摘要：中藥成分的生物學(xué)活性評價(jià)是探索中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的主要手段.分別從整體動物、細(xì)胞、分子3個層面,系統(tǒng)論述了10年來該領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)展,以及依托新技術(shù)篩選出的新中藥活性組分及單體化合物.同時分析了不同技術(shù)的長處及不足,以期能為中藥新藥研發(fā)提供資料及思路.

Evaluation and screening for biological activity of components in Chinese materia medica

Abstract: Biological activity evaluation of Chinese materia medica (CMM) composition is one of the main means to explore the active components of CMM. This paper, from the three aspects of whole animal, cellular, and molecular, discusses systematically the technical progress in this area over the past 10 years and the screening of new active ingredients from CMM and monomer compounds based on new technology. At the same time, the different technical strengths and weaknesses have been analyzed in the hope of providing the information and ideas for the research on the new drugs of CMM.

Key words:bioactive components in Chinese materia medica    biological activity evaluation    membrane affinity chromatography    biomacromoleculer affinity chromatography    high performance liquid chromatography-biological activity after column on-line detection    

中藥對人類健康的貢獻(xiàn)日益受到國際社會的關(guān)注，然而多數(shù)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不清已成為制約中藥發(fā)展的瓶頸。在“回歸自然”浪潮及中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化的大環(huán)境下，運(yùn)用現(xiàn)代科技手段闡明中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)，是中藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容，也是提高中藥療效、穩(wěn)定中藥質(zhì)量的重要手段。眾所周知，中藥化學(xué)成分復(fù)雜，除極少數(shù)礦物藥以外，每一個單味中藥所含的成分就相當(dāng)于一個化合物庫。這些眾多類型的化合物并非均是活性分子。中藥特定的藥理活性往往與某些具有一定結(jié)構(gòu)特征的分子群直接相關(guān)。中藥活性成分篩選的目的是尋找中藥中發(fā)揮治療作用的化學(xué)成分群或明確中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。近年來，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)、化學(xué)分離技術(shù)的發(fā)展，中藥成分生物學(xué)活性評價(jià)及篩選研究日趨繁榮。本文系統(tǒng)總結(jié)了10年來該領(lǐng)域的研究進(jìn)展，以及依托這些技術(shù)所獲得的所有中藥活性成分，以期能為中藥新藥研發(fā)提供資料及思路。

1 整體藥效評估篩選法

神農(nóng)嘗百草是最原始的以人為試驗(yàn)對象的整體藥效評估法，也是鑒定藥物、食物與毒物，尋找中藥資源最有效、最直接，當(dāng)然也是最危險(xiǎn)的方法。因而以動物（包括正常、疾病動物模型）進(jìn)行藥效評估的要求自然產(chǎn)生。動物層次藥效評估能夠從整體水平檢測藥物的療效、毒副作用，其結(jié)果最接近人體試驗(yàn)。目前，利用疾病動物模型進(jìn)行藥效評估是中藥新藥研發(fā)過程中必不可少的環(huán)節(jié)，多種疾病的動物模型，如高血壓、高脂血癥、糖尿病等，也日趨成熟。

利用ip四氧嘧啶所致的糖尿病小鼠模型，金清等[1]系統(tǒng)評估了木香Aucklandiae lappa Decne. 的乙醇提取物，乙醇提取物醋酸乙酯部位、正丁醇部位和水提取部位降血糖效果；發(fā)現(xiàn)其中乙醇提取物醋酸乙酯部位降血糖活性較強(qiáng)；并對該部位用柱色譜法繼續(xù)分離、精制，同時進(jìn)行降血糖活性檢測。最后篩選出了2種新的天然降血糖活性成分，木香烴內(nèi)酯（costunolide）、去氫木香內(nèi)酯（dehydrocostus lactone）。譚斌等[2]利用大孔樹脂吸附瓜蔞皮Trichosanthes kirilowii Maxim. 水煎液，然后分別用95%、70%、40%的乙醇及雙蒸水洗脫，去除乙醇得到瓜蔞皮的4個提取物。采用舌下注射低密度脂蛋白（LDL）的方法制備大鼠血管內(nèi)皮損傷模型。利用該模型評價(jià)上述4種提取物的血管保護(hù)活性，發(fā)現(xiàn)其中水、70%乙醇提取物對大鼠血管內(nèi)皮損傷保護(hù)作用顯著。高文義等[3]以正常大鼠在給藥前后血壓變化情況，觀察茺蔚子Leonuri Fructus醇提液的乙醚、醋酸乙酯、正丁醇和水萃取物的降血壓活性；發(fā)現(xiàn)茺蔚子水溶性成分對正常大鼠降血壓作用明顯，水層中主要含生物堿類成分，因而生物堿可能是茺蔚子降血壓作用的主要活性成分。

盡管利用動物模型進(jìn)行新復(fù)方中藥活性評價(jià)的研究資料不勝枚舉，但通過該方法進(jìn)行中藥活性成分篩選的資料卻很少。主要原因是需要的受試樣品量大，而多種中藥單體極難大量制備，不能滿足實(shí)驗(yàn)要求；另外該方法實(shí)驗(yàn)周期長，工作量大，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、高通量篩選。因而，用于活性成分篩選的各種細(xì)胞模型應(yīng)運(yùn)而生。

2 細(xì)胞層次的活性評估法

細(xì)胞是生命最基本的結(jié)構(gòu)與功能單位。對于一個完整而有活性的細(xì)胞來說，生存環(huán)境中各種因素的變化，均會引起其內(nèi)部的代謝變化；因而能夠?yàn)橹兴幓钚猿煞趾Y選提供一個最小而又相對完整的生物體系。同時使用培養(yǎng)的細(xì)胞篩選活性成分成本低、周期短，因此細(xì)胞藥物篩選模型得到了迅速發(fā)展[4]。2.1 抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型

目前各種癌細(xì)胞株不僅容易獲得、易于培養(yǎng)，而且實(shí)驗(yàn)操作簡單。因而，檢測某中藥成分是否可體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡或抑制增殖已經(jīng)成為抗腫瘤中藥活性成分篩選第一步。以這種方法配合動物體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)，已成功從中藥中發(fā)現(xiàn)了眾多抗腫瘤的候選藥物[4]。

常中飛等[5]利用人肝癌HepG-2細(xì)胞株、大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)材料，MTT法檢測魔芋Amorphophallus rivieri Durieu 的水提物、醇提物、醋酸乙酯萃取物及石油醚萃取物對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，發(fā)現(xiàn)其中醋酸乙酯萃取物及石油醚萃取物可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖。采用沉淀反應(yīng)或顏色反應(yīng)對這2種萃取物進(jìn)行化學(xué)成分分析，結(jié)果顯示其主要成分為有機(jī)酸、生物堿、黃酮類、揮發(fā)油、香豆素等。劉春宇等[6]培養(yǎng)了人早幼粒白血病細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人低分化胃腸癌細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞和人宮頸癌細(xì)胞等多種細(xì)胞株，利用MTT法對沙苑子Astragali Complanatii Semen不同成分群體外抑制癌細(xì)胞增殖的效果進(jìn)行評估，同時采用S180小鼠肉瘤模型進(jìn)行體內(nèi)抑瘤效果檢驗(yàn)，從而明確沙苑子總黃酮為其抗腫瘤的主要活性成分。

2.2 細(xì)胞保護(hù)的藥物評價(jià)篩選模型

張子理等[7]通過在培養(yǎng)液中添加黨參Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf. 系列提取物處理小腸隱窩細(xì)胞株（IEC-6），檢測不同成分對細(xì)胞生存、增殖的作用效果，以及對該細(xì)胞分泌功能的影響，從而建立了胃腸黏膜損傷修復(fù)藥物篩選的細(xì)胞模型，并篩選了黨參中具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖作用防治胃潰瘍的活性成分。原江鋒等[8]體外建立人血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304/大腦皮層細(xì)胞株C6細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，作為血腦屏障（BBB）藥物篩選模型，從丹參Salvia miltiorrhiza Bge. 提取液中篩選可能作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活性成分，并結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）分析，發(fā)現(xiàn)丹參提取液中至少有16種成分能夠透過BBB，其中4種成分為隱丹參酮（cryptotanshinone）、丹參酮I（tanshinone I）、丹參素（tanshinol）和原兒茶酸（protocatechuic acid）。

2.3 特定靶受體篩選的細(xì)胞模型

隨著細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)理論不斷豐富，學(xué)者們逐漸認(rèn)識到某些關(guān)鍵受體是多種藥物的作用靶點(diǎn)。因而從中藥中篩選某種功能細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵受體的激活劑或抑制劑成為中藥藥理學(xué)界的研究熱點(diǎn)。這種方法的成功建立依賴于穩(wěn)定表達(dá)特定關(guān)鍵受體的細(xì)胞。多種細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)組織細(xì)胞特異性受體，這給受體激活或抑制劑篩選細(xì)胞模型的建立提供了方便。

巨噬細(xì)胞表達(dá)豐富的甘露糖受體（MR）。MR可與以甘露糖末端的配體結(jié)合。田維毅等[9]利用這一特點(diǎn)，建立巨噬細(xì)胞甘露糖受體（MMR）結(jié)合物篩選模型。大致過程是體外培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞→將該細(xì)胞分別與不同濃度的D-甘露糖、D-半乳糖共同孵育→除去未結(jié)合D-甘露糖、D-半乳糖→細(xì)胞與異硫氰酸熒光素標(biāo)記的甘露糖化牛血清白蛋白（M- FITC-BSA）共同孵育→流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡檢測巨噬細(xì)胞與M-FITC-BSA的結(jié)合率，檢測模型的有效性。通過優(yōu)化各種實(shí)驗(yàn)條件，建立有效的MMR篩選模型；并用于篩選四物湯等6個復(fù)方多糖中的MR結(jié)合成分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在一定濃度下，四君子湯、六味地黃湯和玉屏風(fēng)散多糖組分能明顯拮抗巨噬細(xì)胞與M-FITC-BSA的結(jié)合。因而，這3種復(fù)方多糖可能通過與MR結(jié)合發(fā)揮藥理活性。

另一種方法是通過基因轉(zhuǎn)染的方法，使特定細(xì)胞株內(nèi)穩(wěn)定、大量表達(dá)某種特異性受體，從而得到建立模型所需要的細(xì)胞株。這種方法有很多成功的例子。為篩選能激活D5受體的天然活性成分，鄧小紅等[10]以人多巴胺受體D5R基因轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞株HEK293，以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染抗性篩選劑G418篩選后，獲得了多株D5受體單克隆細(xì)胞。隨后采用cAMP響應(yīng)陽性（CRE）藥forskolin和D5受體特異性激動劑SKF38393進(jìn)行刺激，摸索出D5受體激動劑高通量篩選的最佳條件。利用該細(xì)胞篩選模型，該課題組對200余種中藥水提物進(jìn)行了初步篩選，從中選出了3種可明顯激活D5受體的中藥水提物，為D5受體激動劑的篩選打下基礎(chǔ)。

3 生物大分子層次的活性評估法

細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)理論的發(fā)展同時催生了生物大分子層次的中藥成分活性評價(jià)及篩選方法。該方法屬于靶受體或酶的體外篩選模式，其思路是如果已證實(shí)某關(guān)鍵的信號通路與某生理、病理環(huán)節(jié)密切相關(guān)，那么以該信號通路上的關(guān)鍵受體、酶為探針，從眾多中藥成分中篩選靶受體的激活劑、抑制劑，或靶酶的催化劑、抑制劑、底物；從而發(fā)現(xiàn)候選藥物。核心技術(shù)是把關(guān)鍵的受體、酶從組織細(xì)胞內(nèi)分離純化出來，選擇合適的對照品，在合適的反應(yīng)體系中與各種中藥提取物、部位、組分等成分共同孵育，利用靈敏的檢測器通過光吸收等原理檢測是否發(fā)生免疫結(jié)合或酶促反應(yīng)。在分子層次對中藥成分進(jìn)行生物學(xué)活性評估，不依賴動物模型與細(xì)胞、受試樣品需要量少、實(shí)驗(yàn)周期短、費(fèi)用低、操作過程可實(shí)現(xiàn)自動化，因而極大提高了篩選的通量與規(guī)模。目前，中藥學(xué)、天然藥物學(xué)界的許多學(xué)者將摸索成熟的活性檢測技術(shù)與各種色譜、質(zhì)譜技術(shù)等聯(lián)合應(yīng)用，建立了多種中藥活性成分高通量篩選技術(shù)模式，發(fā)現(xiàn)了多種新的天然活性成分，或多種中藥成分的新的生物學(xué)活性。

3.1 普通體外篩選模式

這種篩選方式中，中藥成分的活性檢測與不同成分的分離分析、結(jié)構(gòu)鑒定分別進(jìn)行。其基本思路是利用純化的特定酶、受體，先檢測中藥粗提物或部位的活性，選擇其中活性顯著部位，利用色譜、質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行精細(xì)的成分分離、鑒定。α-葡萄糖苷酶抑制劑類成分可抑制小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶的活性，延緩或抑制葡萄糖在腸道的吸收，從而有效降低餐后高血糖。許芹永等[11]利用體外抑制模型，從肉桂Cinnamomum cassia Presl. 的石油醚提取物中篩選出了α-葡萄糖苷酶抑制劑桂皮醛（cinnamal- dehyde）、肉桂酸（cinnamic acid）。酪氨酸酶是皮膚黑色素形成過程中的關(guān)鍵酶，該酶的抑制劑可能具有美白護(hù)膚的功效。通過檢測丹參不同極性溶劑提取部位對酪氨酸酶活性的抑制作用，發(fā)現(xiàn)丹參氯仿萃取層具有較強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性，其中起主要作用的是丹參素（tanshinol）、原兒茶醛（protocate- chuicaldehyde）[12]。樸香蘭等[13]利用相似的方法從連翹Forsythia suspense (Thunb.) Vahl 篩選到了酪氨酸酶抑制成分白樺脂酸（betulinic acid）。

3.2 生物色譜技術(shù)

生物色譜技術(shù)是一種新興的親和色譜技術(shù)，以有活性的細(xì)胞膜、生物大分子作為靶標(biāo)固著在色譜填料上形成固定相，以各種緩沖溶液為流動相。中藥提取物作為溶質(zhì)添加在流動相中。中藥提取物經(jīng)過色譜柱時，其中不同成分與靶標(biāo)作用程度、結(jié)合性能不同，從而在固定相上表現(xiàn)出不同的保留行為。根據(jù)保留行為的差別，結(jié)合使用高分離效能的HPLC、高分辨率的質(zhì)譜檢測技術(shù)，具有不同生物學(xué)活性的成分即被篩選、分離出來。根據(jù)不同的固定相，生物色譜技術(shù)分為細(xì)胞膜色譜技術(shù)和大分子親和色譜技術(shù)[14]。

3.2.1 細(xì)胞膜色譜技術(shù)

細(xì)胞膜上存在多種受體，一般單個細(xì)胞的受體密度可達(dá)103～104數(shù)量級，是篩選多靶標(biāo)中藥活性成分的理想材料[15]。血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR 2）在血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）中表達(dá)豐富，該受體的激活對VEC發(fā)揮正常功能必不可少。李義平等[16]以硅膠為載體制備ECV304細(xì)胞膜固定相，建立了VEC膜色譜模型，并利用該模型篩選紅毛三七中的活性成分，并進(jìn)行初步藥理學(xué)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)塔斯品堿（taspine）能夠選擇性地作用于VEGFR 2，并顯著抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）誘導(dǎo)的血管管腔形成。利用相同的ECV304細(xì)胞膜色譜模型，蒙麥俠等[17]以抗VEGF抗體為對照，發(fā)現(xiàn)竹根七的醋酸乙酯萃取部位中的ZGQ-C成分群和EVC細(xì)胞膜高度親和，MTT法檢測證實(shí)該成分顯著抑制EVC的增殖。

表皮生長因子受體（EGFR）在多種惡性腫瘤中過度表達(dá)，被激活后促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、加速腫瘤轉(zhuǎn)移和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。從中藥中尋找EGFR拮抗劑或抑制劑是目前的研究熱點(diǎn)。王嗣岑等[18]采用高表達(dá)EGFR的HEK293細(xì)胞系制備細(xì)胞膜色譜固定相，將該色譜模型與高效液相色譜/質(zhì)譜（HPLC/MS）聯(lián)用，從獨(dú)活A(yù)ngelica pubescens Maxim. f. 中篩選出與EGFR高度親和的成分蛇床子素（osthole）。MTT及ELSIA檢測證實(shí)蛇床子素顯著抑制EGFR/HEK293細(xì)胞增殖，并可與EGFR結(jié)合。采用相似的方法，張宇潔等[19]研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素也是長春七Libanotis buethorimensis (Fisch.) DC. 中與紅細(xì)胞膜高度親和，并對紅細(xì)胞有細(xì)胞毒性的活性成分。Wang等[20]采用A431細(xì)胞膜色譜和高效液相色譜/質(zhì)譜從中藥中篩選EGFR拮抗劑，發(fā)現(xiàn)苦參Sophora flavescens Ait. 中的氧化苦參堿（oxymatrine）和苦參堿（matrine）能夠作用于EGFR。

佛手Citrus medica L. 是常用的抗血壓中藥，但有效成分尚不清楚。為從佛手中篩選舒張血管的有效成分，王艷微等[21]采用血管平滑肌細(xì)胞膜色譜（VSM/CMC）模型，結(jié)合HPLC/MS分析，并經(jīng)離體動脈舒張實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定了佛手柑內(nèi)酯（bergapten）是該藥的主要活性成分。與此類似，趙惠茹等[22]用家兔胸主動脈血管細(xì)胞膜為固定相，從當(dāng)歸Angelica sinensis (Oliv.) Diels 揮發(fā)油中分離出對主動脈血管有舒張作用的2種有效成分。Yang等[23]建立了大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞膜色譜，并結(jié)合液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）分析技術(shù)，從五味子Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. 與南五味子Schisandra sphenanthera Rehd. et Wils. 中篩選出了具有血管擴(kuò)張活性的成分去氧五味子素（deoxyschisandrin）和五味子酯甲（schisantherin A）。采用大鼠心肌細(xì)胞膜色譜柱，結(jié)合高效液相-飛行時間質(zhì)譜（TOF/MS）分析，曹巖等[24]從附子Aconitum carmichaeli Debx. 中初步篩選、鑒定出8個與心肌細(xì)胞膜高親和性的成分，主要有單酯型的苯甲酰烏頭胺（benzoylaconine）、苯甲酰新烏頭胺（benzoylmesaconine）和苯甲酰次烏頭胺（benzoylhypaconine）。Hou等[25]以硅膠為載體制備MDA-MB-231細(xì)胞膜固定相，結(jié)合2D LC-MS分析技術(shù)，篩選厚樸Magnolia officinalis Rehd. et Wils.中具有抗乳腺癌活性的成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和厚樸酚（honokiol）和木蘭醇（magnol）為其主要抗乳腺癌活性成分。

固定相采用動物細(xì)胞膜，細(xì)胞膜色譜技術(shù)能夠較好地模擬活性成分與細(xì)胞膜及膜蛋白的相互作用，但由于離體細(xì)胞膜容易失活，使得色譜柱的壽命較短。

3.2.2 生物大分子親和色譜技術(shù)

與細(xì)胞膜色譜技術(shù)不同，大分子親和色譜技術(shù)是將有活性酶、受體、DNA、抗體、血漿中的運(yùn)輸?shù)鞍谆蚓哂衅渌匾砉δ艿纳锎蠓肿宇A(yù)先分離、純化出來，然后直接與色譜填料相偶聯(lián)，并制備成色譜柱。色譜柱上的成分單一，能排除非目的分子的干擾。

鄭曉暉等[26]從家兔肺組織中純化得到β2-腎上腺素受體（β2-AR），以大孔硅膠為載體，建立了β2-AR親和色譜方法，從苦杏仁Armeniacae Amarum Semen中篩選出了可與β2-AR相結(jié)合的活性成分苦杏仁苷（amygdalin）。王芳煥等[27]采用羰基咪唑法合成人血清白蛋白（HAS）與大孔硅膠相結(jié)合的生物色譜填料，并使用該色譜柱從鐵棒錘Aconitum pendulum Busch 中篩選出了與HAS相結(jié)合的4種活性物質(zhì)脫乙酰去氧烏頭堿（deacetylated deoxyaconitine）、苯甲酰脫氧烏頭堿（benzolde- oxyaconitine）、烏頭原堿（aconine）、苯甲酰新烏頭原堿（benzoylmesaconine）。

生物色譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)了中藥活性成分篩選和分離的一體化，也提高了從復(fù)雜體系中識別目標(biāo)成分的特異性、敏感性和選擇性，目前在其推廣和應(yīng)用方面卻存在一些困難[28]：其一，由于各種中藥活性成分在生物體內(nèi)的作用靶點(diǎn)不同，所以色譜柱制備時選用的生物活性物質(zhì)、固定相材料也不同，使得生物色譜固定相的制備困難。其二，色譜分離的條件和保持固定相生物活性的條件不能同時兼顧。其三，由于固定相含有蛋白質(zhì)或其他生物大分子，大分子親和色譜的分離能力與常規(guī)的高效液相色譜（HPLC）相比較低。其四，生物色譜柱特異性保留的中藥活性成分的量一般都較少，也難以收集到足夠的量供分子結(jié)構(gòu)鑒定使用[29]。

3.3 HPLC柱后生物活性聯(lián)機(jī)檢測技術(shù)

HPLC柱后生物活性聯(lián)機(jī)檢測技術(shù)是將分離功能強(qiáng)大的HPLC技術(shù)、成熟的生物活性體外生化檢測技術(shù)聯(lián)合使用，實(shí)現(xiàn)了化學(xué)分離與活性檢測的同步進(jìn)行，克服了傳統(tǒng)藥物篩選方法存在的操作繁瑣、成本高等缺點(diǎn)，已被廣泛地應(yīng)用于中藥或天然產(chǎn)物中抗氧化劑、乙酰膽堿酯酶（AChE）抑制劑、磷酸二酯酶（PDE）抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)移酶（ACE）抑制劑、細(xì)胞色素P450抑制劑等的篩選[30]。

3.3.1 天然抗氧化劑篩選

利用抗氧化劑的還原性，從HPLC中流出的成分在反應(yīng)單元中與特定的氧化劑反應(yīng)，檢測反應(yīng)前后吸收光譜的變化，來進(jìn)行抗氧化活性成分篩選。根據(jù)所用氧化劑的不同，該方法可分為1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法、2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二鹽（ABTS）法和磷鉬絡(luò)合物法[31]。DPPH在溶液中顯紫色，在517 nm處有最大吸收；與抗氧化劑作用，生成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的DPPH-H，在517 nm的吸收峰消失，在色譜圖中形成倒峰[32]。與此類似，ABTS?+在743 nm處有最大吸收?？寡趸瘎┛墒蛊滢D(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的ABTS，在色譜圖中743 nm處形成倒峰[33]。而具有抗氧化活性的化合物與6價(jià)的磷鉬試劑進(jìn)行反應(yīng)，生成5價(jià)的藍(lán)色磷鉬絡(luò)合物，其倒峰的位置處于598 nm處[34]。10多年來，利用該技術(shù)篩選出的天然抗氧化劑近50種[30]。

利用HPLC-ABTS技術(shù)，耿雪飛等[35]對細(xì)葉杜香Ledum palustre L. 莖部的抗氧化活性成分進(jìn)行了篩選、分析，發(fā)現(xiàn)該藥材甲醇提取物抗氧化活性顯著。經(jīng)核磁共振從該提取物的二氯甲烷萃取層鑒定出一種成分為秦皮素（fraxetin）。He等[36]也利用此技術(shù)從梔子Gardenia jasminoides Ellis中檢測出了具有清除自由基活性的化學(xué)成分，其中異綠原酸A（isochlorogenic acid A）為最主要的抗氧化成分。利用HPLC-DPPH法，王小淞等[37]系統(tǒng)檢測了黃芩Scutellaria baicalensis Georgi根、莖、葉提取物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)不同部位提取物抗氧化活性成分差異顯著，并比較了10個不同產(chǎn)地的黃芩根提取物中抗氧化活性成分，結(jié)果顯示其都含有黃芩素（baicalein）、黃芩苷（baicalin）、二氫黃芩苷（dihydrobaicalin）、降漢黃芩素（norwogonin）、野黃芩苷（scutellarin）這5種抗氧化活性成分。

3.3.2 酶抑制劑篩選

生物體內(nèi)某些酶的底物和產(chǎn)物光吸收譜差異較大。HPLC柱后活性聯(lián)機(jī)檢測技術(shù)正是利用了這種性質(zhì)，篩選AChE、PDE、ACE及細(xì)胞色素P450的抑制劑的。AChE可催化乙酰膽堿生成5′-硫醇基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2- nitrobenzoate，λmax＝405 nm）[38]。PDE可以和2′-(N-甲基鄰氨基苯甲酰)環(huán)磷酸鳥苷、腺苷（mant-cGMP、mant-cAMP）反應(yīng)，分別生成2′-(N-甲基鄰氨基苯甲酰)磷酸鳥苷、腺苷（mant-GMP、mant-AMP），與mant-cGMP、mant-cAMP相比，mant-GMP、mant- AMP的熒光強(qiáng)度明顯降低[39]。而ACE催化abz-FRK(dnp)P-OH生成熒光物質(zhì)abz[39, 40]。細(xì)胞色素P450催化乙氧基鹵試靈生成熒光物質(zhì)鹵試靈[37]。當(dāng)上述酶的抑制劑存在時，反應(yīng)產(chǎn)物的量顯著減少。中藥成分經(jīng)HPLC分離后，柱后進(jìn)入活性檢測單元，與檢測試劑作用，在適當(dāng)?shù)牟ㄩL檢測吸光度，具有抑制活性的成分會呈現(xiàn)倒峰[38, 39, 40, 41]。

HPLC柱后活性聯(lián)機(jī)檢測技術(shù)雖然操作簡便、篩選速度快、專屬性高，但不能闡明活性成分的作用通路，而且色譜分離得到多種化學(xué)成分非常少，難以產(chǎn)生明顯的峰響應(yīng)。

4 結(jié)語

中藥成分的復(fù)雜性及作用靶點(diǎn)的多樣性決定了對其進(jìn)行生物學(xué)活性評估的艱巨性。整體動物層次的藥效評估雖然結(jié)果最接近人體試驗(yàn)，也符合中藥多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)；然而需要的受試樣品量多、工作量巨大。多數(shù)中藥成分在藥材中量較少，無法用這種方法進(jìn)行活性評估。體外細(xì)胞、分子層次的活性評價(jià)方法提高了從復(fù)雜中藥成分體系中識別目標(biāo)成分的特異性、敏感性，也能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、高通量篩選；然而只能驗(yàn)證特定成分在特定細(xì)微的生化環(huán)節(jié)上具有活性，不能代表該成分在體內(nèi)有藥用效果；而且也忽略了中藥多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)，脫離了中醫(yī)理論的指導(dǎo)，也無法真正尋找到中藥活性成分。因而，中藥成分的生物學(xué)活性評價(jià)及篩選不存在通用方法。以活性為導(dǎo)向，體內(nèi)、體外多種方法相結(jié)合，才能對多種多樣的中藥成分進(jìn)行全面、客觀的活性評估，及篩選到確實(shí)有效的活性成分。

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