如何“繞開抗體”實(shí)時(shí)檢測(cè)植物內(nèi)源蛋白？近日，上海交通大學(xué)陸鈺明教授課題組在國(guó)際權(quán)威期刊Plant Communications在線發(fā)表了題為“Rapid and dynamic detection of endogenous proteins through in-locus tagging in rice”的研究論文。該研究將新型熒光素酶系統(tǒng)與基因敲入技術(shù)結(jié)合，在植物上建立了一種無需抗體、超快速、高通量地動(dòng)態(tài)檢測(cè)植物內(nèi)源蛋白的新技術(shù)——TagBIT。

利用該團(tuán)隊(duì)前期開發(fā)的高效片段敲入技術(shù)（TR-HDR），TagBIT系統(tǒng)將只有11個(gè)氨基酸的新型蛋白標(biāo)簽HiBiT原位敲入至目標(biāo)蛋白的N/C端（原位標(biāo)簽，In-locus tagging）；然后利用篩選得到新型熒光素底物“Fluorofurimazine”開發(fā)了適用于植物的熒光素酶反應(yīng)體系。對(duì)10+個(gè)水稻內(nèi)源蛋白進(jìn)行的實(shí)時(shí)追蹤實(shí)驗(yàn)表明，TagBIT可實(shí)現(xiàn)各種類型的蛋白研究，對(duì)內(nèi)源蛋白實(shí)現(xiàn)：（1）超快速的Western blot（無需抗體）；（2）像GUS/GFP一樣的原位發(fā)光成像；（3）像Luciferase一樣的酶動(dòng)力學(xué)動(dòng)態(tài)追蹤；（4）像Flag一樣的高效的co-IP和質(zhì)譜檢測(cè)互作蛋白。值得注意的是，TagBIT技術(shù)通過原位標(biāo)簽，繞開了傳統(tǒng)的基因克隆和載體構(gòu)建限制，首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)水稻超大基因TOR（~26k）的動(dòng)態(tài)檢測(cè)和蛋白互作研究。

研究團(tuán)隊(duì)首先設(shè)計(jì)了一個(gè)用于N端標(biāo)記的通用的供體DNA序列，并選擇了3個(gè)候選基因：MDH2、TT1和SLR1。在使用商業(yè)HiBiT蛋白檢測(cè)試劑盒的初步試驗(yàn)中，他們遇到了信號(hào)強(qiáng)度低和穩(wěn)定性有限等問題，這對(duì)于TT1和SLR1等大量中低豐度蛋白的檢測(cè)構(gòu)成了挑戰(zhàn)。HiBiT系統(tǒng)由Promega公司開發(fā)并商業(yè)化應(yīng)用，其檢測(cè)靈敏度已經(jīng)非常高，要在該基礎(chǔ)上進(jìn)一步提升檢測(cè)效率非常困難。研究團(tuán)隊(duì)通過大量研究，另辟蹊徑地篩選采用了一種新型熒光素底物——Fluorofurimazine；并根據(jù)植物組織的特點(diǎn)系統(tǒng)性優(yōu)化了整個(gè)酶促反應(yīng)體系。最終的檢測(cè)結(jié)果表明，系列優(yōu)化使該超高靈敏度檢測(cè)系統(tǒng)又進(jìn)一步大幅提升了近7倍。這一重大改進(jìn)，使植物上大量的低豐度內(nèi)源蛋白的檢測(cè)成為可能。

利用TagBIT系統(tǒng)，研究團(tuán)隊(duì)首先發(fā)展了超快速的Western Blot體系。由于該技術(shù)無需抗體，可轉(zhuǎn)膜后直接顯影（無需反復(fù)洗滌和抗體孵育），極大地簡(jiǎn)化了整個(gè)免疫印跡過程。動(dòng)態(tài)檢測(cè)應(yīng)用上，研究人員成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)赤霉素信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白SLR1豐度的動(dòng)態(tài)追蹤。盡管赤霉素GA3刺激SLR1的mRNA水平上升，但TagBIT酶促分析顯示蛋白水平在40分鐘內(nèi)急劇下降61.6%，揭示了mRNA與蛋白質(zhì)豐度不一致的現(xiàn)象。這項(xiàng)技術(shù)為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)植物蛋白豐度提供了有效手段。

研究?jī)?nèi)源蛋白的時(shí)空分布對(duì)于理解其功能至關(guān)重要。傳統(tǒng)的免疫化學(xué)染色技術(shù)依賴于特異性抗體進(jìn)行空間檢測(cè)，在植物中常常面臨挑戰(zhàn)；而基于轉(zhuǎn)基因的（GFP標(biāo)記）檢測(cè)方法由于其異位效應(yīng)，往往不能準(zhǔn)確反應(yīng)內(nèi)源蛋白的真實(shí)時(shí)空分布。HiBiT標(biāo)簽因其發(fā)光特性，在哺乳動(dòng)物研究中顯示出用于原位蛋白可視化的潛力，但需要另一配體蛋白LgBiT，因此植物上尚無相關(guān)研究。為了解決這一問題，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了表達(dá)LgBiT的轉(zhuǎn)基因系（LgBiT-OE）并得到了穩(wěn)定的T1代后代。為了測(cè)試這種方法，他們以水稻中具有根特異性表達(dá)的基因Lsi2為目標(biāo)蛋白，構(gòu)建了Lsi2-TagBIT原位標(biāo)簽株系。將其與LgBiT-OE雜交后，對(duì)F1代幼苗（Lsi2-TagBIT×LgBiT-OE）進(jìn)行了原位生物發(fā)光檢測(cè)。將F1代幼苗浸入Fluorofurimazine溶液中，并用冷凍CCD相機(jī)成像，揭示了Lsi2在根部的特定定位，證實(shí)了該方法的有效性。這種通用的雜交策略實(shí)現(xiàn)了植物蛋白的有效原位可視化，并為闡明植物內(nèi)源蛋白分布提供了一種多功能工具。

研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探究了TagBIT技術(shù)在檢測(cè)植物內(nèi)源蛋白-蛋白互作（PPIs）方面的應(yīng)用潛力。盡管HiBiT和LgBiT具有出強(qiáng)烈的相互作用，但其實(shí)驗(yàn)表明單獨(dú)的LgBiT并未能有效沉淀目標(biāo)蛋白，這表明此類應(yīng)用需要額外的相互作用強(qiáng)度。因此，他們采用抗HiBiT抗體進(jìn)行co-IP實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)內(nèi)源TagBIT蛋白及其互作蛋白。他們選擇了雷帕霉素靶蛋白（TOR）基因作為研究對(duì)象，該基因?qū)τ谀芰看x、作物產(chǎn)量、抗病性和耐逆性至關(guān)重要，并且由于其龐大的基因長(zhǎng)度（約26kb），研究起來頗具挑戰(zhàn)。研究團(tuán)隊(duì)通過原位標(biāo)簽，成功獲得TagBIT-TOR基因編輯植株。接著，在T3代幼苗上使用HiBiT抗體進(jìn)行了co-IP實(shí)驗(yàn)。通過質(zhì)譜分析共沉淀產(chǎn)物，揭示了772個(gè)潛在互作蛋白，證實(shí)了TagBIT系統(tǒng)的有效性。這項(xiàng)研究首次為水稻內(nèi)源TOR的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)提供了基礎(chǔ)信息，表明TagBIT技術(shù)是闡明大型基因編碼的內(nèi)源蛋白之間互作的可行方法。

田益夫博士為本文第一作者，上海交通大學(xué)陸鈺明教授和南方科技大學(xué)朱健康院士為通訊作者。該研究得到了科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金和博新計(jì)劃等項(xiàng)目資助。另外，該技術(shù)可以成為“水稻全基因組蛋白標(biāo)簽計(jì)劃”的重要技術(shù)組成，有力推動(dòng)“功能蛋白”研究。

“水稻全基因組蛋白標(biāo)簽計(jì)劃（RPTP）”簡(jiǎn)介

2020年11月13日，上海交大陸鈺明教授聯(lián)合李家洋院士、 韓斌院士和美國(guó)科學(xué)院朱健康院士、 Pamela Ronald院士在Molecular Plant雜志在線發(fā)表了一篇題為“Rice Protein Tagging Project: A Call for International Collaborations on Genome Wide in-locus Tagging of Rice Proteins”的論文，提出了一項(xiàng)名為“水稻全基因組蛋白標(biāo)簽計(jì)劃（RPTP）”的倡議，旨在通過國(guó)際合作，在全基因組范圍內(nèi)為水稻的每一個(gè)蛋白編碼基因原位融合一個(gè)蛋白標(biāo)簽，該計(jì)劃有望促進(jìn)以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的分子機(jī)理研究。

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