本發(fā)明涉及微生物及農(nóng)產(chǎn)品加工領(lǐng)域，具體而言，涉及一種黑木耳破壁方法。
背景技術(shù)：
：黑木耳(auriculariaauricula-judae)又稱木耳、耳子、光木耳，屬真菌門擔子菌綱，營養(yǎng)極為豐富，被譽為“人體清道夫”和“食品阿司匹林”。是我國珍貴的藥食膠質(zhì)真菌，在我國多數(shù)地區(qū)都有生產(chǎn)，年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量90％以上?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)證實黑木耳具有抗凝血、抗腫瘤、抗炎癥等細胞保護作用，還具有降低血脂、血糖、血液粘稠、膽固醇以及抗糖尿病、抗衰老、抗輻射、抗疲勞等多種生理功能，同時還能促進核酸、蛋白質(zhì)的生物合成并預(yù)防多種老年性疾病。近年來已經(jīng)成為食品、醫(yī)療、保健等領(lǐng)域研究和開發(fā)應(yīng)用的熱點。但是，由于黑木耳子實體細胞壁較厚，其關(guān)鍵組分幾丁質(zhì)及少量葡聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使其質(zhì)地異常堅韌，破壁難度遠遠大于植物細胞、細菌細胞等，人體消化吸收效果較差。有研究表明，通常情況下，食用木耳的吸收利用率只有40％左右，只有通過破壁，才可以大幅度提高黑木耳在人體內(nèi)的吸收率及生物利用度。目前木耳破壁的方法主要有：機械法、酸堿法、酶解技術(shù)等。采用機械法、酸堿法破壁，設(shè)備投資大，對環(huán)境污染嚴重，運行成本高，破壁不完全。而采用酶解破壁的方法，由于黑木耳細胞壁結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，尚缺乏專一性的酶。如需要破壁完全，常需要使用多種酶：如溶菌酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶等，導(dǎo)致成本高、工藝復(fù)雜。因此，尋找一種更簡單、更有效、成本更低的黑木耳破壁的方法，是很有意義的。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服黑木耳子實體細胞壁堅固，食用后吸收利用率低的不足，本發(fā)明的目的是提供一株具有分泌幾丁質(zhì)酶能力的暹羅芽孢桿菌及其在黑木耳破壁方面的應(yīng)用，從而促使黑木耳子實體中的營養(yǎng)成分充分溶出，大幅度提高黑木耳的生物利用率。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)：本發(fā)明涉及一種黑木耳破壁方法，包括：將黑木耳與暹羅芽孢桿菌酶液共孵育，酶解破壁；所述暹羅芽孢桿菌菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：cgmccno.12903；保藏時間為：2016年8月24日。該菌種拉丁學(xué)名為bacillussiamensis，中文學(xué)名為暹羅芽孢桿菌，菌株名為jaashd，從吉林省水稻主產(chǎn)區(qū)健康仔豬的新鮮糞樣中分離獲得。上述的經(jīng)過分離純化的暹羅芽孢桿菌，采用lb培養(yǎng)基，恒溫37℃培養(yǎng)時間24小時，鏡檢菌體呈桿狀，直徑大約為0.5～0.6μm×1.3～2.9μm；平板生長出菌落呈奶白色，圓形，微凸，濕潤光滑，邊緣整齊。另外，對于該菌株，經(jīng)過純化后測序，其16srdna序列如seqidno:1所示。優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述暹羅芽孢桿菌酶液的制備方法包括：將暹羅芽孢桿菌發(fā)酵液離心，取上清液即得。優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述暹羅芽孢桿菌發(fā)酵液為將所述暹羅芽孢桿菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)得到，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為lb培養(yǎng)基；優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述lb培養(yǎng)基的成分包括：蛋白胨8～12g/l、酵母粉2～4g/l、氯化鈉4～6g/l、葡萄糖2～4g/l；ph＝6.2～7.0。優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，將所述暹羅芽孢桿菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：35℃～42℃，搖床150～240rpm，od600值0.8～1.0時終止培養(yǎng)。優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述暹羅芽孢桿菌酶液的制備方法還包括，將所述上清液過濾除菌。優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述黑木耳磨成粉后再與所述暹羅芽孢桿菌酶液共孵育。優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述暹羅芽孢桿菌發(fā)酵液中活菌數(shù)≥2億/ml。優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述黑木耳與所述暹羅芽孢桿菌酶液的添加比例為10～30g：100ml。優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述酶解的條件為36℃～38℃酶解24h～48h。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：該暹羅芽孢桿菌菌株對于黑木耳子實體具有很好的破壁效果，同時，具有操作簡單、成本低、工藝穩(wěn)定、設(shè)備投入少等優(yōu)勢，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為暹羅芽孢桿菌jaashd系統(tǒng)發(fā)育樹。本申請?zhí)峁┑腻吡_芽孢桿菌(bacillussiamensis)，菌株名為jaashd，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏時間為：2016年8月24日，保藏編號cgmccno.12903。經(jīng)保藏中心于2016年8月24日檢測為存活菌株。具體實施方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例11、菌株初篩采集吉林省各地健康仔豬新鮮糞樣10份，分別稱取10g樣品，加入90ml無菌生理鹽水，制備成樣品懸液，經(jīng)80℃水浴處理后，取100μl10-2、10-3、10-4稀釋液涂布于lb培養(yǎng)基平板上，每個梯度涂布三個平行，恒溫37℃培養(yǎng)48小時，然后采用平板劃線法，純化芽孢桿菌菌株，分別編號保存。獲得122株芽孢桿菌。2、產(chǎn)幾丁質(zhì)酶芽孢桿菌初步篩選將分離得到的菌株點種到上述以幾丁質(zhì)粉為唯一碳源的分離平板上，37℃培養(yǎng)16～48小時，如果生長出的菌落周邊出現(xiàn)透明水解圈，說明培養(yǎng)基中幾丁質(zhì)已經(jīng)被菌株分泌的酶水解，進而證明菌株具有分泌幾丁質(zhì)酶的能力。經(jīng)過初步篩選，得到4株具有幾丁質(zhì)酶分泌能力的菌株，對其進行進一步篩選分析。3、黑木耳破壁菌的進一步篩選將上述分離得到4株具有幾丁質(zhì)酶分泌能力的菌株點種到上述以黑木耳粉為唯一碳源的分離平板上，37℃培養(yǎng)16～48小時，如果生長出的菌落周邊出現(xiàn)透明水解圈，說明培養(yǎng)基中黑木耳粉已經(jīng)被菌株分泌的酶水解，進而證明菌株具有黑木耳破壁的能力。4、黑木耳破壁能力檢測采用上述菌株的菌懸液或發(fā)酵液粗提物處理黑木耳粉，以可溶性物質(zhì)含量作為破壁效果的評價指標，篩選出破壁能力強的菌株。經(jīng)過進一步篩選及破壁能力檢測，得到1株具有較好黑木耳破壁能力的菌株，命名為jaashd，并對其進行進一步鑒定。5、菌株鑒定按照“伯杰細菌鑒定手冊”(第八版)和“常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊”(東秀珠，蔡妙英等編著，北京：科學(xué)出版社，2001.2)中描述菌種分類鑒定的方法，對菌株jaashd進行形態(tài)特征、培養(yǎng)特性和生理生化特性鑒定，具體結(jié)果如下：采用lb培養(yǎng)基，恒溫37℃培養(yǎng)時間24小時，鏡檢菌體呈桿狀，直徑大約為0.5～0.6μm×1.3～2.9μm；平板生長出菌落呈奶白色，圓形，微凸，邊緣整齊。生理生化特征：結(jié)果如表1、2所示。表1暹羅芽孢桿菌jaashd生理生化試驗特性指標結(jié)果特性指標結(jié)果氧化酶+三丁酸甘油脂水解-精氨酸雙水解酶-硝酸鹽還原-明膠水解+七葉靈水解+淀粉水解+酪素水解+過氧化氫酶+tween80水解-吲哚實驗-檸檬酸利用-脲酶-h2s生成-vp實驗+厭氧生長+10％nacl+50℃生長+14％nacl+ph4.5生長-55℃生長+備注：-表示陰性反應(yīng)；+表示陽性反應(yīng)，+-表示弱陽性反應(yīng)。表2暹羅芽孢桿菌jaashd糖發(fā)酵試驗檢測項目結(jié)果檢測項目結(jié)果甘油+七葉靈+d-阿拉伯糖-水楊苷+d-核糖+d-纖維二糖+d-木糖+d-麥芽糖+d-葡萄糖+d-乳糖+d-果糖+d-蜜二糖-肌醇+d-蔗糖+甘露醇+d-松三糖+山梨醇+d-棉籽糖+α-甲基-d-葡萄糖苷+淀粉+n-乙酰葡糖胺+糖原+苦杏仁苷+d-龍膽二糖+海藻糖-松二糖-熊果苷+l-阿拉伯醇+-備注：-表示陰性反應(yīng)；+表示陽性反應(yīng)，+-表示弱陽性反應(yīng)。6、分子生物學(xué)特性提取jaashd的總dna，以其為模板，利用細菌16srdna通用引物進行pcr擴增，得到長度約為1.5kb的擴增產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物回收，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序公司進行測序。測得的序列如seqidno:1所示。將測序結(jié)果與gen-bank序列同源性比較，然后用軟件mega5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖1所示)，以確定菌株的種屬關(guān)系。同源性分析結(jié)果表明，菌株jaashd與bacillusssiamensisstrainpd-a10(genbank登錄號nr_117274.1)同源性為99％，并處于系統(tǒng)發(fā)育樹同一分支。基于菌體形態(tài)特征、生長條件、生理生化、16srdna鑒定結(jié)果特征，將菌株jaashd鑒定為bacillusssiamensis。建議的分類命名為暹羅芽孢桿菌；該菌株已于2016年8月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為cgmccno.12903。實施例2暹羅芽孢桿菌jaashd破壁黑木耳粉的制備粗酶液制備：將菌株jaashd接種于lb液體發(fā)酵培養(yǎng)基，置于35℃搖床，240rpm，搖到od600值0.8取出。在6000rpm條件下離心20min，棄沉淀，上清液在0.22um條件下過濾，即得粗酶液。所述lb液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：蛋白胨12g/l、酵母粉2g/l、氯化鈉4g/l、葡萄糖2g/l，去離子水1000ml；ph＝6.2。121℃高壓滅菌20min。對黑木耳子實體破壁：將黑木耳粉按10％(w/v)加入粗酶液，輕輕搖勻后，36℃～38℃靜止酶解24h后烘干，制得破壁的黑木耳粉。實施例3暹羅芽孢桿菌jaashd破壁黑木耳粉的制備粗酶液制備：將菌株jaashd接種于lb液體發(fā)酵培養(yǎng)基，置于42℃搖床，150rpm，搖到od600值1.0取出。在10000rpm條件下離心15min，棄沉淀，上清液在0.22um條件下過濾，即得粗酶液。所述lb液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：蛋白胨8g/l、酵母粉4g/l、氯化鈉6g/l、葡萄糖4g/l，去離子水1000ml；ph＝7.0。121℃高壓滅菌20min。對黑木耳子實體破壁：將黑木耳粉按30％(w/v)加入粗酶液，輕輕搖勻后，36℃～38℃靜止酶解48h后烘干，制得破壁的黑木耳粉。實施例4暹羅芽孢桿菌jaashd破壁黑木耳粉的制備粗酶液制備：將菌株jaashd接種于lb液體發(fā)酵培養(yǎng)基，置于37℃搖床，200rpm，搖到od600值0.9取出。在8000rpm條件下離心20min，棄沉淀，上清液在0.22um條件下過濾，即得粗酶液。所述lb液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：蛋白胨10g/l、酵母粉3g/l、氯化鈉5g/l、葡萄糖3g/l，去離子水1000ml；ph＝6.8。121℃高壓滅菌20min。對黑木耳子實體破壁：將黑木耳粉按20％(w/v)加入粗酶液，輕輕搖勻后，36℃～38℃靜止酶解36h后烘干，制得破壁的黑木耳粉。實驗例暹羅芽孢桿菌jaashd對黑木耳破壁能力的檢測1)按實施例4的方法制備得到粗酶液。準確稱取1.00g黑木耳粉兩份，一份加入100ml粗酶液搖勻，另一份加入100ml實施例4中的lb發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對照，37℃條件下保溫60min，然后分別在8000rpm條件下離心20min。各取濾液20ml，分別在50～80℃烘干至恒重，以可溶性物質(zhì)含量作為黑木耳破壁效果的評價標準。計算方法為：可溶性物質(zhì)含量(％)＝干重×5×100/黑木耳粉重量。通過測定，加入空白培養(yǎng)基的對照可溶性物質(zhì)含量為0.98％，而加入jaashd菌株發(fā)酵濾液的可溶性物質(zhì)含量達到62.83％，證明該菌株的代謝產(chǎn)物對黑木耳有很好的破壁效果。2)準確稱取1.00g黑木耳粉兩份，一份加入100ml實施例4中的lb發(fā)酵培養(yǎng)基，并接入菌株jaashd。另一份加入100ml實施例4中的lb發(fā)酵培養(yǎng)基做為空白對照。置于35～42℃搖床，150～240rpm，搖至od600值0.8～1.0取出。分別在8000rpm條件下離心20min。各取濾液20ml，分別在50～80℃烘干至恒重，以可溶性物質(zhì)含量作為黑木耳破壁效果的評價標準。計算方法為：可溶性物質(zhì)含量(％)＝干重×5×100/黑木耳粉重量。通過測定，空白對照的可溶性物質(zhì)含量為0.91％，而加入jaashd菌株的樣品可溶性物質(zhì)含量達到60.76％，證明該菌株對黑木耳有很好的破壁效果。最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。sequencelisting<110>吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>一種黑木耳破壁方法<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1508<212>dna<213>bacillussiamensis<400>1agagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagc60ggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaa120cctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttga180accgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcg240cattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagag300ggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagg360gaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggtttt420cggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcacctt480gacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtag540gtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtct600gatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgca660gaagaggagggtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacacc720agtggcgaaggcgactctctggtcggtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcg780aacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttaggggg840tttccgccccttagtgcggcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgc900aagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaaccggtggagcatgtggtttaa960ttcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatgctctgccaatcctagagatag1020gacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagcccgtgtcgtg1080agatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagt1140tgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatc1200atcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcagaacaaagggcagcg1260aaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaac1320tcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgctgcggtgaatacgt1380tcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggt1440gaggtaatctttatggagccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgta1500acaaggta1508當前第1頁12

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