利用斑馬魚評價(jià)供試品抗衰老功效

【實(shí)驗(yàn)原理】

目前的研究表明皮膚衰老原因有：β-半乳糖苷酶活性增高（在衰老的細(xì)胞中活性升高，是衰老細(xì)胞最常用的標(biāo)志物之一）、活性氧積聚、膠原蛋白與彈性蛋白流失、基質(zhì)金屬酶上調(diào)、MAPK和cAMP途徑激活等等。

皮膚皺紋的出現(xiàn)與膠原蛋白的正常合成和表達(dá)密切相關(guān)。斑馬魚具有與人高度保守的調(diào)控膠原蛋白的相關(guān)基因。通過檢測斑馬魚膠原蛋白基因RNA的相對表達(dá)量可以反映護(hù)膚產(chǎn)品的抗皺功效。彈性蛋白與膠原蛋白共同存在與胞外基質(zhì)對于皮膚彈性的維系起著重要作用，是皮膚松弛、下垂等老化現(xiàn)象的主要原因。斑馬魚具有與人高度保守的調(diào)控彈性蛋白的基因，通過檢測斑馬魚彈性蛋白基因RNA的相對表達(dá)量可以反映護(hù)膚產(chǎn)品的緊致功效。

活性氧（ROS）是含氧的化學(xué)反應(yīng)性化學(xué)物質(zhì)，其在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和體內(nèi)平衡中具有重要作用。然而在紫外線暴露期間，ROS水平會(huì)急劇增加。這可能會(huì)對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重?fù)p害，這被稱為氧化應(yīng)激。當(dāng)自由基產(chǎn)生量大于機(jī)體清除能力時(shí)就發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激時(shí)超氧化物歧化酶( Superoxide dismutase，SOD)活性降低，產(chǎn)生過多的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛( Malondialdehyde，MDA)，谷胱甘肽過氧化物酶( Glutathione peroxidase，GSH-Px)是體內(nèi)重要過氧化物分解酶，能使過氧化物MDA還原，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。因此SOD、MDA、GSH-PX作為判斷氧化應(yīng)激程度的重要指標(biāo)。

衰老與端粒酶活性相關(guān)。端粒有重要的生物學(xué)功能，隨著年齡的增長，端粒DNA在體細(xì)胞分裂過程中自然縮短，當(dāng)端粒長度變得非常短時(shí)，端粒功能受損，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定、細(xì)胞衰老和凋亡。體細(xì)胞端粒會(huì)隨著年齡的增長而逐漸縮短，此時(shí)端粒酶會(huì)起到延緩端粒縮短的作用，端粒酶活性降低則端?？s短。可以通過檢測端粒酶活性是否增強(qiáng)來判斷供試品的抗衰老功效。

衰老與代謝緩慢相關(guān)，皮膚微循環(huán)可以反映代謝的快慢?？梢岳醚鞣治鰞x檢測受試斑馬魚的血流速度，評價(jià)改善微循環(huán)功效。

【實(shí)驗(yàn)方法】

將受測試斑馬魚分成若干組，含正常對照組和供試品組。其中正常對照組未經(jīng)任何處理，供試品組添加受試化妝品。加入化妝品24h后，對每組斑馬魚進(jìn)行收樣，使用試劑盒提取RNA，使用q-PCR檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄水平，通過斑馬魚皮膚膠原蛋白基因和彈性蛋白基因相對表達(dá)量評價(jià)化妝品增加皮膚彈性作用。(指標(biāo)1、2)

將受測試斑馬魚分成若干組，含正常對照組、模型對照組和供試品組。其中正常對照組未經(jīng)任何處理，模型對照組和供試品組都加入等量的甲萘醌。供試品組在加入甲萘醌的同時(shí)加入一定濃度的化妝品。使用化妝品24 h后，對斑馬魚整體進(jìn)行特異性熒光染色，觀察斑馬魚卵黃囊活性氧自由基產(chǎn)生情況。（指標(biāo)3）

將受測試斑馬魚分成若干組，含正常對照組、模型對照組和供試品組。其中正常對照組未經(jīng)任何處理，模型對照組和供試品組都加入等量的過氧化氫。供試品組在加入過氧化氫的同時(shí)加入一定濃度的化妝品。處理6 天后，將斑馬魚用4%多聚甲醛固定過夜，用β-半乳糖苷酶染色試劑盒進(jìn)行染色。染色結(jié)束后，分析統(tǒng)計(jì)斑馬魚整體β-半乳糖苷酶染色強(qiáng)度，以β-半乳糖苷酶染色強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評價(jià)供試品對衰老斑馬魚β-半乳糖苷酶活性的抑制作用；將斑馬魚勻漿取上清，用端粒酶活性檢測試劑盒檢測各實(shí)驗(yàn)組端粒酶活性是否增強(qiáng)；用SOD ELISA試劑盒測定各實(shí)驗(yàn)組SOD含量是否增加；用GSH ELISA試劑盒測定各實(shí)驗(yàn)組GSH含量是否增加。（指標(biāo)4、5、6、7）。

將斑馬魚分成兩組，分別是正常對照組和供試品組。正常對照組不做處理，供試品組添加一定濃度的受試化妝品，孵育24h小時(shí)后，通過血流分析儀分析觀察各組斑馬魚的血流速度，以血流速度的增加量評價(jià)受試化妝品改善微循環(huán)功效。（指標(biāo)8）

【評價(jià)指標(biāo)】

1、Ⅰ型膠原蛋白基因相對表達(dá)量

2、彈性蛋白基因相對表達(dá)量

3、ROS清除作用

4、β-半乳糖苷酶活性抑制作用

5、端粒酶活性

6、SOD含量

7、GSH含量

8、改善微循環(huán)-血流速度

【結(jié)果展示】

（*展示圖片僅供參考，實(shí)際實(shí)驗(yàn)組別依據(jù)合同而定）

1、膠原or彈性蛋白基因相對表達(dá)量：提供柱狀圖

圖1. 斑馬魚體內(nèi)col1a1b基因相對表達(dá)量

2、ROS熒光強(qiáng)度

圖2. 斑馬魚卵黃囊熒光表型圖

3、β-半乳糖苷酶活性、端粒酶活性、SOD含量、GSH含量(柱形圖，略)

4、改善微循環(huán)-血流速度（柱狀圖+視頻）

【評價(jià)結(jié)論】

本實(shí)驗(yàn)供試品組Ⅰ型膠原蛋白基因，彈性蛋白基因相對表達(dá)量增加，卵黃囊ROS熒光強(qiáng)度減少，β-半乳糖苷酶活性抑制，端粒酶活性增強(qiáng)，SOD，GSH含量增加，血流速度增大，說明該供試品具有抗衰老作用。

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