來源 | 鐵死亡club鐵元素 不僅是血紅蛋白、肌紅蛋白合成的主要原料，也是多種氧化還原酶類的輔因子。作為人體含量最多的必需微量元素，鐵穩(wěn)態(tài)代謝對維持生命健康至關(guān)重要。原發(fā)性遺傳性血色病是鐵過載人類遺傳病，主要由HFE、HJV、TfR2、HAMP或FPN等鐵代謝調(diào)控基因突變引發(fā)多器官鐵蓄積，多累及損傷心臟、肝臟和胰腺等重要臟器，患者晚期多并發(fā)心臟病、肝硬化或糖尿病等疾病，嚴(yán)重危害機(jī)體健康。
鐵泵蛋白 （FPN） 是迄今為止唯一已知的細(xì)胞鐵離子外排蛋白，它在十二指腸上皮細(xì)胞、小腸樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，其中小腸上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)最為豐富；FPN通過控制鐵離子的吸收、再循環(huán)和儲存來維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)。課題組前期利用基因敲除小鼠在國際上首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了FPN在巨噬細(xì)胞以及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中調(diào)控鐵離子儲存和再循環(huán)的重要作用，并揭示FPN是上述組織細(xì)胞中外排鐵離子的關(guān)鍵通道蛋白。為了維持鐵離子代謝平衡從而保障細(xì)胞和組織功能，F(xiàn)PN的表達(dá)受到精密調(diào)控。鐵調(diào)素Hepcidin （HAMP基因編碼蛋白） 是肝臟分泌的調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)的核心激素，其作用靶點(diǎn)是FPN。當(dāng)Hepcidin與FPN結(jié)合時(shí)，F(xiàn)PN降解而失去外排鐵離子功能，進(jìn)而抑制十二指腸上皮細(xì)胞的鐵吸收及巨噬細(xì)胞的鐵再循環(huán)。一旦HAMP表達(dá)被抑制或FPN功能失調(diào)，導(dǎo)致鐵外排功能異常，將引發(fā)機(jī)體鐵代謝紊亂疾病。因此，Hepcidin結(jié)合FPN并誘導(dǎo)其降解，是FPN蛋白維持鐵穩(wěn)態(tài)代謝的根本機(jī)制[7]。早期研究提出，泛素化在FPN的降解過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，結(jié)合并降解FPN的E3泛素化連接酶至今是困擾領(lǐng)域的重大難題。近日，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院 王福俤 / 閔軍霞 教授團(tuán)隊(duì)在血液學(xué)頂級期刊 Blood （IF=17.543） 在線發(fā)表了題為： RNF217 regulates iron homeostasis through its E3 ubiquitin ligase activity by modulating ferroportin degradation 的研究論文， 首次闡明了鐵泵蛋白 （FPN） 在體內(nèi)外被降解的調(diào)控機(jī)制。該研究篩選并發(fā)現(xiàn)了新型E3泛素連接酶RNF217介導(dǎo)了FPN的降解，于國際上率先制備了條件性敲除RNF217的小鼠模型，并首次揭示了RNF217通過調(diào)控FPN降解進(jìn)而維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)代謝的新機(jī)制。此外，該研究通過轉(zhuǎn)錄組及甲基化測序的方法首次揭秘了DNA去甲基化明星分子Tet1響應(yīng)機(jī)體鐵紊亂，并通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控RNF217-FPN表達(dá)，進(jìn)而控制機(jī)體對于高鐵環(huán)境的響應(yīng)。這一重磅發(fā)現(xiàn)不僅攻克了鐵代謝領(lǐng)域多年來尚未被解析的難點(diǎn)問題，同時(shí)為鐵紊亂相關(guān)疾病的防治提供了新靶點(diǎn)和新思路。表觀遺傳修飾在調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、調(diào)控基因表達(dá)、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等生命進(jìn)程中扮演重要角色。課題組前期研究表明，表觀遺傳調(diào)控同樣參與了機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的維持。為了明確機(jī)體鐵代謝紊亂過程中的關(guān)鍵表觀遺傳調(diào)控分子，該研究通過對高低鐵膳食飼喂的鐵紊亂小鼠模型進(jìn)行全基因組甲基化測序及轉(zhuǎn)錄組測序篩選，發(fā)現(xiàn)DNA去甲基化酶Tet1參與了小鼠對于高鐵環(huán)境的響應(yīng)。Tet1參與小鼠對于高鐵刺激的響應(yīng)
進(jìn)一步給予Tet1敲除小鼠高鐵刺激，該小鼠出現(xiàn)類似血色病的表型，主要表現(xiàn)為血清鐵及轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度升高，肝臟鐵增加，然而脾臟及小腸上皮細(xì)胞鐵離子減少的現(xiàn)象。通過檢測鐵調(diào)素Hepcidin及其他鐵代謝調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平，研究者發(fā)現(xiàn)Tet1缺失導(dǎo)致FPN蛋白在小腸上皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞蓄積，進(jìn)而引發(fā)小鼠鐵代謝紊亂。有趣的是，Tet1并非直接通過調(diào)控Hepcidin或FPN的轉(zhuǎn)錄來介導(dǎo)機(jī)體的鐵穩(wěn)態(tài)代謝。Tet1基因敲除小鼠鐵代謝紊亂
為了深入探究Tet1調(diào)控FPN表達(dá)的分子機(jī)制，研究者檢測小鼠原代巨噬細(xì)胞中FPN降解情況，發(fā)現(xiàn)Tet1缺乏導(dǎo)致FPN蛋白蓄積、泛素化水平減弱，表明Tet1通過泛素化降解路徑調(diào)控FPN表達(dá)。然而，F(xiàn)PN如何被降解仍屬于鐵代謝領(lǐng)域的未知。為明確既能促進(jìn)FPN泛素化降解又能被Tet1調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，該研究采用雙向篩選的方法：利用酵母雙雜交技術(shù)在E3連接酶文庫中篩選與FPN結(jié)合的蛋白，并進(jìn)一步在哺乳動物細(xì)胞中驗(yàn)證相互作用；同時(shí)在Tet1敲除體系的數(shù)據(jù)庫中篩選潛在的靶基因。通過基因疊加分析及后續(xù)的表觀遺傳修飾分析，研究者篩選出既能被Tet1調(diào)控，又能與FPN結(jié)合的E3連接酶RNF217。RNF217可能是Tet1調(diào)控的降解FPN的E3連接酶
那么RNF217是否調(diào)控了FPN的泛素化降解呢？為了回答這一問題，研究者首先在體外檢測了RNF217對于FPN的調(diào)控作用，結(jié)果顯示外源RNF217顯著促進(jìn)了蛋白酶體及溶酶體依賴的FPN的泛素化降解，功能性缺失或突變RNF217的酶活位點(diǎn)，該降解作用明顯被抑制。上述結(jié)果揭示了FPN是RNF217的作用靶點(diǎn)。RNF217促進(jìn)FPN降解為了進(jìn)一步明確RNF217的生理功能，研究者分別構(gòu)建了巨噬細(xì)胞和小腸上皮細(xì)胞特異性缺失RNF217的基因敲除小鼠 （Rnf217Lysm/Lysm和Rnf217Villin/Villin） 。令人驚奇的是，Rnf217Lysm/Lysm和Rnf217Villin/Villin小鼠表現(xiàn)出與Tet1敲除小鼠類似的對高鐵響應(yīng)異常的鐵代謝紊亂表型，表明其在鐵穩(wěn)態(tài)代謝調(diào)控中的重要作用。通過分離小鼠原代巨噬細(xì)胞，研究者發(fā)現(xiàn)RNF217缺失導(dǎo)致FPN降解減弱。由于Hepcidin是誘發(fā)FPN發(fā)生內(nèi)吞并降解的重要分子，為揭示RNF217在Hepcidin-FPN調(diào)控軸中的關(guān)鍵作用，研究者給予Rnf217Lysm/Lysm小鼠注射Hepcidin或Hepcidin激活劑LPS，結(jié)果顯示RNF217缺失顯著抑制了Hepcidin依賴的FPN降解。上述結(jié)果既明確了體內(nèi)RNF217在Hepcidin調(diào)控的FPN降解中的重要作用，同時(shí)提示RNF217有望成為Hepcidin-FPN相關(guān)鐵代謝紊亂疾病的治療靶點(diǎn)。巨噬細(xì)胞和小腸上皮細(xì)胞特異性敲除RNF217
總之，這項(xiàng)研究于國際上首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了調(diào)控FPN降解的E3泛素連接酶RNF217。該成果成功制備了Rnf217條件性敲除小鼠，于體內(nèi)外探索并揭示了Rnf217調(diào)控FPN降解及鐵穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制；該成果提出了Tet1-Rnf217-FPN軸響應(yīng)機(jī)體高鐵負(fù)荷的新機(jī)制，不僅填補(bǔ)了鐵代謝研究領(lǐng)域關(guān)于FPN降解調(diào)控的空白，同時(shí)為鐵代謝紊亂相關(guān)疾病的防治提供了新靶點(diǎn)和新策略。Tet1-Rnf217-FPN調(diào)控軸模式圖王福俤團(tuán)隊(duì)博士后蔣麗和博士生王佳明為論文共同第一作者；浙江大學(xué)王福俤教授、閔軍霞教授為共同通訊作者。此項(xiàng)研究得到中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所胡榮貴研究員、浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院金建平研究員、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院孫啟明教授、浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心洪勝輝以及醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺陳靜瑤的大力幫助。項(xiàng)目受到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金以及中國博士后科學(xué)基金的經(jīng)費(fèi)資助。論文鏈接：
https://doi.org/10.1182/blood.2020008986

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