包括將上述產(chǎn)左旋肉堿的重組菌經(jīng)阿拉伯糖誘導培養(yǎng)得到誘導后重組菌，用所述誘導后重組菌催化γ-丁基甜菜堿得到左旋肉堿。上述制備左旋肉堿的方法中，所述阿拉伯糖誘導培養(yǎng)在阿拉伯糖濃度為0.2g/100ml的培養(yǎng)基中進行，所述誘導培養(yǎng)的溫度可為20-37℃，所述誘導培養(yǎng)時間可為10-30小時。進一步的，所述誘導培養(yǎng)的溫度可為30-37℃(如30℃)，所述誘導培養(yǎng)時間可為12-20小時(如16小時)。實驗證明，本發(fā)明所制備的左旋肉堿的重組菌的左旋肉堿的產(chǎn)量為30mm-50mm，具體如下：s1/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為30.62mm，s2/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為34.21mm，s3/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為39.99mm，s4/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為37.37mm，s5/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為31.06mm，s6/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為39.55mm，s7/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為50.67mm。本發(fā)明在大腸桿菌中實現(xiàn)了左旋肉堿的生產(chǎn)，并通過代謝工程改造，解決左旋肉堿合成中輔因子的供給與循環(huán)，從而提高了左旋肉堿的產(chǎn)量。附圖說明圖1為pyb1a的物理圖譜。圖2為s4和s6的pcr驗證。圖2a為s4的pcr驗證。圖2b為s6的pcr驗證。m：marker。圖3為工程菌中γ-丁基甜菜堿羥化酶蛋白表達和肉堿轉(zhuǎn)運蛋白表達的電泳檢測結(jié)果。m：蛋白質(zhì)分子量標準；1：k12/pyb1a-bbox的破碎上清液；2：s1/pyb1a-bbox的破碎上清液；3：k12/pyb1a-bbox-cait的破碎上清液；4：s1/pyb1a-bbox-cait的破碎上清液；5：s2/pyb1a-bbox-cait的破碎上清液；6：s3/pyb1a-bbox-cait的破碎上清液；7：s4/pyb1a-bbox-cait的破碎上清液；8：s5/pyb1a-bbox-cait的破碎上清液；9：s6/pyb1a-bbox-cait的破碎上清液；10：s7/pyb1a-bbox-cait的破碎上清液。圖4為左旋肉堿標準品的hplc圖譜。圖5為s7/pyb1a-bbox-cait全細胞催化轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的hplc圖譜。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。下述實施例中大腸桿菌k12記載于文獻“babat,arat,hasegawam,takaiy,okumuray,babam,datsenkoka,tomitam,wannerbl,morih:constructionofescherichiacolik-12in-frame,single-geneknockoutmutants:thekeiocollection.molsystbiol2006,2:2006.0008.”中，是一株非病原菌，遺傳背景清楚，世代時間短，容易培養(yǎng)且培養(yǎng)基原料低廉。大腸桿菌k12的全基因組序列的genbankaccession為u00096.3(gi：545778205，updatedate是aug01，2014，version是3)。公眾可從中國科學院微生物研究所獲得，該生物材料只為重復本發(fā)明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。下述實施例中的pyb1a載體的核苷酸序列如seqidno.5所示，載體圖譜如圖1所示，包括如下片段：(1)arac-arabad-mcs片段(含阿拉伯糖誘導啟動子、多克隆位點)；(2)p15a復制起始位點片段；(3)氨芐霉素抗性基因ampr片段。下述實施例中的大腸桿菌突變體的基因型如表1所示。其中，大腸桿菌突變體s1、s2、s3和s5均記載于專利cn104805047及文獻“baixuelin,keqiangfan,jianzhao,junjieji,linjunwu,keqianyang*,yongtao*.reconstitutionoftcacyclewithdaocstoengineere.coliintoanefficientwholecellcatalystofpenicilling.procnatlacadsciusa112(32):9855-9(2015).”中，公眾可從中國科學院微生物研究所獲得，該生物材料只為重復本發(fā)明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。表1、大腸桿菌突變體的基因型菌株性狀s1△suca::kans2△suca△acea::kans3△suca△poxb::acs-kans4△suca△caiabcde::kans5△suca△poxb::acs△acea::kans6△suca△caitabcde△fixabcx::kans7△suca△poxb::acs△caitabcde△fixabcx::kan下述實施例中涉及的蛋白及基因序列如下：α-酮戊二酸脫氫酶基因(suca)序列如ecogene：eg10979所示(由2802個核苷酸組成)，α-酮戊二酸脫氫酶基因編碼的α-酮戊二酸脫氫酶的氨基酸序列的genbank：aac73820.1(由933個氨基酸組成)；異檸檬酸裂合酶基因(acea)序列如ecogene：eg10022(由1305個核苷酸組成)，異檸檬酸裂合酶基因編碼的異檸檬酸裂合酶的氨基酸序列的genbank：aac76985.1(由434個氨基酸組成)；乙酰輔酶a合成酶基因(acs)序列如ecogene：eg11448(由1959個核苷酸組成)，乙酰輔酶a合成酶基因編碼的乙酰輔酶a合成酶的氨基酸序列的genbank：aac77039.1(由652個氨基酸組成)；丙酮酸氧化酶基因(poxb)序列如ecogene：eg10754(由1719個核苷酸組成)，丙酮酸氧化酶基因編碼的丙酮酸氧化酶的氨基酸序列的genbank：aac73958.1(由572個氨基酸組成)；巴豆甜菜堿還原酶基因(caia)序列如ecogene：eg11560所示(由1143個核苷酸組成)，巴豆甜菜堿還原酶基因編碼的巴豆甜菜堿還原酶的氨基酸序列的genbank：aac73150.1(由380個氨基酸組成)。甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因(caib)序列如ecogene：eg11559所示(由1218個核苷酸組成)，甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因編碼的甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的genbank：aac73149.1(由405個氨基酸組成)。輔酶a連接酶基因(caic)序列如ecogene：eg11558所示(由1554個核苷酸組成)，輔酶a連接酶基因編碼的輔酶a連接酶的氨基酸序列的genbank：aac73148.2(由517個氨基酸組成)。巴豆甜菜堿coa水合酶基因(caid)序列如ecogene：eg11557所示(由786個核苷酸組成)，巴豆甜菜堿coa水合酶基因編碼的巴豆甜菜堿coa水合酶的氨基酸序列的genbank：aac73147.2(由261個氨基酸組成)。肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導基因(caie)序列如ecogene：eg12608所示(由591個核苷酸組成)，肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導基因編碼的肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導蛋白的氨基酸序列的genbank：aac73146.2(由196個氨基酸組成)。fixabcx基因簇基因序列如大腸桿菌k12基因組序列第42403-45750位所示(由3348個核苷酸組成)，fixabcx基因簇基因序列編碼的fixabcx基因簇的氨基酸序列的genbank分別為aac73152.2、aac73153.1、aac73154.1和aac73155.1(分別由256，313，428和95個氨基酸組成)。實施例1、構(gòu)建表達γ-丁基甜菜堿羥化酶的重組質(zhì)粒pyb1a-bbox構(gòu)建表達γ-丁基甜菜堿羥化酶的重組質(zhì)粒pyb1a-bbox。具體步驟如下：1、以合成的γ-丁基甜菜堿羥化酶基因(seqidno.2所示)為模板，采用引物對psvlb120-bbox-f(bglii)：agcctcgagggtagatctatgggtaacgcaattgctga和psvlb120-bbox-r(ecori)：cagaccgagctcaccgaattcttaacgttgcagcaccagga進行pcr擴增，得到γ-丁基甜菜堿羥化酶的編碼基因(bbox)。pcr條件如下：95℃，5min；95℃，30sec；55℃，30sec(30循環(huán))；72℃，1min；72℃，5min。通過1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小約1190bp，與目的片段相符。2、將步驟1獲得的bbox基因用bglii和ecori酶切，回收bbox基因片段。3、將pyb1a載體用bglii和ecori酶切后，回收載體大片段。4、將步驟2回收的bbox基因片段與步驟3回收的載體大片段用gibson方法(gibsondg,youngl,chuangry,venterjc,hutchisonca,3rd,smithho:enzymaticassemblyofdnamoleculesuptoseveralhundredkilobases.natmethods2009,6:343-345.)進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化t1感受態(tài)細胞(北京全式金生物，產(chǎn)品目錄號為cd501)，涂布于含氨芐霉素的lb固體平板上。37℃過夜，挑取單克隆提取質(zhì)粒，進行pcr驗證，正確的克隆送測序。將測序正確的重組質(zhì)粒命名為重組載體pyb1a-bbox。重組載體pyb1a-bbox為將pyb1a載體的bglii和psti酶切位點間的片段替換為seqidno.2所示的γ-丁基甜菜堿羥化酶基因，且保持pyb1a載體的其他序列不變后得到的載體。seqidno.2(由1158個核苷酸組成)所示的γ-丁基甜菜堿羥化酶基因序列編碼seqidno.1(由385個氨基酸組成)所示的γ-丁基甜菜堿羥化酶。其中，啟動γ-丁基甜菜堿羥化酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為pbad啟動子。實施例2、構(gòu)建表達γ-丁基甜菜堿羥化酶和肉堿轉(zhuǎn)運蛋白的重組質(zhì)粒pyb1a-bbox-cait構(gòu)建表達γ-丁基甜菜堿羥化酶和肉堿轉(zhuǎn)運蛋白的重組質(zhì)粒pyb1a-bbox-cait。具體步驟如下：1、以bw25113基因組為模板，采用引物對psvlb120-bbox-cait-f(ecori)：ctggtgctgcaacgttaagaattcaaggagatataatgaagaatgaaaagag和psvlb120-bbox-cait-r(psti)：ggctgccgcgcggcaccagctgcagttaatctttccagttctgtt進行pcr擴增，得到轉(zhuǎn)運蛋白cait的編碼基因(cait)。pcr條件如下：95℃，5min；95℃，30sec；55℃，30sec(30循環(huán))；72℃，1min；72℃，5min。通過1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小約1500bp，與目的片段相符。2、將步驟1獲得的cait基因用ecori和psti酶切后，回收cait基因片段。3、將實施例1獲得的重組載體pyb1a-bbox用ecori和psti酶切后，回收pyb1a-bbox大片段。4、將步驟2回收的cait基因片段與步驟3回收的pyb1a-bbox大片段用gibson方法(gibsondg,youngl,chuangry,venterjc,hutchisonca,3rd,smithho:enzymaticassemblyofdnamoleculesuptoseveralhundredkilobases.natmethods2009,6:343-345.)進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化t1感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐霉素的lb固體平板上。37℃過夜，挑取單克隆提取質(zhì)粒，進行驗證，正確的克隆送測序。將測序正確的重組質(zhì)粒命名為重組載體pyb1a-bbox-cait。重組載體pyb1a-bbox-cait為將pyb1a載體的bglii和psti酶切位點間的片段替換為seqidno.2所示的γ-丁基甜菜堿羥化酶基因，且將psti和ecori位點間的片段替換為seqidno.4所示的肉堿轉(zhuǎn)運蛋白cait基因，且保持pyb1a載體的其他序列不變后得到的載體。seqidno.2(由1158個核苷酸組成)所示的γ-丁基甜菜堿羥化酶基因序列編碼seqidno.1(由385個氨基酸組成)所示的γ-丁基甜菜堿羥化酶；seqidno.4(由1515個核苷酸組成)所示的肉堿轉(zhuǎn)運蛋白cait基因序列編碼seqidno.3(由504個氨基酸組成)所示的肉堿轉(zhuǎn)運蛋白。重組載體pyb1a-bbox-cait表達γ-丁基甜菜堿羥化酶和肉堿轉(zhuǎn)運蛋白的融合蛋白。其中，啟動γ-丁基甜菜堿羥化酶基因和肉堿轉(zhuǎn)運蛋白基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為pbad啟動子。實施例3、大腸桿菌突變體s1，s2，s3，s4，s5，s6，s7的構(gòu)建本實施例將大腸桿菌k12進行不同的單基因敲除，構(gòu)建s1，s2，s3，s4，s5，s6，s7大腸桿菌突變體。一、大腸桿菌突變體s1，s2，s3，s5的構(gòu)建大腸桿菌突變體s1，s2，s3和s5分別為專利cn104805047中記載的大腸桿菌突變體pg01、pg16、pg03和pg05。具體構(gòu)建方法參見專利cn104805047中的具體步驟。大腸桿菌突變體s1是將大腸桿菌k12的α-酮戊二酸脫氫酶基因(suca)替換為兩端帶有frt位點的卡那霉素抗性基因從而將大腸桿菌k12的α-酮戊二酸脫氫酶基因(suca)敲除(缺失)得到的大腸桿菌k12突變體。s1△kan為刪除了卡那霉素抗性基因的大腸桿菌突變體s1。大腸桿菌突變體s2是將大腸桿菌突變體s1的異檸檬酸裂合酶基因(acea)替換為兩端帶有frt位點的卡那霉素抗性基因從而將大腸桿菌突變體s1的異檸檬酸裂合酶基因(acea)敲除(缺失)得到的大腸桿菌k12突變體。大腸桿菌突變體s3是將大腸桿菌突變體s1的丙酮酸氧化酶基因(poxb)替換為乙酰輔酶a合成酶基因(acs)和卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。所述大腸桿菌突變體s5是將大腸桿菌突變體s2的丙酮酸氧化酶基因(poxb)替換為乙酰輔酶a合成酶基因(acs)和卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。二、大腸桿菌突變體s4的構(gòu)建大腸桿菌突變體s4是將s1△kan(刪除了卡那霉素抗性基因的大腸桿菌突變體s1)的巴豆甜菜堿還原酶基因(caia)、甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因(caib)、輔酶a連接酶基因(caic)、巴豆甜菜堿coa水合酶基因(caid)、肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導基因(caie)構(gòu)成的基因簇整段替換為卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。具體構(gòu)建方法如下：1、宿主菌的制備將大腸桿菌突變體s1中的卡那霉素抗性基因刪除，得到大腸桿菌突變體s1△kan(簡稱s1△kan)。具體刪除方法如下：首先，利用表達flp重組酶的質(zhì)粒pcp20(購自clontech公司)化學轉(zhuǎn)化s1，將s1的frt位點之間的卡那霉素抗性基因刪除，敲除s1的卡那霉素抗性，得到大腸桿菌突變體s1△kan(簡稱s3△kan)。s1△kan在涂布卡那霉素抗性的lb平板(卡那霉素濃度為50μg/ml)上不生長，表明已經(jīng)消除s1的卡那霉素抗性。將pkd46質(zhì)粒(購自clontech公司)通過化學轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化消除了卡那霉素抗性的大腸桿菌突變體s1△kan(簡稱s1△kan)，得到含有質(zhì)粒pkd46的重組大腸桿菌pkd46/s1△kan。重組大腸桿菌pkd46/s1△kan在阿拉伯糖誘導后，表達λ噬菌體的重組蛋白，宿主菌就具有了同源重組的能力。2、s4的構(gòu)建以pkd13質(zhì)粒(購自clontech公司)為模板，采用上游引物caiaup-red-f：agaactggaaagattaattaacccccaaaatatcaagaggttgaaagatgattccggggatccgtcgacc和下游引物caiedown-red-r：atccagcaaccaggtcgcatccggcaagatcaccgtttaggcgtcacagaagttcctatactttctagag進行pcr擴增，得到大小為1382bp的caiaup-kan-caiedown打靶片段。將獲得的caiaup-kan-caiedown片段電轉(zhuǎn)入步驟1獲得的重組大腸桿菌pkd46/s1△kan感受態(tài)細胞中，在含卡那霉素的lb平板上(卡那霉素濃度為50μg/ml)篩選陽性克隆。采用caia-up567-f(tatgctatccagatgatcttcc)和caie-d326-r(cacagaaataagctgcgaagttaag)進行pcr驗證(引物結(jié)合位點分別是大腸桿菌caia基因的上游和caie基因的下游區(qū)域，陽性克隆的擴增產(chǎn)物大小為2300bp)，pcr鑒定結(jié)果如圖2a所示，正確的克隆送測序。將測序正確的克隆命名為大腸桿菌突變體s4，基因型為△suca△caiabcde-kan。測序結(jié)果表明：s4的基因組上沒有caiabcde片段。三、大腸桿菌突變體s6的構(gòu)建大腸桿菌突變體s6是將s1△kan(刪除了卡那霉素抗性基因的大腸桿菌突變體s1)的肉堿轉(zhuǎn)運蛋白基因(cait)、巴豆甜菜堿還原酶基因(caia)、甜菜堿/肉堿輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因(caib)、輔酶a連接酶基因(caic)、巴豆甜菜堿coa水合酶基因(caid)、肉堿消旋酶及肉堿脫水酶活性誘導基因(caie)以及上游的操縱子基因簇(fixabcx)整段替換為卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。具體構(gòu)建方法如下：1、宿主菌的制備將pkd46質(zhì)粒(購自clontech公司)通過化學轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化消除了卡那霉素抗性的大腸桿菌突變體s1△kan(簡稱s1△kan)，得到含有質(zhì)粒pkd46的重組大腸桿菌pkd46/s1△kan。重組大腸桿菌pkd46/s1△kan在阿拉伯糖誘導后，表達λ噬菌體的重組蛋白，宿主菌就具有了同源重組的能力。2、s6的構(gòu)建以pkd13質(zhì)粒為模板，采用上游引物fixxdown-red-f(tcagtgcggcgttacgtatcaaaccaacatcagccgtaacggacctccacaattccggggatccgtcgacc)和下游引物caiedown-red-r(atccagcaaccaggtcgcatccggcaagatcaccgtttaggcgtcacagaagttcctatactttctagag)進行pcr擴增，擴增得到大小為1383bp的fixxdown-kan-caiedown打靶片段。將獲得的fixxdown-kan-caiedown打靶片段電轉(zhuǎn)入步驟1獲得的重組大腸桿菌pkd46/s1△kan感受態(tài)細胞中，利用含卡那霉素的lb平板上(卡那霉素濃度為50μg/ml)，篩選陽性克隆。采用fixx-d346-f(gatatcacgccgatggcgatg)和caie-d326-r(cacagaaataagctgcgaagttaag)進行pcr驗證(引物結(jié)合位點分別是大腸桿菌caie基因的下游和fixx基因的下游區(qū)域，陽性克隆的擴增產(chǎn)物大小為2100bp)，pcr鑒定結(jié)果如圖2b所示，正確的克隆送測序。將測序正確的克隆命名為大腸桿菌突變體s6，基因型為△suca△fixabcx△caitabcde-kan。測序結(jié)果表明：s6的基因組上沒有fixabcx-caitabcde片段。四、大腸桿菌突變體s7的構(gòu)建大腸桿菌突變體s7是將大腸桿菌突變體s6的丙酮酸氧化酶基因(poxb)替換為乙酰輔酶a合成酶基因(acs)和卡那霉素抗性基因得到的大腸桿菌k12突變體。具體構(gòu)建方法如下：1、宿主菌的制備按照步驟二的1中的方法將s3的frt位點之間的卡那霉素抗性基因刪除，得到大腸桿菌突變體s3△kan(簡稱s3△kan)。2、s7的構(gòu)建以pkd13質(zhì)粒為模板，采用上游引物fixxdown-red-f(tcagtgcggcgttacgtatcaaaccaacatcagccgtaacggacctccacaattccggggatccgtcgacc)和下游引物caiedown-red-r(atccagcaaccaggtcgcatccggcaagatcaccgtttaggcgtcacagaagttcctatactttctagag)進行pcr擴增，擴增得到大小為1383bp的fixxdown-kan-caiedown打靶片段。將fixxdown-kan-caiedown打靶片段電轉(zhuǎn)入重組大腸桿菌pkd46/s3△kan感受態(tài)細胞中，利用含卡那霉素的lb平板上(卡那霉素濃度為50μg/ml)，篩選陽性克隆。將測序正確的克隆命名為大腸桿菌突變體s7，基因型為△suca△poxb::acs△fixabcx△caitabcde-kan。測序結(jié)果表明：s7的基因組上沒有fixabcx-caitabcde片段。實施例4、基因工程菌的構(gòu)建將實施例1和實施例2中構(gòu)建的表達載體pyb1a-bbox或pyb1a-bbox-cait用化學轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌k12及實施例3中構(gòu)建的大腸桿菌突變體s1，s2、s3、s4、s5、s6或s7，在含氨芐霉素的lb平板(氨芐霉素的濃度為50μg/ml)上篩選陽性克隆。其中，將pyb1a-bbox轉(zhuǎn)化大腸桿菌k12得到的陽性克隆菌株命名為k12/pyb1a-bbox；pyb1a-bbox轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變體s1得到的陽性克隆菌株命名為s1/pyb1a-bbox；pyb1a-bbox-cait轉(zhuǎn)化大腸桿菌k12得到的陽性克隆菌株命名為k12/pyb1a-bbox-cait；pyb1a-bbox-cait轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變體s1得到的陽性克隆菌株命名為s1/pyb1a-bbox-cait；pyb1a-bbox-cait轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變體s2得到的陽性克隆菌株命名為s2/pyb1a-bbox-cait；pyb1a-bbox-cait轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變體s3得到的陽性克隆菌株命名為s3/pyb1a-bbox-cait；pyb1a-bbox-cait轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變體s4得到的陽性克隆菌株命名為s4/pyb1a-bbox-cait；pyb1a-bbox-cait轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變體s5得到的陽性克隆菌株命名為s5/pyb1a-bbox-cait；pyb1a-bbox-cait轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變體s6得到的陽性克隆菌株命名為s6/pyb1a-bbox-cait；pyb1a-bbox-cait轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變體s7得到的陽性克隆菌株命名為s7/pyb1a-bbox-cait。實施例5、工程菌的誘導培養(yǎng)及全細胞催化生成左旋肉堿一、工程菌的誘導培養(yǎng)以實施例4中構(gòu)建的10株菌中的任一株菌單獨為工程菌，均同時進行如下實驗：將工程菌劃線到含有質(zhì)量百分比濃度為1.6％的瓊脂和濃度為100μg/ml的氨芐霉素的lb平板上，37℃培養(yǎng)12小時，挑取平板上所長的單克隆，接種到含有濃度為100μg/ml氨芐霉素的液體lb培養(yǎng)基中，37℃過夜震蕩培養(yǎng)8-10小時。轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘；將過夜培養(yǎng)物以體積百分比為2％的接種量接種至裝有150ml2yt培養(yǎng)基(蛋白胨16g/l，酵母膏：10g/l，氯化鈉5g/l，100μg/ml氨芐霉素)的容量為250ml擋板三角瓶中，37℃以200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速震蕩生長4小時后，加入阿拉伯糖(阿拉伯糖的濃度為0.2g/100ml)，30℃以200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速誘導培養(yǎng)16小時，得到誘導后的細胞。實驗重復三次，每次每種工程菌3瓶。離心收集到的菌體采用超聲波破碎，得到細胞破碎液，對細胞破碎液進行離心分別取上清液進行sds-page分析。結(jié)果如圖3所示。本發(fā)明構(gòu)建的如下7種工程菌：s1/pyb1a-bbox-cait、s2/pyb1a-bbox-cait、s3/pyb1a-bbox-cait、s4/pyb1a-bbox-cait、s5/pyb1a-bbox-cait、s6/pyb1a-bbox-cait和s7/pyb1a-bbox-cait均表達得到大小為43kda的γ-丁基甜菜堿羥化酶和56kda的肉堿轉(zhuǎn)運蛋白。二、全細胞催化生成左旋肉堿及其產(chǎn)量檢測將步驟一獲得的誘導后的細胞，在8000轉(zhuǎn)/分鐘、4℃條件下離心10min，收集菌體；然后先用預冷的生理鹽水(0.85％氯化鈉水溶液)洗滌兩次，再用轉(zhuǎn)化底物液重懸，使其最終od600nm值為30。轉(zhuǎn)化底物液配方如下：100mmtris-hcl(調(diào)ph7.5)，50mmγ-丁基甜菜堿鹽酸鹽(調(diào)ph7.5)，1％葡萄糖，1mmfe2+，1mmvc。轉(zhuǎn)化條件為30℃條件下，1ml轉(zhuǎn)化底物液于50ml大試管中進行全細胞催化6h。轉(zhuǎn)化反應完成后，取反應體系，檢測其中的左旋肉堿含量，具體步驟如下：(1)取反應體系，常溫、12000rpm離心2min，收集上清液。(2)用蒸餾水稀釋上清液10倍，經(jīng)0.22μm濾膜過濾得到上樣液。(3)取上樣液，采用高效液相色譜法hplc檢測左旋肉堿含量。色譜柱：agilentxdb-c18；流動相：a液：10mm辛烷磺酸鈉，0.125％kh2po4，0.125％k2hpo4(磷酸調(diào)ph3.0)；b液：100％乙腈；a液：b液＝92:8(v:v)；流速：0.3ml/min；溫度：25℃；檢測器：dad；檢測波長：210nm；進樣量10ul；hplc系統(tǒng)：agilent1260。以左旋肉堿標準品(上海藍木化工有限公司，selleckchemicalsllcs2388)保留時間定性和采用標準曲線法(外標法)進行定量分析。實驗設置三次重復，結(jié)果取平均值。左旋肉堿標準品的hplc圖譜如圖4所示，從圖中可見，左旋肉堿標準品的保留時間為20.4min。各菌株催化結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明上述7株工程菌的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的hplc圖譜中均有保留時間為20.4min的左旋肉堿的峰。其中，s7/pyb1a-bbox-cait的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的hplc圖譜如圖5所示。結(jié)果表明：k12/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為1.21mm。s1/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為30.62mm，說明敲除suca后，有利于提高左旋肉堿的產(chǎn)量；s2/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為34.21mm，s3/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿的產(chǎn)量為39.99mm，s4/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿的產(chǎn)量為37.37mm，三個雙敲菌株轉(zhuǎn)化均高于單敲suca菌，說明敲除suca和acea，敲除suca且將poxb替換為acs以及敲除suca和caiabcde基因簇，均有助于提高左旋肉堿的轉(zhuǎn)化。s5/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為31.06mm，s6/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿產(chǎn)量為39.55mm，說明在雙敲菌(suca和acea)基礎上進一步敲除基因poxb替換為acs，或進一步敲除基因簇fixabcx也有利于左旋肉堿的轉(zhuǎn)化。在s6基礎上進一步敲除基因poxb替換為acs得到s7菌株，s7/pyb1a-bbox-cait的左旋肉堿的產(chǎn)量為50.67mm，底物100％被轉(zhuǎn)化，說明組合△suca△poxb::acs△caitabcde△fixabcx性狀，對產(chǎn)左旋肉堿有利，可大大提高全細胞轉(zhuǎn)化的效率。表2、各個工程菌的左旋肉堿含量工程菌左旋肉堿產(chǎn)量(mm)左旋肉堿產(chǎn)量(g/l)k12/pyb1a-bbox0.1±0.020.016±0.003s1/pyb1a-bbox0.3±0.040.048±0.006k12/pyb1a-bbox-cait1.21±1.580.20±0.25s1/pyb1a-bbox-cait30.62±0.674.94±0.11s2/pyb1a-bbox-cait34.21±4.045.52±0.65s3/pyb1a-bbox-cait39.99±2.906.45±0.47s4/pyb1a-bbox-cait37.37±3.206.02±0.52s5/pyb1a-bbox-cait31.06±2.815.01±0.45s6/pyb1a-bbox-cait39.55±5.136.37±0.83s7/pyb1a-bbox-cait50.67±0.588.17±0.09序列表<110>中國科學院微生物研究所<120>產(chǎn)左旋肉堿的重組菌及其構(gòu)建方法與應用<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>385<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1metglyasnalailealaasptyrargthrpheproleuileserpro151015leualaseralaalaserphealaglyglyvalservalthrtrpala202530aspglyargvalserprophehisasnleutrpleuargaspasncys354045procysglyaspcysvaltyrgluvalthrarggluglnvalpheleu505560valalaaspvalprogluaspileglnvalglnalavalthrilegly65707580glyaspglyargleuvalvalglntrpaspaspglyhisalaserala859095tyrhisproglytrpleuargalahisalatyraspalaglnserleu100105110alagluargglualaalaargprohislyshisargtrpmetglngly115120125leuserleuprovaltyrasphisglyalavalmetglnaspaspasp130135140thrleuleuglutrpleuleualavalargaspvalglyleuthrgln145150155160leuhisglyvalprothrgluproglyalaleuileproleualalys165170175argileserpheilearggluserasnpheglyvalleupheaspval180185190argserlysalaaspalaaspserasnalatyrthralapheasnleu195200205proleuhisthraspleuprothrarggluleuglnproglyleugln210215220pheleuhiscysleuvalasnaspalathrglyglyasnserthrphe225230235240valaspglyphealailealaglualaleuargileglualaproala245250255alatyrargleuleucysgluthrprovalglupheargasnlysasp260265270arghisserasptyrargcysthralaprovalilealaleuaspser275280285serglygluvalarggluileargleualaasnpheleuargalapro290295300pheglnmetaspalalysargmetproasptyrtyrleualatyrarg305310315320argpheileglnmetthrarggluproargphecysphethrargarg325330335leuglualaglyglnleutrpcyspheaspasnargargvalleuhis340345350alaargaspalapheaspproalaserglyasparghispheglngly355360365cystyrvalaspargaspgluleuleuserargileleuvalleugln370375380arg385<210>2<211>1158<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atgggtaacgcaattgctgattatcgcacctttccgctgatctctccgctggcaagtgcg60gcctccttcgcaggcggtgtcagtgtgacgtgggcggatggtcgcgtttccccgtttcat120aacctgtggctgcgtgacaattgcccgtgtggcgattgcgtttacgaagtcacccgtgaa180caggtgttcctggttgcggacgtcccggaagatattcaggtgcaagccgttacgatcggc240ggtgatggtcgcctggtggttcagtgggatgacggtcatgcgtcagcctatcacccgggc300tggctgcgtgcacacgcttacgatgcccaatcgctggcagaacgtgaagcagctcgcccg360cataaacaccgctggatgcagggtctgagcctgccggtgtatgatcatggcgcagttatg420caagatgacgataccctgctggaatggctgctggcggtccgtgatgtgggtctgacccag480ctgcacggtgtgccgacggaaccgggcgccctgattccgctggcaaaacgtatttcattt540atccgcgaatcgaactttggcgttctgttcgatgtccgcagcaaagcggacgccgattct600aacgcctataccgcatttaatctgccgctgcataccgatctgccgacccgtgaactgcaa660ccgggtctgcaattcctgcactgcctggttaacgacgccaccggcggtaatagtacgttt720gtcgatggcttcgcaattgctgaagcactgcgtatcgaagcaccggcggcatatcgtctg780ctgtgcgaaaccccggttgaatttcgtaacaaagaccgccatagcgattaccgctgtacg840gctccggtcattgcgctggatagctctggtgaagtgcgtgaaatccgcctggctaatttt900ctgcgtgcgccgttccagatggacgctaaacgtatgccggattattacctggcatatcgt960cgctttattcagatgacccgtgaaccgcgcttttgcttcacgcgtcgcctggaagccggc1020caactgtggtgtttcgacaatcgtcgcgtgctgcatgctcgcgacgcgtttgatccggcg1080agcggtgatcgtcacttccagggctgttacgttgaccgtgatgaactgctgtctcgcatc1140ctggtgctgcaacgttaa1158<210>3<211>504<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3metlysasnglulysarglysthrglyilegluprolysvalphephe151015proproleuileilevalglyileleucystrpleuthrvalargasp202530leuaspalaalaasnvalvalileasnalavalphesertyrvalthr354045asnvaltrpglytrpalapheglutrptyrmetvalvalmetleuphe505560glytrpphetrpleuvalpheglyprotyralalyslysargleugly65707580asngluproproglupheserthralasertrpilephemetmetphe859095alasercysthrseralaalavalleuphetrpglyserilegluile100105110tyrtyrtyrileserthrpropropheglyleugluproasnserthr115120125glyalalysgluleuglyleualatyrserleuphehistrpglypro130135140leuprotrpalathrtyrserpheleuservalalaphealatyrphe145150155160phephevalarglysmetgluvalileargproserserthrleuval165170175proleuvalglyglulyshisalalysglyleupheglythrileval180185190aspasnphetyrleuvalalaleuilephealametglythrserleu195200205glyleualathrproleuvalthrglucysmetglntrpleuphegly210215220ileprohisthrleuglnleuaspalaileileilethrcystrpile225230235240ileleuasnalailecysvalalacysglyleuglnlysglyvalarg245250255ilealaseraspvalargsertyrleuserpheleumetleuglytrp260265270valpheilevalserglyalaserpheilemetasntyrphethrasp275280285servalglymetleuleumettyrleuproargmetleuphetyrthr290295300aspproilealalysglyglypheproglnglytrpthrvalphetyr305310315320trpalatrptrpvaliletyralaileglnmetserilepheleuala325330335argileserargglyargthrvalarggluleucyspheglymetval340345350leuglyleuthralaserthrtrpileleutrpthrvalleuglyser355360365asnthrleuleuleuileasplysasnileileasnileproasnleu370375380ilegluglntyrglyvalalaargalaileilegluthrtrpalaala385390395400leuproleuserthralathrmettrpglyphepheileleucysphe405410415ilealathrvalthrleuvalasnalacyssertyrthrleualamet420425430serthrcysarggluvalargaspglyglugluproproleuleuval435440445argileglytrpserileleuvalglyileileglyilevalleuleu450455460alaleuglyglyleulysproileglnthralaileilealaglygly465470475480cysproleuphephevalasnilemetvalthrleuserpheilelys485490495aspalalysglnasntrplysasp500<210>4<211>1515<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4atgaagaatgaaaagagaaaaacgggaatagaaccgaaggttttctttccgccgttaata60atcgtcggcatactttgttggcttacagtcagagatctggatgcagcgaatgtcgttatt120aatgctgtattcagttacgtcaccaatgtatggggatgggcatttgaatggtatatggtg180gtgatgcttttcggttggttctggctggtgtttggcccgtatgccaaaaagcgtttaggt240aacgaaccgccagaatttagcaccgccagttggatctttatgatgttcgcctcctgtacg300tctgctgccgtactgttctggggatcgattgagatctactactacatctccaccccgccg360tttggcttagaaccgaactcgacaggggcgaaagagttggggctggcttacagcttgttc420cactggggacctctgccgtgggccacttacagcttcctttcagtcgccttcgcttacttc480ttctttgtccgcaaaatggaagtgattcgccccagctcgacactggtgccgctggtaggt540gaaaaacacgccaaagggttgttcggcactatcgtcgacaacttctatctcgtcgccttg600atcttcgcgatgggtaccagtctgggccttgccacgccgctggtgaccgagtgtatgcaa660tggttgtttggcattccgcataccctgcaactggacgctatcatcattacctgctggatt720atcctcaacgccatttgcgtcgcttgcggtctgcaaaaaggggtacgtatcgccagtgac780gtgcgtagttacctgagcttcctgatgctgggttgggtgttcattgtcagcggtgccagc840ttcatcatgaactacttcaccgattcggtggggatgttgctgatgtatctgccgcgcatg900ttgttctataccgatcccatcgctaaaggcggcttcccgcagggctggaccgtgttctac960tgggcatggtgggtgatttatgctatccagatgagtatcttcctcgcccgcatctcccgt1020ggtcgtactgtgcgtgaactgtgcttcggcatggtgctggggctgacagcgtcaacctgg1080atcctgtggactgtactcggtagtaacactctgctgttgatagataaaaacatcatcaac1140attccaaatctgatcgaacagtacggtgtggcgcgcgccatcattgaaacctgggccgct1200ctgccactcagcaccgccaccatgtggggcttcttcatcctctgctttattgccaccgtt1260acgctggttaacgcctgctcttataccctggcgatgtccacttgccgcgaagtacgcgat1320ggtgaagaaccacctctgctggtgcgtatcggttggtcaattctggttggcattatcggt1380attgttctgctggcgctcggcggcctgaaaccgattcaaaccgccattatcgccggagga1440tgcccgctgttcttcgtcaacattatggtgacgctctcctttattaaagacgcgaaacag1500aactggaaagattaa1515<210>5<211>3528<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aatgtgcctgtcaaatggacgaagcagggattctgcaaaccctatgctactccgtcaagc60cgtcaattgtctgattcgttaccaattatgacaacttgacggctacatcattcacttttt120cttcacaaccggcacggaactcgctcgggctggccccggtgcattttttaaatacccgcg180agaaatagagttgatcgtcaaaaccaacattgcgaccgacggtggcgataggcatccggg240tggtgctcaaaagcagcttcgcctggctgatacgttggtcctcgcgccagcttaagacgc300taatccctaactgctggcggaaaagatgtgacagacgcgacggcgacaagcaaacatgct360gtgcgacgctggcgatatcaaaattgctgtctgccaggtgatcgctgatgtactgacaag420cctcgcgtacccgattatccatcggtggatggagcgactcgttaatcgcttccatgcgcc480gcagtaacaattgctcaagcagatttatcgccagcag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