熱烈祝賀河北科技師范學(xué)院 陳教授及其團(tuán)隊(duì)研究成果榮登Environmental Science Nano（IF=7.7，中科院1區(qū)）

題目：Metabonomics-assisted label-free quantitative proteomic and transcriptomic analysis reveals novel insights into the antifungal effect of graphene oxide for controlling Fusarium graminearum

期刊：Environmental Science Nano

影響因子：7.7

研究背景

       真菌病原體禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum，F(xiàn)G）是鐮刀菌枯萎?。?Fusarium head blight，F(xiàn)HB）的病原體，鐮刀菌是一種影響小麥和其他谷物（例如玉米）生產(chǎn)的全球性嚴(yán)重植物病。FG不僅造成作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重大損失，而且還會(huì)產(chǎn)生霉菌毒素，幾乎破壞了受感染田間生產(chǎn)的所有谷物。傳統(tǒng)上，最有效的方法是使用殺真菌劑（如多菌靈）進(jìn)行化學(xué)控制，但是，農(nóng)業(yè)中長(zhǎng)期過(guò)度使用化學(xué)藥品已經(jīng)引起了許多嚴(yán)重的問(wèn)題，包括增加的真菌抗性，化學(xué)殘留物以及對(duì)環(huán)境和健康的危害。真菌對(duì)某些傳統(tǒng)殺真菌劑產(chǎn)生的抗性使控制真菌的生長(zhǎng)更加困難，鑒于當(dāng)前控制措施的局限性以及FHB 對(duì)重要經(jīng)濟(jì)作物的嚴(yán)重影響，開(kāi)發(fā)有效控制這些疾病的替代劑已迫在眉睫。

氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）作為一種新型的抗植物病原體的抗菌劑開(kāi)始被研究，并且被認(rèn)為在農(nóng)業(yè)科學(xué)中具有巨大的發(fā)展前景。之前已有文章對(duì)GO的抗菌作用進(jìn)行了研究，然而對(duì)于GO的抗真菌模式仍然未知。

       為了探究GO的抗菌機(jī)制，作者利用轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)地研究了GO對(duì)重要的植物病原真菌禾谷鐮孢（FG）菌株P(guān)H-1的抗真菌活性，探討其抗菌機(jī)制，以便更好的利用G0服務(wù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和改善環(huán)境。

實(shí)驗(yàn)思路

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.  GO處理可以減少FG菌株P(guān)H-1的分支和生物量

       用GO處理FG菌株P(guān)H-1，通過(guò)對(duì)菌絲分支和生物量的統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)隨著GO濃度的增加，菌絲分支和菌絲體生物量都有明顯的減少，說(shuō)明GO影響菌株的生長(zhǎng)和發(fā)育。

圖1 菌絲分支/生物量隨GO濃度變化

2. 菌絲體在GO處理后喪失了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性

       作者利用SEM和TEM觀(guān)察菌絲體對(duì)GO處理的超微結(jié)構(gòu)變化。根據(jù)SEM圖像觀(guān)察到對(duì)照中的菌絲體保持了其膜結(jié)構(gòu)的完整性，大多數(shù)菌絲體在GO處理后喪失了其細(xì)胞完整性，并變得伸長(zhǎng)或扁平化。同時(shí)TEM圖像顯示，GO處理后，菌絲體細(xì)胞壁的電子密度降低，細(xì)胞壁分層不明顯。此外，GO處理的菌絲體細(xì)胞中有更多的大隔室；還可以看出GO處理后菌絲中存在許多液泡，并且可以觀(guān)察到膜融合的現(xiàn)象，這可能是由于GO處理引起的細(xì)胞膜通透性的變化。先前的研究表明，由于石墨烯與脂質(zhì)分子之間的強(qiáng)相互作用，GO可以從大腸桿菌膜中破壞性提取磷脂。由此，可以推測(cè)GO可以幫助從菌絲體中破壞性提取磷脂并影響膜通透性，從而導(dǎo)致胞質(zhì)外滲，繼而在處理過(guò)的菌絲中形成較大的隔室。

圖2 GO處理后的SEM 與TEM 圖像信息

3. 定量RT-PCR揭示GO濃度對(duì)菌株的影響

       作者進(jìn)一步檢測(cè)了與菌絲體發(fā)育和分支相關(guān)的幾個(gè)基因的表達(dá)水平，并且進(jìn)行應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)。通過(guò)改變GO濃度，檢測(cè)了septins，Pods，MAP激酶和Myo2等與菌絲體的發(fā)育和分支密切相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)隨著GO濃度的升高，這些基因的表達(dá)量明顯降低；與應(yīng)激相關(guān)的基因uspA1，uspA2和Sim表達(dá)量隨濃度的升高有明顯的升高；抑制細(xì)胞增殖的基因RAS2，隨著GO濃度增加表達(dá)量也逐步增加。諸如此類(lèi)，這些基因表達(dá)量的變化均表明GO處理能降低菌株細(xì)胞活力，減少菌株菌絲體的分支和生物量。

圖3 RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)

4. 蛋白質(zhì)組學(xué)要說(shuō)的故事

a) 通過(guò)Label-free無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)，作者發(fā)現(xiàn)不同GO濃度處理，從根本上改變了菌株的基因本體條目，使菌株體蛋白表達(dá)水平發(fā)生了大的變化。其中，與細(xì)胞、代謝過(guò)程、細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)、催化活性、細(xì)胞過(guò)程等相關(guān)的蛋白質(zhì)，以及應(yīng)激蛋白和膜封閉蛋白的變化較為明顯。

b) 通過(guò)對(duì)差異蛋白的分析聚類(lèi)，作者發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)主要參與能量、糖、氨基酸和N-聚糖的生物合成、脂肪酸代謝等途徑。這些結(jié)果表明GO處理影響離子通道以及核苷酸和脂質(zhì)代謝蛋白，這與菌絲體脫水，DNA和RNA含量降低以及細(xì)胞壁合成密切相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)與表型結(jié)果一致。

c) 此外，作者進(jìn)一步分析這些差異蛋白，發(fā)現(xiàn)部分差異蛋白的變化對(duì)維持菌株的生命活性起著重要的作用。即為了在不同濃度的GO處理下存活，F(xiàn)G菌株P(guān)H-1可能會(huì)降低蛋白質(zhì)表達(dá)以及某些不必要的生理和生化反應(yīng)，這一現(xiàn)象值得進(jìn)一步研究。

d) 差異蛋白 KEGG富集分析結(jié)果表明，GO處理導(dǎo)致FG菌株P(guān)H-1中與組氨酸代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)蓄積，這可能是GO在FG菌株P(guān)H-1上的抗真菌反應(yīng)之一，而對(duì)組織特異性模塊中蛋白質(zhì)的COG分析表明，參與脂質(zhì)合成的蛋白質(zhì)減少可能是GO對(duì)FG菌株P(guān)H-1的另一種抗真菌反應(yīng)。

圖4  對(duì)照組與GO處理菌株FG株pH-1的蛋白質(zhì)組學(xué)比較分析

圖5 不同濃度氧化石墨烯處理的FG株P(guān)H-1蛋白表達(dá)層次聚類(lèi)分析

圖6  COG分析

5. 代謝組學(xué)分析 

       最后作者從代謝組學(xué)分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，GO處理后海藻糖含量增加，而海藻糖被認(rèn)為是真菌的主要碳源，并且是發(fā)芽初期真菌中的重要抗應(yīng)激物質(zhì)，表明海藻糖可當(dāng)作禾谷鐮刀菌響應(yīng)GO處理的一種生物標(biāo)志物。GO處理后組氨酸的含量增加，也表明FG遭受GO誘導(dǎo)的應(yīng)激。此外，作為真菌細(xì)胞壁的重要成分，脂質(zhì)在GO處理后含量顯著下降。這可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁成分減少，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁不健康。 這與作者的SEM和TEM觀(guān)察結(jié)果一致。

圖7代謝組學(xué)分析

       在這項(xiàng)工作中，作者研究了GO在基因、蛋白質(zhì)組和代謝水平三個(gè)層面上抑制FG菌株P(guān)H-1的生長(zhǎng)和分支的分子抗真菌機(jī)制。在基因水平上，基因的異常表達(dá)會(huì)抑制菌絲體的分支和成熟，從而降低菌絲體的生物量；在代謝水平上， GO處理能引起代謝途徑和組氨酸代謝的富集，推測(cè)組氨酸代謝可能是GO在蛋白質(zhì)水平上的抗真菌反應(yīng)之一，是應(yīng)激反應(yīng)的生物標(biāo)志物；在蛋白水平上，參與細(xì)胞壁合成的脂質(zhì)蛋白的數(shù)量在蛋白質(zhì)水平上降低，影響菌絲體細(xì)胞壁合成。通過(guò)本次工作，作者提出GO對(duì)FG菌株P(guān)H-1的抗真菌活性可能是由于該菌株在轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)和代謝水平上與GO的協(xié)同反應(yīng)，并且這種潛在的抗真菌機(jī)制也可能通過(guò)使用GO來(lái)有效控制其他真菌。未來(lái)的研究可以在生物測(cè)定中加入其他重要的植物病原菌，擴(kuò)大氧化石墨烯的抗真菌活性譜。此外，將現(xiàn)有的殺菌劑與氧化石墨烯相結(jié)合，研制出具有不同作用模式的新型氧化石墨烯殺菌劑，這可能是控制作物中植物病原體的另一種有效途徑。

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