本申請涉及檢測領(lǐng)域，具體涉及檢測體內(nèi)貝那魯肽（beinaglutide）的新型分析方法及其血漿樣品處理方法。

背景技術(shù)：

1、糖尿病是全世界范圍內(nèi)的慢性疾病，glp-1類藥物作為降糖減肥的重要藥物類別，近年來備受關(guān)注并取得了顯著的發(fā)展。目前，針對glp-1受體為靶點的藥物開發(fā)已成為降糖藥物研究的主流，大多藥物為國外研發(fā)。仁會生物歷經(jīng)十七年研發(fā)，獲批上市了中國糖尿病領(lǐng)域內(nèi)的第一個創(chuàng)新藥，貝那魯肽注射液（商品名“誼生泰”），該藥也是全球目前首個且唯一的全人源glp-1類藥物，長期使用不易產(chǎn)生抗體，產(chǎn)品安全性更高。貝那魯肽的氨基酸序列與人體內(nèi)glp-1相同，正是由于二者的氨基酸序列完全相同，因此在進(jìn)行藥代動力學(xué)樣品分析時，想要準(zhǔn)確定量貝那魯肽藥物的血藥濃度面臨著挑戰(zhàn)，即如果要區(qū)分內(nèi)源性glp-1物質(zhì)和貝那魯肽藥物，存在著一定的難度。

2、與傳統(tǒng)藥物相比，glp-1類藥物屬于生物技術(shù)藥物，在進(jìn)行藥代動力學(xué)研究時，這類藥物與小分子藥物不同，容易受到內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，進(jìn)而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，常規(guī)的檢測方法在分析這類藥物時，在特異性、靈敏度和準(zhǔn)確度上都面臨著挑戰(zhàn)。由于是生物藥物，一般在檢測時會首先選擇免疫方法學(xué)，即利用抗原抗體特異性結(jié)合來檢測目標(biāo)藥物，該方法靈敏度非常高，但是容易受到內(nèi)源性類似物及其代謝物的干擾。針對本申請的貝那魯肽，目前的檢測方法是采用酶聯(lián)免疫（elisa）法進(jìn)行血藥濃度檢測。由于該藥物的氨基酸序列和人體內(nèi)的glp-1完全一致，也就意味著elisa方法肯定會受到內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。因此進(jìn)行貝那魯肽藥物定量時，需要先定量空白基質(zhì)中g(shù)lp-1的基線濃度，然后測定給藥后glp-1+貝那魯肽藥物的總濃度，通過總濃度減去空白基線的濃度來評估貝那魯肽的pk曲線。由于引入了2次計算，因此給貝那魯肽的絕對定量也帶來了不確定性因素。同時elisa方法所用試劑盒也比較昂貴，由于受內(nèi)源性干擾，方法重現(xiàn)性上也存在一定的風(fēng)險。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本申請充分利用了液質(zhì)聯(lián)用儀器的優(yōu)勢，一方面使得內(nèi)源性的glp-1與貝那魯肽藥物實現(xiàn)了分離，同時又經(jīng)過前處理方法以及所有試劑和耗材的優(yōu)化，以及質(zhì)譜儀器的信號優(yōu)化，使得該方法達(dá)到了elisa方法學(xué)的靈敏度，甚至更優(yōu)一些。

2、為了有效地檢測貝那魯肽的血液濃度，本申請?zhí)峁┝巳缦聦嵤┓桨福?/p>

3、在第一方面，本申請?zhí)峁┝艘环N用于檢測貝那魯肽的血漿樣品預(yù)處理方法，其包括：

4、a)在含有貝那魯肽的血漿樣品中加入內(nèi)標(biāo)；

5、b)在步驟a)的血漿樣品中加入提取溶液進(jìn)行沉淀，并取上清液；以及

6、c)對步驟b)獲得的上清液進(jìn)行固相萃取，以獲得用于檢測的血漿樣品，其中所述內(nèi)標(biāo)為exendin-4。

7、在第二方面，本申請?zhí)峁┝艘环N用于檢測貝那魯肽的方法，其包括：

8、a)提供通過第一方面所述的方法獲得的血漿樣品；

9、b)通過lc-ms/ms分析測量所述血漿樣品中貝那魯肽的濃度。

10、本申請的技術(shù)建立了一種準(zhǔn)確可靠的檢測血基質(zhì)中貝那魯肽的新型分析方法。本技術(shù)的優(yōu)勢包括以下的至少一項：

11、1、特異性好，能夠解決內(nèi)源性glp-1的干擾問題；

12、2、穩(wěn)健且重現(xiàn)性好，檢測成本低；

13、3、靈敏度高，滿足臨床項目檢測要求。

技術(shù)特征：

1.一種用于檢測貝那魯肽的血漿樣品預(yù)處理方法，其包括：

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相萃取利用固相萃取(spe)板進(jìn)行，并且所述固相萃取板為oasis max。

3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述固相萃取采用淋洗液除去多余物質(zhì)，并且采用洗脫液將貝那魯肽洗脫下來。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述淋洗液為超純水和/或體積比為10：90的甲醇：超純水。

5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述血漿樣品是冷凍保藏的，并且所述血漿樣品被反復(fù)凍融不超過3次。

6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述提取溶液為體積比為50：50：0.1的乙腈：甲醇：氨水。

7.一種用于檢測貝那魯肽的方法，其包括：

8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述lc-ms/ms分析采用waters，ace excel 3 aq，4.6×50 mm色譜柱。

9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述lc-ms/ms分析采用質(zhì)譜離子對660.800→752.200進(jìn)行。

10.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中在所述lc-ms/ms分析中，流動相包括a相和b相，a相為超純水并且b相為體積比為1000：0.5的乙腈：甲酸。

技術(shù)總結(jié)
本申請涉及一種用于檢測貝那魯肽的方法及其血漿樣品處理方法。本申請通過優(yōu)化不同液質(zhì)聯(lián)用儀、液質(zhì)條件、色譜柱以及前處理的方法，建立了一種高靈敏度、高特異性、高通量且穩(wěn)定可靠的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC?MS/MS)法，定量檢測血漿基質(zhì)中貝那魯肽的濃度。

技術(shù)研發(fā)人員：張懷敬,高丹娜,王雪莉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：軍科正源（北京）藥物研究有限責(zé)任公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/8/13

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