摘要：

研究背景 艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染引起的,嚴重威脅人類健康的傳染性疾病.據(jù)UNAIDS統(tǒng)計,2008年全球感染HIV的人數(shù)有3340多萬,而08年新增的HIV感染者數(shù)量為270萬,因艾滋病死亡的人數(shù)高達200萬.我國自1985年首次發(fā)現(xiàn)HIV感染者,截止2009年10月底,估計有74萬人發(fā)生了感染,且2009年新增的感染者數(shù)量為4.8萬.在非洲的有些國家,HIV的感染率達總?cè)丝?0%以上.因此,預(yù)防和治療艾滋病,已不僅僅是挽救個人生命的問題,而是關(guān)系到民族存亡的大事.由于有效的艾滋病疫苗在短時期內(nèi)還難以面世,開發(fā)高效,安全和廉價的抗HIV藥物依然是挽救艾滋病人生命的關(guān)鍵舉措,也是艾滋病防治的當務(wù)之急.目前應(yīng)用于臨床的抗HIV藥物中逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑,蛋白酶抑制劑有26種,進入抑制劑和整合酶抑制劑才3種,但前兩類藥物容易引起病毒耐藥現(xiàn)象和嚴重的毒副作用.因此,為了治療感染了耐藥病毒的艾滋病患者,組成更多有效的"雞尾酒"治療方案,必須大力開發(fā)后兩類新作用機制的抗艾滋病藥物.其中HIV進入抑制劑,由于能在病毒感染的早期進行阻斷,更為有效地預(yù)防和治療HIV感染,而倍受重視. 已被批準的HIV進入抑制劑有兩種,分別是靶向HIV跨膜蛋白gp41的多肽藥物T-20(也叫融合抑制劑)和靶向HIV輔助受體CCR5的受體拮抗劑Maraviroc.Maraviroc只能作用于利用CCR5作為輔助受體的R5病毒,對以CXCR4為輔助受體的X4病毒無效,而T-20則對兩類病毒均具有抑制作用.然而,T-20是多肽藥物,不能口服,容易被體內(nèi)的蛋白酶降解,而且價格昂貴不是廣大的發(fā)展中國家HIV感染者所能承受的,因此開發(fā)出具有類似作用機制的非肽類HIV進入抑制劑迫在眉睫. 本課題根據(jù)實驗室在相關(guān)領(lǐng)域積累的經(jīng)驗,與相關(guān)的研究組合作對大量的有機合成小分子和天然產(chǎn)物提取成分進行抑制HIV進入的體外活性篩選,并進一步的開發(fā)完善新的實驗方法,研究公認的HIV-1抑制劑ADS-J1對gp41產(chǎn)生抑制作用的具體位點. 第一章天然來源化合物抗HIV的活性篩選 目的: 通過對茶黃素衍生物單體進行結(jié)構(gòu)改造,改變原樣品顏色深,水溶性差等缺點,考察改造后的化合物體外抑制HIV-1包膜介導(dǎo)的細胞融合活性和相關(guān)的生物學活性,確定改造后成分的可利用度及進一步改造的方向,為該類化合物作為HIV進入抑制劑的作用機制研究提供依據(jù).對番石榴葉提取成分進行體外的免疫,分生活性檢測,篩選出能在HIV-1進入階段發(fā)揮作用的成分,并初步探討其作用機理,填補該類成分在HIV-1進入抑制研究方面的空白. 方法: 1.茶黃素類衍生物的結(jié)構(gòu)改造和番石榴葉成分提取.茶黃素衍生物是文獻中研究最多的從紅茶中提取的TF1 (theaflavin), TF2A (theaflavin-3-monogallate), TF3 (theaflavin-3,3'-digallate),分別對它們的苯并酚酮七元環(huán)中的1",2",3",7"4個雙鍵進行還原得到對應(yīng)的化合物TF1-4H,TF2A-4H, TF3-4H.具體操作是在Pt/C的催化下,通入H2還原,然后過濾除掉催化劑,對還原產(chǎn)物用反相柱層析分離純化得到相應(yīng)的化合物.參照相關(guān)文獻,番石榴葉經(jīng)兩次乙醇提取的浸膏用SA-1型大孔樹脂吸附,然后用80%(V/V)的乙醇溶液洗脫,得到總皂苷的粗品.番石榴葉的乙醇提取物用FL-1型大孔樹脂吸附,然后用0.2%NaOH溶液洗脫,得到總黃酮的粗品.番石榴葉水浸泡液回流提取得到揮發(fā)油成分. 2.以上樣品先用抗體特異性的檢測抗原的酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)進行第一次篩選,有效的通過濃度梯度實驗考察量效關(guān)系,計算抑制率并確定半數(shù)抑制濃度(Half of the inhibiting concentration, IC50)范圍.進一步的用可直觀的從六螺旋束(six-helical bundle,6-HB)條帶變化中反映化合物抑制強弱的天然非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native polyacrylamide gel electrophoresis, N-PAGE)確證活性. 3.另外用HIV-1包膜介導(dǎo)的細胞-細胞融合實驗考察改造后的茶黃素類化合物和番石榴葉的有效成分細胞水平的抑制活性.根據(jù)融合時的細胞狀態(tài),對樣品進行四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)實驗檢測相應(yīng)的細胞毒性. 結(jié)果: 1.分離純化的茶黃素衍生物結(jié)構(gòu)改造后純化的產(chǎn)物由香港浸會大學提供,本研究主要鑒定結(jié)構(gòu)改造后單體的活性大小.番石榴葉提取成分由南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院提供,黃酮粗品中總黃酮量為55.22%,皂苷粗品中總皂苷量為55.3%. 2.由于茶黃素化合物本身的不穩(wěn)定性,多次反復(fù)凍融后有部分化合物活性下降或消失,且受樣品量的限制,該部分有的實驗結(jié)果不完善.首先利用抗體特異性的ELISA對茶黃素系列化合物進行第一次篩選,發(fā)現(xiàn)25μg/mL的終濃度時,化合物都有很高的抑制率.進一步的梯度稀釋時,雖然沒有做出TFl的IC50'范圍,但在終濃度11.08μM時,抑制率為60%,而還原產(chǎn)物TF1-4H的IC50為0.63±0.27μM,另一組TF2A的IC50=2.60±0.56μM,還原產(chǎn)物TF2A-4H的IC50=1.13±0.27μM,第三組TF3的IC50=0.88±0.34 gM,還原產(chǎn)物TF3-4H的IC50=1.74±0.55 gM.與文獻值相比,本研究中IC50值略低,但都在微摩爾水平,且5μM的范圍內(nèi).N-PAGE實驗的條帶顯示六個單體隨著濃度的降低,6-HB的顏色越來越深,表現(xiàn)出一定的量效依賴關(guān)系.用ELISA實驗對番石榴葉的三個成分進行初篩時,發(fā)現(xiàn)以25μg/mL終濃度初篩,番石榴葉提取物總黃酮和總皂苷對6-HB的抑制率都在80%左右,揮發(fā)油成分的抑制活性較低,統(tǒng)計分析顯示前兩組與相同濃度的陽性對照TF間無差異,而揮發(fā)油成分與TF相比差異顯著,所以后續(xù)實驗中去掉該組.在濃度梯度實驗中,番石榴葉總黃酮和總皂苷對6-HB的抑制也表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系,IC50分別為3.9±1.3μg/mL,9.06±0.17μg/mL.進一步的N-PAGE實驗結(jié)果確證了二者對gp41的作用,結(jié)果與ELISA一致,200μg/mL時與相同濃度的陽性藥物TF的效果相近,通過對應(yīng)濃度的條帶,清楚的看到樣品量與抑制作用之間成正比關(guān)系. 3.細胞融合結(jié)果顯示,改造后TF1-4H,TF2A-4H,TF3-4H抑制細胞融合的活性比改造前的TF1,TF2A,TF3稍有增強,都在相應(yīng)的微摩爾水平.TF1的IC50為14.63±1.40μM,TFl-4H的IC50為11.144±1.02μM.第二組TF2A的IC50為10.30±0.36μM,TF2A-4H的IC50為6.44±0.51μM.第三組TF3的IC50為8.14±0.21μM,TF3-4H的IC50為6.06±0.26μM.由于樣品量較少,沒有進一步的考察細胞毒性.細胞融合實驗中番石榴葉總黃酮和總皂苷都表現(xiàn)出一定的抑制活性,總皂苷的IC50為7.33±0.40μg/mL,總黃酮的IC50為5.3±1.3μg/mL.MTT實驗顯示總黃酮產(chǎn)生的細胞毒性很小,半數(shù)致死濃度(concentration of 50% cytotoxicity, CC50)都在100μg/mL以上,總皂苷對CHO-WT和MT-2的CC50分別為46.86±1.27μg/mL和62.97±1.22μg/mL,統(tǒng)計學結(jié)果顯示總皂苷在7.82μg/mL以下濃度時CHO-WT的生長與對照組之間沒有顯著性差異(P>D.05),在25μg/mL以下MT-2的生長與對照組之間沒有顯著性差異(PD.05). 結(jié)論: 1.茶多酚衍生物是文獻報道能對HIV感染的多個環(huán)節(jié)都有抑制效果的化合物,茶黃素衍生物低濃度時沒有表現(xiàn)出抑制CD4,趨化因子受體與gp120的相互作用卻表現(xiàn)出抑制gp41核心結(jié)構(gòu)6-HB形成的活性,且觀察發(fā)現(xiàn)化合物中含有沒食子酰基的比不含的活性好,含的個數(shù)越多活性越好,推測其活性可能是通過化合物自身帶的微弱的負電荷與靶點(如N末端574位的賴氨酸)的正電荷形成離子鍵實現(xiàn)的.茶多酚自身的多酚結(jié)構(gòu)使它具有上述活性,但是正因為含有多個酚羥基使化合物整體易氧化,不穩(wěn)定,且與相并的酚酮七元環(huán)一起形成一個大共軛體系使得化合物顏色較深,水溶性也不好.我們的研究通過對三個衍生物的酚酮七元環(huán)的雙鍵進行還原,在不破壞酚羥基的前提下盡量減少生色基團,并對改造后的產(chǎn)物進行體外活性檢測.還原后化合物的顏色變淺,水溶性也增加了.ELISA, N-PAGE實驗的結(jié)果都顯示改造后化合物表現(xiàn)出良好的抑制六螺旋束形成的活性.細胞融合實驗顯示茶黃素衍生物表現(xiàn)出與文獻報道值相似的活性,結(jié)構(gòu)改造后的三個化合物活性比改造前還好,推測可能是因為改造后化合物水溶性提高,穩(wěn)定性增強,且空間構(gòu)象也發(fā)生了一些變化,相同條件下到達靶位的有效濃度提高,更加有利于化合物與靶點的結(jié)合.這些結(jié)果既為進一步的結(jié)構(gòu)改造提供了方向又在化合物的作用機制研究方面提供了有力的證據(jù). 2.番石榴葉提取物總黃酮和總皂苷雖然是混合成分,但主要成分黃酮和皂苷含量都在55%以上.二者都能在很大范圍內(nèi)安全有效的抑制HIV-1包膜介導(dǎo)的細胞融合,這說明二者可以在HIV的進入階段起到抑制作用,且細胞毒性實驗證明在有效范圍內(nèi)樣品對細胞的生長沒有抑制作用.而靶向gp41的抗體免疫實驗ELISA表明二個樣品都可以在微克每毫升的水平抑制gp41核心構(gòu)象6-HB的形成,該結(jié)果還被N-PAGE實驗證實,這說明二者在進入過程中的抑制作用可能是通過抑制了該過程中很重要的環(huán)節(jié)六股螺旋體的結(jié)構(gòu)形成來實現(xiàn)的. 第二章ADS-J1抑制HIV進入的作用機制研

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網(wǎng)址: 天然來源化合物抗HIV的活性篩選和ADS http://www.u1s5d6.cn/newsview459832.html