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腫瘤能量代謝與化療耐藥

來(lái)源：泰然健康網(wǎng) 時(shí)間：2024年12月17日 18:54

NOX4 functions as a mitochondrial energetic sensor coupling cancer metabolic reprogramming to drug resistance Nat Commun. 2017 Oct 19;8(1):997. doi: 10.1038/s41467-017-01106-1 IF=12.124

背景

NOX4作為線粒體能量感應(yīng)器，將腫瘤代謝重編程和治療耐藥聯(lián)系起來(lái)。cancer metabolic reprogramming腫瘤代謝重編程，是新近關(guān)于腫瘤代謝的新名詞，是指腫瘤細(xì)胞糖代謝主要以無(wú)氧糖酵解為主，不同于正常細(xì)胞有氧氧化磷酸化的產(chǎn)生ATP的高效率（32個(gè)ATP），無(wú)氧糖酵解只能產(chǎn)生少量的ATP（2個(gè)）和產(chǎn)生大量乳酸，消耗大量能量。不明白為什么腫瘤細(xì)胞采取效率更低下的無(wú)氧糖酵解，只好給它命名warburg效應(yīng)。

沃伯格效應(yīng)(Warburg effect) 是由德國(guó)生物化學(xué)家奧托·沃伯格(Otto Warburg,1883～1970）于1930年發(fā)現(xiàn)的。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生能量的方式極為特別: 健康細(xì)胞依靠線粒體氧化糖類分子釋放出有用的能量, 而大多數(shù)腫瘤細(xì)胞則通過(guò)通過(guò)產(chǎn)能率相對(duì)較低糖酵解作用為自身供能。這種作用機(jī)制不需要氧氣也不需要線粒體參與。惡性，生長(zhǎng)迅速的腫瘤細(xì)胞通常的糖酵解率比他們的正常組織高達(dá)200倍。這種情況，即使在氧氣充足的條件下也會(huì)發(fā)生。奧托華寶推測(cè)這種變化的代謝是癌癥的根本原因。

warburg效應(yīng)示意圖：正常組織在有氧條件下都通過(guò)線粒體的氧化磷酸化代謝葡萄糖，而腫瘤細(xì)胞和增生較快速的組織，即使在有氧的條件下，也通過(guò)糖酵解的方式代謝，產(chǎn)生大量乳酸和少量ATP。

NOX4，作為NADPH氧化酶（一種ATP-biding motif）內(nèi)一個(gè)亞基，論文結(jié)果顯示當(dāng)ATP與motif結(jié)合的時(shí)候，會(huì)影響NOX4的活性。那么NOX4的功能是什么？它是如何影響化療耐藥的呢？

線粒體內(nèi)NOX4可以產(chǎn)生ROS，無(wú)氧糖酵解產(chǎn)生大量活性氧自由基（ROS），ROS會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的增生和凋亡。調(diào)節(jié)NOX4上下游的位點(diǎn)需要進(jìn)一步研究。

NOX4的耐藥表型實(shí)驗(yàn)：NOX4是否調(diào)節(jié)化療耐藥？

細(xì)胞模型：renal cell carcinoma腎細(xì)胞癌，腎癌多由于von Hippel–Lindau (VHL) 基因的突變?nèi)笔隆ＤI癌對(duì)化療藥物非常不敏感，天然的耐藥細(xì)胞模型。

786-O腎癌模型，stably transfected with shVector and shNOX4，利用shNOX敲減細(xì)胞模型內(nèi)NOX4的表達(dá)水平。

A498腎癌模型，transiently transfected with Scr and siNOX4，瞬時(shí)抑制NOX4表達(dá)水平。

檢測(cè)方法：上述細(xì)胞模型給予依托泊苷藥物處理后，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞凋亡的檢測(cè)Annexin V staning、細(xì)胞流式儀、western檢測(cè)cleaved PRAP（PARP又是細(xì)胞凋亡核心成員胱天蛋白酶(caspase)的切割底物）。

抑制細(xì)胞內(nèi)NOX4后，細(xì)胞凋亡比率明顯升高，同時(shí)裂解的PARP也增多，提示凋亡增多。癌細(xì)胞內(nèi)NOX4活性較高，對(duì)依托泊苷耐藥。

除此之外，還對(duì)下述問(wèn)題進(jìn)行簡(jiǎn)答：

1、是線粒體內(nèi)的NOX4導(dǎo)致的耐藥嗎？NOX4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜都有定位，到底是哪兒的NOX4介導(dǎo)的耐藥。

專門針對(duì)線粒體NOX4的干擾方法：利用mitotempol藥物處理細(xì)胞，專門清除掉線粒體超氧化酶，包括NOX4。然后在檢測(cè)依托泊苷處理細(xì)胞后凋亡情況。

2、線粒體內(nèi)ATP水平會(huì)影響耐藥嗎？因?yàn)橹敖Y(jié)果顯示ATP增多會(huì)抑制NOX4活性。

調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)ATP的方法：786-O培養(yǎng)液中加入半乳糖會(huì)增加線粒體內(nèi)ATP；VHL轉(zhuǎn)染缺失VHL的腎癌細(xì)胞會(huì)增加其線粒體內(nèi)的ATP水平。

3、NOX4在ATP介導(dǎo)的耐藥過(guò)程中是充分必要條件嗎？whether NOX4 is neccesary and sufficient to mediated drug Resistance。

設(shè)計(jì)突變的NOX4，使得ATP不能與其結(jié)合，觀察ATP對(duì)耐藥的影響。與雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)異曲同工。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NOX4的耐藥表型：動(dòng)物水平NOX4是否導(dǎo)致耐藥？

動(dòng)物模型：裸鼠移植瘤模型，上述細(xì)胞水平的細(xì)胞模型，注射與裸鼠皮下，成瘤后，給予依托泊苷化療，觀察瘤體體積的變化。

786-O轉(zhuǎn)染shVector的細(xì)胞注射于裸鼠左側(cè)腹部皮下，5周后成瘤，測(cè)量體積。

786-O轉(zhuǎn)染shNOX4的細(xì)胞注射于裸鼠右側(cè)腹部皮下，……。

檢測(cè)方法：成瘤模型成功后，給予依托泊苷化療4天，每天測(cè)量瘤體體積共8天。以8天的體積比上化療前體積，作為最后顯示數(shù)值。同時(shí)為了驗(yàn)證主要是因?yàn)榈蛲鲈黾樱皇窃錾鷾p弱，還檢測(cè)的凋亡指標(biāo)：cleaved PRAP（western）和cleaved caspase-3（免疫組化）。

a圖顯示抑制NOX4后腫瘤體積不再增加，b和C檢測(cè)了凋亡相關(guān)指標(biāo)cleaved PRAP和caspase-3。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平證實(shí)NOX4影響化療耐藥。

人體水平是否有證據(jù)：NOX4導(dǎo)致耐藥？

取腎癌組織和周圍正常組織，分離線粒體，檢測(cè)線粒體內(nèi)NOX4表達(dá)水平，腎癌組織與正常組織相比，NOX4表達(dá)升高。

共取了4例腎癌和周圍正常組織，檢測(cè)其線粒體內(nèi)NOX4，癌組織線粒體中NOX4明顯增高。

細(xì)胞模型（ex vivo實(shí)驗(yàn)）：腎癌原代細(xì)胞模型，取腎癌組織，分離原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后利用siNOX4瞬時(shí)抑制細(xì)胞內(nèi)NOX4表達(dá)水平。給予多柔比星后，測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。

3例腎癌患者癌細(xì)胞原代培養(yǎng)，siRNA干擾NOX4后，給予多柔比星，觀察細(xì)胞凋亡。注意分組情況，四組。

NOX4調(diào)節(jié)耐藥的下游靶基因，深入分子機(jī)制

PKM2：丙酮酸激酶2，參與糖酵解的最后一步，既往顯示其與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡相關(guān)。推測(cè)PKM2可能為NOX4調(diào)節(jié)的靶基因。

1、PKM2是否調(diào)節(jié)藥物治療敏感性：siPKM2抑制786-O和A498細(xì)胞PKM2，細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡增加，assembly shNOX4。

2、PKM2是否被NOX4調(diào)節(jié)：PKM2表達(dá)在shNOX4抑制NOX4后，明顯降低。

3、NOX4是否通過(guò)抑制PKM2的乙?；Ｗo(hù)PKM2被降解：背景PKM2常常被乙?；缓笕苊阁w吞噬消化乙?；腜KM2。shNOX4抑制786-O細(xì)胞后，檢測(cè)PKM2乙?；癄顟B(tài)，乙酰化的PKM2明顯增多，乙?；腜KM2可以通過(guò)乙?；贵w檢測(cè)。

4、PKM2是否是被溶酶體吞噬消化降解：采用溶酶體降解抑制劑3-M抑制細(xì)胞內(nèi)溶酶體降解通路，觀察PKM2被降解減少，殘留PKM2增多。

5、溶酶體降解既然參與PKM2的降解，且PKM2是調(diào)節(jié)化療藥物的敏感性，那么溶酶體通路是否會(huì)影響到化療耐藥呢？shNOX4的786-O細(xì)胞對(duì)依托泊苷藥物敏感，但是如果用3-M抑制溶酶體降解通路后，其對(duì)依托泊苷敏感性明顯下降。（因?yàn)镻KM2滯留）

6、PKM2被乙?；窹ACF在K350位點(diǎn)乙?；?，然后被溶酶體降解。那么乙?；窹ACF是否影響腎癌細(xì)胞的化療耐藥: a、 siPACF干擾786-O細(xì)胞PACF的表達(dá)，給予依托泊苷后，檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化，凋亡減少，出現(xiàn)耐藥，且檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PKM2表達(dá)增高。b、突變PACF乙?；稽c(diǎn)K450R（賴氨酸-精氨酸），乙?；窹ACF不能發(fā)揮作用，shNOX4的786-O細(xì)胞，對(duì)依托泊苷敏感性增強(qiáng)，當(dāng)轉(zhuǎn)染PKM-K350R，對(duì)藥物敏感性恢復(fù)耐藥。

線粒體NOX4被ATP調(diào)節(jié)：NOX4的上游通路

我會(huì)怎么做：將細(xì)胞模型與或不與ATP共培養(yǎng)，觀察線粒體NOX4功能變化，其中線粒體NOX4生物功能為產(chǎn)生ROS，那么檢測(cè)加不加ATP后ROS的產(chǎn)生量，即可驗(yàn)證ATP調(diào)控NOX4。

作者1、明確NOX4定位在線粒體、2、線粒體有脂質(zhì)體雙層膜，NOX4是位于內(nèi)膜還是外模、3、NOX4是否影響ROS的產(chǎn)生、4、最后才是ATP是否影響ROS的產(chǎn)生。

線粒體NOX4是能量代謝的感受器：

如何將細(xì)胞內(nèi)ATP含量、NOX4活性和ROS聯(lián)系起來(lái)？癌細(xì)胞由于wanburg效應(yīng)，采用細(xì)胞漿內(nèi)糖酵解的能量代謝方式，而不是采用在線粒體內(nèi)氧化磷酸化，由于產(chǎn)能較低，細(xì)胞內(nèi)ATP水平下降，線粒體內(nèi)NOX4感受不到ATP的刺激，活性增強(qiáng)，ROS產(chǎn)生增多。而NOX4活性增強(qiáng)，會(huì)保護(hù)PKM2被溶酶體降解，最終PKM2抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致藥物耐藥。