編譯：微科盟小木，編輯：微科盟茗溪、江舜堯。

導(dǎo)讀  

盡管數(shù)十年來，噬菌體作為治療藥物的作用一直被抗生素所掩蓋，但多重耐藥菌的出現(xiàn)以及對(duì)腸道微生物群在人類健康和疾病中的作用的更好理解，使它們重新成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。本文簡(jiǎn)要介紹了噬菌體生物學(xué)知識(shí)，并總結(jié)了近年來噬菌體在腸道微生物群和炎癥性腸病、慢性肝病等胃腸道疾病中的作用。此外，我們回顧了噬菌體治療腸道疾病的臨床前研究和臨床試驗(yàn)，并探討了當(dāng)前的挑戰(zhàn)和未來潛在的研究方向。

論文ID

原名：Bacteriophages and their potential for treatment of gastrointestinal diseases

譯名：噬菌體及其治療胃腸道疾病的潛力 

期刊：Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology

IF：46.802

發(fā)表時(shí)間：2021.11

通訊作者：Bernd Schnabl

通訊作者單位：美國加州大學(xué)圣地亞哥分校

DOI號(hào)：10.1038/s41575-021-00536-z

綜述目錄

1 前言

2 噬菌體生物學(xué)：結(jié)構(gòu)與功能

3 胃腸道中的噬菌體

   3.1 健康個(gè)體的腸道吞噬體  

   3.2 胃腸道疾病患者  

4 噬菌體治療：過去和現(xiàn)在

   4.1 早期歷史

   4.2 當(dāng)前潛力

4.2.1 治療細(xì)菌感染  

4.2.2 調(diào)控腸道微生物群  

4.2.3 噬菌體治療作為一種精確醫(yī)學(xué)方法  

5 挑戰(zhàn)與未來方向

6 結(jié)論

主要內(nèi)容

1 前言

人類腸道微生物群的變化與胃腸道和肝臟疾病有關(guān)，包括炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)、結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。雖然大多數(shù)變化都是針對(duì)細(xì)菌的，但一些研究揭示了腸道病毒組的變化與疾病和發(fā)育功能障礙有關(guān)。

人類病毒組主要以細(xì)菌噬菌體(也稱為噬菌體)為主，它是一種可以感染細(xì)菌的病毒。 噬菌體在100年前被發(fā)現(xiàn)后，被廣泛用作抗菌劑。然而，在Watson和Crick之前的幾十年，微生物學(xué)的早期狀態(tài)阻礙了噬菌體療法有意義的科學(xué)發(fā)展，尤其是在上世紀(jì)中葉小分子抗生素的發(fā)現(xiàn)和快速工業(yè)化的背景下。在過去的幾十年里，多重耐藥菌的廣泛出現(xiàn)減少了抗生素的實(shí)際用途。此外，對(duì)腸道微生物群與人類健康之間密切關(guān)系的新認(rèn)知，使人們對(duì)廣譜抗生素的普遍適用性提出了質(zhì)疑。最后，現(xiàn)代分子遺傳學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和高通量基因組學(xué)揭示了噬菌體的高數(shù)量和多樣性，能靶向大多數(shù)致病菌。

在本文中，我們綜述了噬菌體在維持人類健康和疾病發(fā)病機(jī)制中的作用，總結(jié)了噬菌體治療方法的進(jìn)展，包括直接使用噬菌體治療腸道疾病，并討論了通過靶向特定細(xì)菌物種來調(diào)控腸道微生物群。最后，我們討論了噬菌體臨床應(yīng)用的挑戰(zhàn)和未來潛在的研究方向。

2 噬菌體生物學(xué)：結(jié)構(gòu)與功能

據(jù)估計(jì)，噬菌體數(shù)量超過1031個(gè)粒子，是地球上最豐富和最多樣化的生物實(shí)體。作為細(xì)菌的天敵，噬菌體在細(xì)菌豐富的環(huán)境中無處不在，如土壤、海洋和人體。

通常，噬菌體由含有基因組核酸的蛋白質(zhì)衣殼(很少有內(nèi)膜)組成，這些核酸可以是線狀雙鏈DNA(dsDNA)、線狀單鏈或雙鏈RNA或單鏈環(huán)狀DNA(sscDNA)。噬菌體通常根據(jù)其結(jié)構(gòu)，基于透射電子顯微鏡和基因組序列進(jìn)行分類。在人類腸道微生物群中，絕大多數(shù)DNA噬菌體屬于有尾病毒目(Caudovirales)，是具有約15-750 kb基因組DNA(gDNAs)的dsDNA噬菌體。Caudovirales具有二十面體對(duì)稱的蛋白質(zhì)衣殼，并有三種由尾部結(jié)構(gòu)定義的一般形態(tài)：siphophages(可彎曲尾部)、myophages(收縮性尾部)和podophages(短尾)。尾部和相關(guān)的尾部纖維構(gòu)成了一個(gè)裝置，它不僅定義了病毒粒子的靶向特異性，而且提供了近100%的感染效率。人類腸道微生物群中還含有大量很小(約5 kb gDNA)的sscDNA微小噬菌體科(Microviridae)噬菌體，這些噬菌體是缺乏尾部結(jié)構(gòu)的等軸噬菌體，僅限于革蘭氏陰性細(xì)菌，如腸桿菌(Enterobacteria)。

一般來說，噬菌體可分為毒性噬菌體和溫和噬菌體。毒性噬菌體(如Escherichia coli T4噬菌體)只遵循一種溶解途徑，該途徑始于對(duì)細(xì)菌表面受體的特異性吸附，該受體可以是蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)或其他外部特征，如菌毛、胞外多糖或鞭毛。受體吸附之后，將gDNA注入宿主細(xì)胞質(zhì)，然后進(jìn)行DNA復(fù)制和基因表達(dá)過程，組裝子代病毒粒子，最后通過裂解宿主釋放子代病毒(補(bǔ)充圖1)。相比之下，溫和噬菌體(如E. coli λ噬菌體)以同樣的方式啟動(dòng)感染，但可以選擇進(jìn)行溶原作用，在這個(gè)過程中，病毒基因表達(dá)被噬菌體編碼的抑制因子阻斷，休眠的原噬菌體整合到宿主染色體中或形成線形或環(huán)形自我復(fù)制質(zhì)粒(補(bǔ)充圖1)。重要的是，由于溶原抑制因子的存在，由此產(chǎn)生的溶原細(xì)胞對(duì)同一噬菌體的進(jìn)一步感染免疫。

這些原噬菌體可以永遠(yuǎn)被細(xì)菌宿主攜帶；它們還經(jīng)常攜帶影響細(xì)菌宿主的基因，如致病因子和對(duì)其他噬菌體的防御。此外，無論是自發(fā)的低頻率還是還是細(xì)胞應(yīng)激導(dǎo)致的高頻率，原噬菌體都可以誘導(dǎo)并進(jìn)入裂解途徑，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和子代病毒粒子的釋放。即使在未受干擾的浮游生物培養(yǎng)中，所有溶源菌株都自發(fā)地產(chǎn)生一定濃度的游離病毒粒子，其水平取決于抑制的穩(wěn)定性，其差異可以超過六個(gè)數(shù)量級(jí)。

噬菌體的宿主范圍主要由宿主表面的受體、噬菌體的受體識(shí)別蛋白及其相互作用決定。然而，有許多抗噬菌體系統(tǒng)在感染過程的幾乎每一個(gè)層面都施加阻斷，包括抑制DNA滲透到細(xì)胞、破壞噬菌體DNA，抑制噬菌體基因表達(dá)和感染細(xì)胞的利他性自殺。此外，噬菌體已經(jīng)收集了對(duì)抗這些防御的分子和基因策略?？傊喾N因素決定了宿主范圍。噬菌體的宿主范圍通常僅限于一種細(xì)菌；單個(gè)噬菌體在不同細(xì)菌屬上的高效繁殖還沒有令人信服的文獻(xiàn)報(bào)道。然而，用于分離噬菌體的方法通常涉及對(duì)特定物種的富集，這可能會(huì)使噬菌體偏向于尋找“專家”病毒。E. coli P1噬菌體最初是作為噬菌體分離出來的，它能夠?qū)⒆约旱腄NA注入黃色黏球菌(Myxococcus xanthus)，其屬于δ變形菌綱(Deltaproteobacteria)，而E. coli屬于γ變形菌綱(Gammaproteobacteria)。

3 胃腸道中的噬菌體

人體含有多種微生物群落，包括細(xì)菌、病毒(包括噬菌體和真核病毒)、真菌等。據(jù)估計(jì)，人體中細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量與人體細(xì)胞的數(shù)量大致相同，其中大部分存在于腸道中。在腸道的不同微環(huán)境中，噬菌體本質(zhì)上更難以量化，但大多數(shù)噬菌體與細(xì)胞的比率估計(jì)在0.1-10范圍內(nèi)。如上所述，與所有富含細(xì)菌的環(huán)境一樣，人類腸道中的主要噬菌體是Caudovirales的dsDNA podophages、myophages和siphophages，其次是微小噬菌體科(Microviridae)的小型等軸病毒。

3.1 健康個(gè)體的腸道吞噬體

在新生兒的糞便樣本中很難檢測(cè)到噬菌體，但在幾個(gè)月內(nèi)可以檢測(cè)到不同的種群。在生命的前2年，腸道吞噬體的豐富度降低，這與生命早期的細(xì)菌定植有關(guān)。雖然已經(jīng)提出了核心腸道吞噬體，但其他研究人員認(rèn)為每個(gè)個(gè)體都有獨(dú)特的腸道吞噬體。腸道吞噬體由細(xì)菌細(xì)胞中的噬菌體和游離病毒粒子或病毒樣顆粒組成。先前的研究發(fā)現(xiàn)，不同個(gè)體之間的腸道中存在相同的核心細(xì)菌成員(如擬桿菌屬Bacteroides和瘤胃球菌屬Ruminococcus)；因此，在多個(gè)個(gè)體中檢測(cè)到的腸道噬菌體序列可能是這些核心細(xì)菌中的噬菌體，而不是游離病毒粒子。Caudovirales，尤其是那些生活方式溫和、具有高度嵌合的基因組的Caudovirales，這意味著不同的噬菌體可以具有相同的基因序列簇，這使得準(zhǔn)確地將特定的序列分配給特定的噬菌體成為一種挑戰(zhàn)。

不同的樣品制備方案導(dǎo)致各研究之間存在差異。 此外，可能影響數(shù)據(jù)獲取和解釋的其他因素包括：分析方法(宏基因組測(cè)序vs顯微鏡)，所使用的生物信息學(xué)工具和數(shù)據(jù)庫，以及采樣位置和測(cè)試材料。此外，有證據(jù)表明，一些噬菌體可以以“載體”狀態(tài)存在，在載體狀態(tài)下，它們處于休眠狀態(tài)，但沒有受到抑制或整合到宿主基因組中。綜上所述，在人類腸道吞噬體的組成和動(dòng)態(tài)方面觀察到明顯矛盾的結(jié)果也就不足為奇了。需要進(jìn)一步的研究來制定從病毒DNA和RNA提取到生物信息分析的整個(gè)方法譜的標(biāo)準(zhǔn)化方案。

3.2 胃腸道疾病患者

腸道細(xì)菌失調(diào)常見于胃腸道患者和肝臟疾病患者，這些患者的腸道噬菌體與健康人群不同。通過對(duì)糞便樣本中病毒樣顆粒的DNA進(jìn)行宏基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)克羅恩病(n=27)或潰瘍性結(jié)腸炎(n=42)患者中Caudovirales的相對(duì)豐度相較于Microviridae更高，而與健康個(gè)體(n=61)相比，Caudovirales科的組成不同(圖1)。克羅恩病患者中有相對(duì)溫和的噬菌體，而病毒組組成的變化反映在細(xì)菌的改變上。例如，炎癥性腸病患者中厚壁菌門(Firmicutes)豐度下降，而靶向厚壁菌門的噬菌體水平增加。由于腸道微生物群隨環(huán)境(包括飲食)的變化而變化，研究人員從同一家庭招募了健康的個(gè)體進(jìn)行這些研究，而非使用來自不同家庭的匹配對(duì)照。有趣的是，55例腸易激綜合征患者和51例對(duì)照個(gè)體糞便病毒樣顆粒的宏基因組測(cè)序結(jié)果顯示，腸易激綜合征患者的糞便病毒組多樣性低于對(duì)照組，但未觀察到裂解型噬菌體向溫和噬菌體的轉(zhuǎn)變，這與炎癥性腸病患者不同。

與健康個(gè)體結(jié)腸黏膜樣本相比，克羅恩病患者結(jié)腸黏膜樣本的病毒樣顆粒豐度增加。潰瘍性結(jié)腸炎患者直腸黏膜病毒的相對(duì)豐度高于健康個(gè)體，但Caudovirales噬菌體的多樣性低于健康個(gè)體，這與糞便樣本分析結(jié)果一致。通過對(duì)糞便樣本進(jìn)行宏基因組測(cè)序，還觀察到CRC患者腸道病毒組的變化。在一項(xiàng)隨機(jī)森林分析中，研究人員鑒定出了將CRC患者與健康個(gè)體區(qū)分開來的病毒組特征，以及與患者死亡率相關(guān)的4個(gè)分類標(biāo)記。

有2項(xiàng)研究也對(duì)肝病患者的病毒組組成進(jìn)行了研究。其中一項(xiàng)研究包括89名酒精性肝炎患者，36名酒精使用障礙患者和17名對(duì)照，而另一項(xiàng)研究包括73名非酒精性脂肪肝患者和22名對(duì)照。與無酒精使用障礙的對(duì)照組相比，在酒精性肝炎患者糞便樣本中觀察到病毒多樣性增加。在這些患者中，埃希菌屬(Escherichia)、腸桿菌(Enterobacteria)和腸球菌(Enterococcus)噬菌體的比例過高，而葡萄球菌屬(Staphylococcus)噬菌體豐度的增加與疾病的嚴(yán)重程度高度相關(guān)。有趣的是，重癥非酒精性脂肪肝患者腸道病毒多樣性更低，與其他腸道病毒相比，噬菌體比例顯著降低。在另一項(xiàng)研究中，納入了40名對(duì)照和163名肝硬化患者。結(jié)果顯示，各組間糞便病毒組的α多樣性相似，而肝硬化患者中存在更多靶向乳桿菌目(Lactobacillales)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的噬菌體。

總之，腸道噬菌體主要在炎癥性腸病患者中進(jìn)行研究，需要獨(dú)立的隊(duì)列研究來擴(kuò)展和驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)。腸道噬菌體與疾病之間尚未建立起致病關(guān)聯(lián)，因此還需要進(jìn)一步研究以確定腸道噬菌體改變是否導(dǎo)致疾病發(fā)生或發(fā)展，或者是疾病的結(jié)果。此外，迄今為止的發(fā)現(xiàn)主要局限于非常廣泛的噬菌體種類，而不是特定的噬菌體類型或特定宿主的噬菌體。因此，我們?cè)诹私饽c道“暗物質(zhì)”及其對(duì)人類健康和疾病的影響方面仍處于初期階段。

圖1 健康人群和炎癥性腸病患者的腸道吞噬體。炎癥性腸病(IBD)患者中Caudovirales的相對(duì)豐度相較于Microviridae更高，與健康個(gè)體相比，Caudovirales科的組成不同。

4 噬菌體治療：過去和現(xiàn)在

4.1 早期歷史

1917年提出“細(xì)菌噬菌體”一詞后，F(xiàn)élix d’ Herelle立即開始對(duì)志賀菌病(shigellosis)患者進(jìn)行噬菌體治療。晚期患者在接受口服劑量的志賀氏菌(Shigella)噬菌體治療后表現(xiàn)出極大的恢復(fù)。其他研究者也報(bào)道了利用噬菌體療法治療痢疾的成功案例，包括來自美國和澳大利亞的研究人員。在20世紀(jì)20年代末，d’ Herelle及其同事報(bào)道稱，口服霍亂弧菌(Vibrio cholerae)噬菌體可大大降低Assam霍亂流行期間的死亡率。噬菌體治療組(n=74)患者的死亡率約為6%，而拒絕噬菌體治療的對(duì)照組(n=124)患者的死亡率為63%。盡管結(jié)果并不總是積極樂觀的，但同時(shí)也有多篇關(guān)于使用噬菌體治療其他腸道疾病(如傷寒)的報(bào)道。然而，在抗生素發(fā)現(xiàn)之前，噬菌體治療被廣泛認(rèn)為是防治細(xì)菌感染的可行策略。

然而，在20世紀(jì)30年代，臨床綜述，尤其是美國醫(yī)學(xué)會(huì)委托進(jìn)行的一項(xiàng)大型綜合研究得出結(jié)論，認(rèn)為噬菌體療法缺乏經(jīng)過證實(shí)的有效性，并特別引用了多個(gè)噬菌體治療霍亂和其他腸道疾病失敗的報(bào)告。在此之后，西方國家對(duì)將噬菌體作為抗菌藥物開發(fā)的興趣下降，尤其是在二戰(zhàn)期間小分子抗生素工業(yè)化之后?；仡欉^去，在分子生物學(xué)時(shí)代之前，噬菌體在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用可能還為時(shí)過早。然而，噬菌體療法現(xiàn)在仍然在一些東歐國家/地區(qū)使用；不幸的是，這些療法在英文同行評(píng)議文獻(xiàn)中沒有得到很好的記錄，我們將等待更可靠的臨床前研究和更優(yōu)設(shè)計(jì)的臨床試驗(yàn)。

4.2 當(dāng)前潛力

4.2.1 治療細(xì)菌感染

在過去的二十年中，一些臨床試驗(yàn)和案例研究調(diào)查了噬菌體治療胃腸道疾病的情況(表1)?？诜﨓. coli T4樣噬菌體的安全性和有效性已經(jīng)在健康個(gè)體和細(xì)菌性腹瀉患者中進(jìn)行了幾個(gè)小規(guī)模的研究，包括成人和兒童。結(jié)果顯示，無嚴(yán)重不良反應(yīng)報(bào)告，但也未觀察到療效。在使用噬菌體治療孟加拉國兒童細(xì)菌性腹瀉的大型臨床試驗(yàn)中也獲得了類似的結(jié)果(n=120)。在這些研究中，在接受治療的兒童中，針對(duì)靶向細(xì)菌宿主(E. coli)的糞便噬菌體增加，但其滴度并未顯示大量腸道噬菌體復(fù)制；E. coli的絕對(duì)豐度較低，因此應(yīng)用較高的噬菌體滴度可能會(huì)得到更好的結(jié)果。

2017年的一份病例報(bào)告報(bào)道了一例68歲的男性糖尿病患者感染多重耐藥菌鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)，并發(fā)展為壞死性胰腺炎并發(fā)假性囊腫。盡管經(jīng)過多次抗生素治療和經(jīng)皮穿刺胰腺假性囊腫引流，但患者在4個(gè)月期間病情惡化。根據(jù)FDA的緊急用新藥研究(EIND)許可，開始了噬菌體治療(腔內(nèi)和靜脈)，患者在大約5個(gè)月后恢復(fù)健康。雖然這只是一個(gè)病例報(bào)道，但噬菌體治療前明顯下降的臨床過程和噬菌體治療后明顯的轉(zhuǎn)折點(diǎn)引起了廣泛的關(guān)注，這為噬菌體療法用于治療細(xì)菌感染(尤其是多重耐藥菌)帶來了新的希望。在過去4年中，已有多例報(bào)告報(bào)道了在其他EIND病例中使用噬菌體治療銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和膿腫分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)。然而，還需要標(biāo)準(zhǔn)化的臨床試驗(yàn)來進(jìn)一步確定噬菌體治療不同傳染病的療效。

在臨床前模型中，噬菌體也被用于疾病預(yù)防。在霍亂弧菌(V. cholerae)攻毒24小時(shí)前給幼鼠口服三種噬菌體的混合物，可顯著減少腸道細(xì)菌定植。此外，使用幼兔模型，在細(xì)菌攻毒前給藥噬菌體可以保護(hù)動(dòng)物免受類似霍亂的腹瀉。由于霍亂流行具有季節(jié)性和疾病自限性，在暴發(fā)期間可使用噬菌體預(yù)防來控制疾病傳播和保護(hù)高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體。還需要進(jìn)行更多的研究來探索細(xì)菌攻毒后的潛在保護(hù)作用，從而減少細(xì)菌定植，預(yù)防疾病。

表1 噬菌體治療胃腸道細(xì)菌感染的臨床試驗(yàn)及病例報(bào)告。

4.2.2 調(diào)控腸道微生物群

調(diào)控腸道微生物群的策略包括糞便微生物群移植、使用益生元和益生菌、調(diào)整飲食和營(yíng)養(yǎng)攝入。在過去的十年中，噬菌體也被用于腸道微生物群的精確編輯(表2)。2017年，PreforPro(Deerland Probiotics and Enzymes, Kennesaw, GA)獲得了美國專利，這是一種靶向E. coli的噬菌體混合物。已經(jīng)進(jìn)行了兩項(xiàng)安慰劑對(duì)照試驗(yàn)，以確定PreforPro通過改變腸道細(xì)菌組成來改善腸道健康的安全性和有效性。一項(xiàng)試驗(yàn)評(píng)估了單獨(dú)使用噬菌體雞尾酒的療效，而另一項(xiàng)試驗(yàn)測(cè)試了PreforPro對(duì)益生菌Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL04的添加效果。這兩項(xiàng)試驗(yàn)都包括健康個(gè)體，他們報(bào)告有輕度到中度的胃腸不適，但沒有診斷出胃腸紊亂。在這兩個(gè)試驗(yàn)28天的研究中，發(fā)現(xiàn)膠囊化的PreforPro是安全和耐受的，但有效性的證據(jù)并不明確。E. coli和腹部癥狀之間的聯(lián)系尚未得到充分證實(shí)；因此，還需要更多的研究來更好地評(píng)估其潛在的療效。

表2 基于噬菌體的腸道微生物群調(diào)控策略在胃腸道疾病中的研究。

粘附侵襲性大腸桿菌(Adherent–invasive E. coli)在過去二十年中被認(rèn)為是炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制之一。針對(duì)這種E. coli菌株的噬菌體已被提議作為一種治療選擇。將黏附性侵襲性大腸桿菌定植的常規(guī)小鼠灌服含2%右旋糖酐硫酸鈉(DSS)的飲用水，以誘導(dǎo)輕度結(jié)腸炎癥狀。1周后，小鼠灌胃噬菌體雞尾酒(三種噬菌體混合物)，然后小鼠飲用含2% DSS的水，持續(xù)2周。噬菌體治療的小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎有保護(hù)作用，E. coli定植減少。在來自克羅恩病患者的E. coli的回腸活檢樣本中檢測(cè)到活躍的噬菌體復(fù)制，這為噬菌體在這種環(huán)境中的殺傷潛力提供了額外的證據(jù)。一項(xiàng)I/IIa期隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，目的是評(píng)估口服靶向腸粘附侵襲性大腸桿菌噬菌體對(duì)緩解期克羅恩病患者的安全性和有效性(NCT03808103)(圖2a)。

研究人員發(fā)現(xiàn)，與酒精使用障礙患者和非酒精使用障礙患者相比，酒精性肝炎患者糞便中糞腸球菌(Enterococcus faecalis)(一種豐度較低的人類腸道微生物群的共生成員)的水平顯著增加。可產(chǎn)生細(xì)胞溶素(一種細(xì)菌外毒素)的E. faecalis菌株的存在與酒精性肝炎患者的不良預(yù)后和死亡率相關(guān)。口服細(xì)胞溶素陽性E. faecalis可加重常規(guī)小鼠乙醇誘導(dǎo)的肝臟疾病。為了將這些發(fā)現(xiàn)推廣到人類，我們用細(xì)胞溶素陽性和細(xì)胞溶素陰性的酒精性肝炎患者的糞便樣本定植無菌小鼠。用特異性靶向細(xì)胞溶素陽性E. faecalis的噬菌體灌胃小鼠，顯示出乙醇誘導(dǎo)的肝臟疾病減少，而用靶向細(xì)胞溶素陰性E. faecalis的噬菌體治療的小鼠沒有顯示出任何有益的影響。除了對(duì)乙醇誘導(dǎo)的肝臟疾病的潛在治療意義外，該研究還可以被視為通過去除E. faecalis亞群對(duì)腸道微生物群進(jìn)行精確編輯的第一個(gè)有文獻(xiàn)記載的例子之一(圖2b)。還需要更大規(guī)模的研究來驗(yàn)證這些結(jié)果，以及進(jìn)行臨床試驗(yàn)來測(cè)試酒精性肝炎患者的療效。

McCoy和Mason在1951年首次報(bào)道了這一現(xiàn)象，之后的幾項(xiàng)研究表明Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus(Sgg)是敗血癥和感染性心內(nèi)膜炎的病因，與CRC有關(guān)。CRC患者的糞便樣本中具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)的豐度高于對(duì)照組樣本；與來自CRC患者的匹配對(duì)照組織標(biāo)本相比，具核梭桿菌在腫瘤中的比例也過高。臨床前研究表明，腸道微生物群中的許多細(xì)菌種類，特別是F. nucleatum、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)、E. coli和E. faecalis，也通過不同的機(jī)制與CRC的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)。在體外和體內(nèi)使用小鼠模型的研究表明，Sgg通過上調(diào)β-連環(huán)蛋白(β-catenin, 結(jié)腸腫瘤發(fā)生的中樞信號(hào)分子)而發(fā)揮CRC腫瘤促進(jìn)作用。此外，在2個(gè)小鼠模型(偶氮甲烷/DSS結(jié)腸炎模型和偶氮甲烷處理的Il10-缺陷小鼠模型)中，通過口服鎢酸鈉抑制腸道E. coli的過度生長(zhǎng)，降低了兩個(gè)小鼠模型(偶氮甲烷/DSS結(jié)腸炎模型和偶氮甲烷處理的Il10-缺陷小鼠模型)中腸道炎癥和結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸腫瘤的發(fā)生率。雖然還需要更多的研究來證實(shí)腸道細(xì)菌和CRC之間的致病聯(lián)系，但噬菌體介導(dǎo)的腸道微生物群的精確編輯可能是一個(gè)有前景的治療選擇(圖2c)。

然而，需要注意的是，有必要對(duì)決定此類研究中噬菌體特異性的因素有一些了解，以達(dá)到精確度。E. coli T4噬菌體對(duì)不同的E. coli菌株使用不同的受體。一種類似的E. coli噬菌體，Ox2，可以將其受體從一種外膜蛋白(通常的受體是OmpA)改變?yōu)榱硪环N(OmpC和/或OmpX)或脂多糖中不同的碳水化合物殘基，這是由于尾部纖維的單突變。此外，一些噬菌體基因組編碼尾部纖維基因陣列，這些基因可以通過高頻重組過程進(jìn)行切換。令人驚訝的是，一些Bordetella編碼一種易錯(cuò)逆轉(zhuǎn)錄酶，這種逆轉(zhuǎn)錄酶會(huì)導(dǎo)致尾部纖維受體結(jié)合區(qū)域的超突變。因此，識(shí)別噬菌體的受體以精確定位宿主細(xì)菌是很重要的。

圖2 噬菌體對(duì)腸道微生物群的調(diào)控。a噬菌體治療克羅恩病。粘附侵襲性大腸桿菌刺激抗原呈遞細(xì)胞(APCs)，驅(qū)動(dòng)輔助性T細(xì)胞17(TH17)反應(yīng)，引發(fā)慢性腸道炎癥。靶向粘附侵襲性大腸桿菌的噬菌體被發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸炎的臨床前模型中是有益的。b噬菌體治療酒精性肝炎。細(xì)胞溶素陽性E. faecalis從腸道轉(zhuǎn)移到肝臟，通過分泌細(xì)胞溶素直接破壞肝細(xì)胞。在臨床前模型中靶向細(xì)胞溶素陽性E. faecalis的噬菌體減少乙醇誘導(dǎo)的肝臟疾病。c噬菌體治療結(jié)直腸癌。Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus(Sgg)可上調(diào)β-連環(huán)蛋白，刺激細(xì)胞增殖，增加腸道炎癥。噬菌體療法可能是一種很有前景的治療選擇。

4.2.3 噬菌體治療作為一種精確醫(yī)學(xué)方法

噬菌體不僅可以精確編輯腸道微生物群，還可以將藥物輸送到特定的位置。作為細(xì)菌的天敵，噬菌體在宿主駐留的環(huán)境中繁殖。隨著更強(qiáng)大的噬菌體工程工具的發(fā)展，藥物可以附著在噬菌體表面，當(dāng)噬菌體到達(dá)它們的目的地時(shí)釋放。因此，高劑量的部位特異性給藥是可行的，可以降低血液循環(huán)中的藥物濃度，減少對(duì)非目標(biāo)組織的毒性作用。

一些臨床前研究已經(jīng)測(cè)試了這種方法。在一項(xiàng)體外研究中，數(shù)以千計(jì)的抗生素氯霉素分子通過酯鍵附著在噬菌體表面，使其能夠通過血清酯酶緩慢釋放。這些噬菌體能靶向金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，提供高濃度的氯霉素，足以抑制耐藥的S. aureus細(xì)胞的生長(zhǎng)。類似的想法也在小鼠模型體內(nèi)得到了應(yīng)用。F. nucleatum主要存在于CRC腫瘤中，并促進(jìn)CRC小鼠對(duì)化療的耐藥性。F. nucleatum靶向Toll樣受體4和特異性microRNAs來激活自噬通路，從而改變CRC化療反應(yīng)。在一項(xiàng)CRC小鼠模型研究中，Zheng等人用伊立替康包被F. nucleatum噬菌體，伊立替康是治療CRC的一線藥物。這些噬菌體靶向位于CRC腫瘤組織中的F. nucleatum。因此，噬菌體在CRC腫瘤中積累，并精確地將藥物輸送到目的地，對(duì)非腫瘤組織的不良影響最小。口服伊立替康包被的噬菌體也降低了F. nucleatum的豐度，從而使腫瘤細(xì)胞重新對(duì)化療敏感。在另一項(xiàng)研究中，研究人員使用了類似的方法，在噬菌體表面組裝了抗菌銀納米顆粒。這些噬菌體特異性靶向F. nucleatum，并在CRC腫瘤細(xì)胞中積累。與只接受化療的小鼠相比，同時(shí)接受噬菌體治療和化療的小鼠腫瘤生長(zhǎng)更少，生存時(shí)間更長(zhǎng)。因此，噬菌體介導(dǎo)的藥物傳遞具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

腸道微生物代謝物在人類健康中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)也有助于疾病的發(fā)生。在小鼠CRC模型中，腸道細(xì)菌產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(如丁酸)抑制腫瘤生長(zhǎng)并刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)。 Zheng等人的研究表明，噬菌體可以與葡聚糖納米顆粒共價(jià)連接，促進(jìn)丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的增殖，從而增加小鼠糞便中短鏈脂肪酸的水平，抑制腫瘤生長(zhǎng)。這些噬菌體靶向致病菌F. nucleatum，不影響C. butyricum。多功能噬菌體顆粒可口服給藥，不僅可將藥物輸送到特定部位，還可通過調(diào)節(jié)腸道微生物群(即減少致病菌數(shù)量，促進(jìn)有益菌生長(zhǎng))來提高治療效果。這種新穎便捷的給藥途徑(即口服化學(xué)包被噬菌體)值得重視。需要對(duì)不同的疾病模型進(jìn)行研究，以評(píng)估長(zhǎng)期影響。

5 挑戰(zhàn)與未來方向

在噬菌體被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)世紀(jì)后，噬菌體成為治療細(xì)菌感染的新課題，特別是胃腸道疾病。在這些疾病中，不需要將噬菌體系統(tǒng)地引入血液。這些細(xì)菌捕食者有廣泛的應(yīng)用，但也有許多挑戰(zhàn)需要克服。

大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)噬菌體療法是安全的，因?yàn)槭删w只在細(xì)菌中繁殖。然而，一項(xiàng)使用小鼠模型的研究表明，假單胞菌屬(Pseudomonas)噬菌體可以直接與人體白細(xì)胞相互作用，產(chǎn)生噬菌體RNA并刺激干擾素的產(chǎn)生。這一觀察結(jié)果表明，絲狀噬菌體可能與人體免疫系統(tǒng)相互作用，對(duì)人體健康產(chǎn)生直接影響。一些臨床前研究也評(píng)估了噬菌體誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。一些研究發(fā)現(xiàn)，口服噬菌體能夠刺激炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生并誘發(fā)炎癥，主要是在腸道炎癥和生物失調(diào)的小鼠模型中。另一方面，噬菌體在體外對(duì)炎癥反應(yīng)沒有影響，或者通過測(cè)量炎癥細(xì)胞因子水平對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生了抗炎反應(yīng)。鑒于細(xì)菌和噬菌體長(zhǎng)期存在于哺乳動(dòng)物的腸道中，發(fā)現(xiàn)噬菌體能夠與人類免疫系統(tǒng)和其他不同類型的細(xì)胞相互作用也就不足為奇了。

宿主范圍狹窄是噬菌體治療的另一個(gè)明顯缺陷。因此，噬菌體的高度特異性使其能夠精確靶向細(xì)菌，這也是一個(gè)潛在的問題，因?yàn)楠M窄的宿主范圍可能會(huì)限制治療效用。 一種選擇是制備噬菌體混合物，該混合物由多個(gè)噬菌體組成，每個(gè)噬菌體靶向不同的受體。然而，這增加了治療的復(fù)雜性和安全風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)楦鶕?jù)現(xiàn)行準(zhǔn)則，每個(gè)噬菌體個(gè)體以及每個(gè)不同噬菌體組合的安全性需要進(jìn)行測(cè)試。因此，在開發(fā)治療性噬菌體雞尾酒時(shí)，必須考慮許多因素，如宿主范圍、受體和感染效率。另一種可能的策略是“噬菌體訓(xùn)練”或噬菌體適應(yīng)。這一過程選擇具有更廣泛宿主范圍或通過實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)程序克服細(xì)菌耐藥性的進(jìn)化噬菌體。通過使用不同的細(xì)菌分離物或耐藥突變體進(jìn)行多輪選擇，可以獲得靶向多個(gè)宿主的噬菌體。這種方法還可以避免重組DNA方法和轉(zhuǎn)基因生物(GMO)分類的復(fù)雜性，具有“天然的”附加吸引力。另一方面，快速發(fā)展的合成生物學(xué)使得工程噬菌體具有吸引力，盡管它受到GMO調(diào)控。通過鑒定負(fù)責(zé)宿主識(shí)別的噬菌體蛋白，可以進(jìn)行基因修飾來擴(kuò)大宿主范圍或降低噬菌體產(chǎn)生抗性的可能性。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，高端的基因組編輯工具和更多關(guān)于宿主鑒定的知識(shí)將是必不可少的。

噬菌體治療的研究尚處于起步階段，還有許多科學(xué)問題有待解決。此外，為了獲得更好的結(jié)果，在給藥前應(yīng)考慮和仔細(xì)評(píng)估許多因素。其中最重要的是篩選所有個(gè)體，看它們的腸道中是否存在靶向細(xì)菌宿主。還應(yīng)在體外對(duì)細(xì)菌宿主進(jìn)行測(cè)試，以確定其對(duì)所選噬菌體的敏感性。另一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是確定給藥噬菌體的劑量。多項(xiàng)研究表明，相對(duì)高劑量的噬菌體(例如，109 PFU，口服和靜脈注射)具有安全性。高濃度的噬菌體可能是必要的，尤其是口服，因?yàn)槲杆峥梢詼p少噬菌體的數(shù)量。同時(shí)使用酸中和試劑和噬菌體包裝可能在這方面有所幫助。此外，噬菌體的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性也需要進(jìn)行評(píng)估。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，小鼠和人體內(nèi)的噬菌體在數(shù)小時(shí)內(nèi)就能從循環(huán)系統(tǒng)中清除，這可能會(huì)對(duì)需維持足夠數(shù)量的噬菌體用于治療產(chǎn)生問題。然而，一些研究人員發(fā)現(xiàn)，口服噬菌體幾天后仍然可以在腸道中檢測(cè)到噬菌體。噬菌體衣殼蛋白的修飾可能會(huì)改善其半衰期，因?yàn)檫@種改變可能有助于噬菌體更好地逃避吞噬。

盡管仍存在許多問題和挑戰(zhàn)(Box1)，但噬菌體療法在臨床實(shí)踐中具有巨大的應(yīng)用潛力(圖3)。精心設(shè)計(jì)的安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)顯示出了安全性和有效性，這將有助于該領(lǐng)域的發(fā)展，并吸引更多的科學(xué)家和醫(yī)生。然而，這一領(lǐng)域的發(fā)展不僅取決于研究人員(科學(xué)家、醫(yī)生甚至患者)，還取決于監(jiān)管環(huán)境。在美國和歐盟，噬菌體被視為醫(yī)藥產(chǎn)品，并且在其生產(chǎn)和銷售許可方面受到非常嚴(yán)格的限制，例如遵守良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)。作為一種定制療法，治療性噬菌體需要特別選擇和生產(chǎn)，這使得它們不可能成為固定的預(yù)定義藥物產(chǎn)品。生產(chǎn)DMP認(rèn)證的藥品總體上是昂貴和耗時(shí)的，這使得啟動(dòng)噬菌體治療的臨床試驗(yàn)更加困難。最近，比利時(shí)政府將治療性噬菌體歸類為“隨意制劑”，為噬菌體治療提供了更多的靈活性。在歐洲法律中，隨意制劑(在美國是復(fù)合處方藥品)被定義為在藥房根據(jù)患者的醫(yī)療處方配制的任何藥品。盡管由于更嚴(yán)格的條例和更多的關(guān)注，這可能不太可能得到FDA的批準(zhǔn)，因此噬菌體治療將需要一些與其他標(biāo)準(zhǔn)藥物不同的特定規(guī)則和法規(guī)。鑒于噬菌體在人體和環(huán)境中無處不在，而且它們根本不具備攻擊人體組織的能力，F(xiàn)DA可能會(huì)考慮使用噬菌體作為GRAS(通常被認(rèn)為是安全的)材料。這可能為進(jìn)行一些噬菌體雞尾酒的定點(diǎn)臨床試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)；假設(shè)在安全性和有效性方面取得了積極的成果，監(jiān)管機(jī)構(gòu)可能會(huì)提前批準(zhǔn)以相同方式制備和配制的其他噬菌體組合，就像每個(gè)季節(jié)批準(zhǔn)新流感疫苗的方式一樣。總之，很顯然，需要更多政府資助的、噬菌體治療的臨床試驗(yàn)，以更好地探索噬菌體在廣泛胃腸道疾病中的治療潛力。

Box 1 進(jìn)一步研究噬菌體治療的重要問題

盡管噬菌體在一個(gè)世紀(jì)前就已發(fā)現(xiàn)，但噬菌體治療仍然是一個(gè)相對(duì)較新的研究領(lǐng)域，有許多挑戰(zhàn)和問題，也有許多開放的問題和機(jī)遇。

①噬菌體治療在臨床實(shí)踐中安全嗎?規(guī)章制度是什么？

②噬菌體治療會(huì)取代抗生素治療嗎?如果不是，什么時(shí)候該選擇?或者兩者應(yīng)該同時(shí)使用？

③如何確定每種噬菌體治療的最佳給藥途徑和劑量？

④單一噬菌體和噬菌體混合物哪個(gè)更好?在臨床實(shí)踐中應(yīng)如何決定使用哪一種？

⑤生物膜是抗生素治療的一大挑戰(zhàn)。能找到在生物膜中高效繁殖的噬菌體嗎？

⑥噬菌體可以用來防治細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染嗎？

⑦可以發(fā)現(xiàn)更多的噬菌體。是否有可能快速而容易地確定新的分離物是否有幫助，增加治療的力度?生物信息工具有幫助嗎？

⑧噬菌體治療對(duì)腸道微生物群和人類健康的長(zhǎng)期影響？

圖3 噬菌體的潛在應(yīng)用。除了靶向細(xì)菌宿主外，噬菌體還可以與人體相互作用，從而對(duì)人類健康和疾病產(chǎn)生多種影響。

結(jié)論

噬菌體被用來防治細(xì)菌感染已經(jīng)有一個(gè)多世紀(jì)了。腸道微生物群與人類疾病間關(guān)聯(lián)的發(fā)現(xiàn)，重新引起了人們對(duì)這一研究領(lǐng)域的關(guān)注。噬菌體不僅是防治病原菌感染的有力武器，而且還能精確編輯腸道微生物群，對(duì)許多不同的胃腸道疾病都有良好的療效。已經(jīng)提出了多種治療的可能性，但還需要更多的基礎(chǔ)和臨床前研究，以及合理設(shè)計(jì)的隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照試驗(yàn)，以幫助該領(lǐng)域向前發(fā)展。該研究領(lǐng)域仍處于早期階段，仍有許多重大問題和挑戰(zhàn)有待解決，如潛在的噬菌體與人體相互作用的有利或有害影響，噬菌體作為重要生物實(shí)體的進(jìn)化性質(zhì)，以及噬菌體調(diào)控腸道微生物群對(duì)人類健康的長(zhǎng)期影響。總之，噬菌體療法有望成為治療許多胃腸道和腸道外疾病的有效方法，值得更多的關(guān)注和進(jìn)一步的探索。

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41575-021-00536-z

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