高純度低聚半乳糖單一組分的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高純度低聚半乳糖單一組分的制備方法，具體地說，是以微生物酶法合成的低聚半乳糖粗品為原料，采用國產(chǎn)廉價(jià)易得的樹脂為分離介質(zhì)，通過柱層析技術(shù)得到高純度的低聚半乳糖產(chǎn)品；以聚丙烯酰胺凝膠為分離介質(zhì)，制備得到高純度的低聚半乳糖單一組分產(chǎn)品。
背景技術(shù)
低聚半乳糖(GOS)在體內(nèi)不能被胃酸和胃酶降解，故不能被消化吸收，而是直接進(jìn)入小腸內(nèi)被有益菌尤其是雙歧桿菌利用，因此能有效促進(jìn)體內(nèi)雙歧桿菌的生長繁殖，改善脂質(zhì)代謝，促進(jìn)鈣的吸收和維生素的合成，并具有分解致癌物質(zhì)、提高人體免疫力等功能。在自然界，動物的乳汁中含有微量的低聚半乳糖，母乳中含量較多，這正是母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒具有較強(qiáng)的免疫力和防病能力的原因。低聚半乳糖作為功能性低聚糖大量地應(yīng)用于嬰幼兒食品、低熱量、低齲齒食品、糖尿病患者專用食品等，另外還應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥、飼料和口腔清潔等非食品行業(yè)。生產(chǎn)制備低聚半乳糖主要有3種方法：從天然原料中提取，化學(xué)合成法和微生物酶法合成。自然界中低聚半乳糖含量少，且無色、不帶電荷，很難分離提取?；瘜W(xué)合成法需要使用大量的化學(xué)試劑，因此毒性大，易殘留，在實(shí)際生產(chǎn)中不可行。而微生物酶法合成低聚半乳糖的β-半乳糖苷酶來源于安全無毒的霉菌和酵母，與其它方法相比，該法原料充足、方便、易得，生產(chǎn)成本低，是制備低聚半乳糖的最佳方法。微生物酶法合成低聚半乳糖是以高濃度乳糖做底物，在β-半乳糖苷酶的作用下，將乳糖水解的半乳糖轉(zhuǎn)移到乳糖基上，制得的低聚半乳糖是在乳糖的半乳糖基一側(cè)結(jié)合1～4分子的半乳糖的結(jié)合糖，屬于葡萄糖和半乳糖組成的雜低聚糖。國內(nèi)外對低聚半乳糖的制備技術(shù)研究得較多，日本、歐洲一些國家已實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，國內(nèi)也有少數(shù)幾個(gè)廠家在研制生產(chǎn)，但產(chǎn)量都不大。目前工業(yè)上低聚半乳糖都采用微生物酶法合成，由于酶源和反應(yīng)條件的不同，最終產(chǎn)品的純度也不同，約為24～57％，溶液中還存在大量未反應(yīng)的乳糖、少量產(chǎn)物葡萄糖和極少量的半乳糖。如果產(chǎn)品不進(jìn)行分離，一方面，未反應(yīng)的乳糖得不到回收再利用；另一方面，產(chǎn)品中大量存在的乳糖不但會引起乳糖不耐癥，在特殊人群中的食用受到一定的限制，而且很大程度上削弱了低聚半乳糖的生理功能及保健作用。雖然目前低聚半乳糖的制備技術(shù)研究得較多，但產(chǎn)品的下游分離純化技術(shù)卻很少有人研究，目前還沒有既經(jīng)濟(jì)又有效的低聚半乳糖的分離純化方法。
目前低聚糖分離純化的方法主要有酶法、微生物發(fā)酵法、納濾膜分離法和柱層析技術(shù)。酶法是利用酶制劑將混合物中的某些組分專一性地除去，例如混合物中的葡萄糖可以采用葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶除去，乳糖可以采用纖維二糖脫氫酶氧化為乳糖酸除去，但葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶和纖維二糖脫氫酶的價(jià)格很高，使得分離純化操作變得不經(jīng)濟(jì)。微生物發(fā)酵法是利用了大多數(shù)功能性低聚糖的難發(fā)酵性，選擇適當(dāng)?shù)奈⑸飳⒎枪δ苄蕴墙M分發(fā)酵除去，低聚糖混合物中的葡萄糖可以采用釀酒酵母選擇性地發(fā)酵為酒精除去，但乳糖很難發(fā)酵。納濾技術(shù)是通過在膜兩側(cè)施加某種推動力(如壓力差、濃度差等)，使得原料側(cè)組分有選擇性地透過膜，從而達(dá)到分離和提純的目的，該技術(shù)可以除去大部分葡萄糖，但乳糖的除去率較低，因而只能粗步分離低聚半乳糖混合物，分離后的產(chǎn)品仍然達(dá)不到高純度低聚糖(85％以上)的要求。另外，國內(nèi)外市場對低聚糖單一組分的需求量也較大，而目前還沒有適宜的的低聚半乳糖單一組分的制備方法。
發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種高純度低聚半乳糖及其單一組分的制備方法。解決目前低聚半乳糖混合物中乳糖含量較高，容易引起乳糖不耐癥，從而影響產(chǎn)品大規(guī)模應(yīng)用的問題，該方法擬采用國產(chǎn)廉價(jià)易得的陽離子交換樹脂分離低純度的低聚半乳糖原料，得到高純度的低聚半乳糖產(chǎn)品，并采用凝膠層析技術(shù)得到高純度的低聚半乳糖單一組分。
本發(fā)明的技術(shù)方案為：高純度低聚半乳糖及其單一組分的制備方法，包括以下步驟：
(1)將005×7強(qiáng)酸性聚苯乙烯系陽離子交換樹脂經(jīng)酸洗、堿洗后，轉(zhuǎn)為鈣型，脫氣后裝柱，為樹脂柱，聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)溶脹，傾出其中的細(xì)小顆粒，脫氣后裝柱，為凝膠柱；
(2)低聚半乳糖粗品經(jīng)樹脂柱分離，以蒸餾水為洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到純度85％以上的低聚半乳糖產(chǎn)品；
(3)將步驟(2)所得低聚半乳糖產(chǎn)品濃縮后，采用凝膠柱一次分離，蒸餾水為洗脫劑，得到純度85％以上的三糖、四糖和五糖單一組分。
前述的制備方法，優(yōu)選的技術(shù)方案是，還包括步驟(4)：將步驟(3)所得單一組分分別濃縮后經(jīng)凝膠柱二次分離，蒸餾水為洗脫劑，得到純度98％以上的三糖、四糖和五糖單一組分。
前述的制備方法，優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述步驟(2)樹脂柱長度80-100cm，直徑1cm，進(jìn)料量1-2mL，洗脫溫度50-80℃，洗脫流速15-25mL/h。更優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述步驟(2)樹脂柱長度90cm，進(jìn)料量1mL，洗脫溫度70℃，洗脫流速20mL/h。
前述的制備方法，優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述步驟(3)凝膠柱長度100-140cm，直徑1.6cm，進(jìn)料量2-4mL，洗脫溫度40-70℃，洗脫流速15-25mL/h。更優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述步驟(3)凝膠柱長度120cm，進(jìn)料量3mL，洗脫溫度50℃，洗脫流速20mL/h。
前述的制備方法，優(yōu)選的技術(shù)方案是，步驟(2)中所述低聚半乳糖粗品為微生物酶法合成的低聚糖混合物，其中低聚半乳糖的純度為24-57％。
前述的制備方法，優(yōu)選的技術(shù)方案是，樹脂柱和凝膠柱的上柱樣品中總糖質(zhì)量濃度為200-700g/L。
前述的制備方法，優(yōu)選的技術(shù)方案是，所用005×7強(qiáng)酸性聚苯乙烯系陽離子交換樹脂的粒度為150-180μm。
前述的制備方法，優(yōu)選的技術(shù)方案是，所用聚丙烯酰胺凝膠的粒度為45-90μm。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在于：
(1)采用005×7樹脂分離低聚半乳糖混合物，可以有效地除去葡萄糖，得到純度85％以上的含少量乳糖的低聚半乳糖產(chǎn)品。
(2)005×7樹脂廉價(jià)易得，柱層析過程操作簡單，成本低，耗時(shí)少(整個(gè)實(shí)驗(yàn)室操作只需要2.4h)，產(chǎn)品收率高，樹脂硬度大、耐壓、顆粒之間空隙大，有利于工業(yè)上放大生產(chǎn)。
(3)聚丙烯酰胺凝膠分離低聚半乳糖混合物，一次柱層析可以得到純度85％以上的低聚半乳糖單一組分產(chǎn)品，二次柱層析可以得到純度98％以上的低聚半乳糖單一組分，達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)品的要求。
附圖說明
圖1：005×7樹脂柱對低聚糖半乳糖粗品的分離效果。
圖2：Bio-Gel P-2凝膠柱對85％低聚糖半乳糖的分離效果。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例中所用原料皆可從市場購買。所用的強(qiáng)酸性聚苯乙烯系陽離子交換樹脂，購自南開大學(xué)化工廠，型號為005×7。所用的聚丙烯酰胺凝膠，為美國Bio-Rad公司的產(chǎn)品，型號為Bio-GelP-2。
實(shí)施例1高純度低聚半乳糖及其單一組分的制備方法，包括以下步驟：
(1)將005×7強(qiáng)酸性聚苯乙烯系陽離子交換樹脂經(jīng)酸洗、堿洗后，轉(zhuǎn)為鈣型，脫氣后裝柱，為樹脂柱，聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)溶脹，傾出其中的細(xì)小顆粒，脫氣后裝柱，為凝膠柱。所用005×7強(qiáng)酸性聚苯乙烯系陽離子交換樹脂的粒度為150-180μm。所用聚丙烯酰胺凝膠的粒度為45-90μm。
(2)低聚半乳糖粗品經(jīng)樹脂柱分離，以蒸餾水為洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到純度85％以上的低聚半乳糖產(chǎn)品(樹脂柱長度80cm，直徑1cm，進(jìn)料量1mL，洗脫溫度80℃，洗脫流速25mL/h)；
(3)將步驟(2)所得低聚半乳糖產(chǎn)品濃縮后，采用凝膠柱一次分離，蒸餾水為洗脫劑，得到純度85％以上的三糖、四糖和五糖單一組分(凝膠柱長度100cm，直徑1.6cm，進(jìn)料量2mL，洗脫溫度40℃，洗脫流速25mL/h)。
實(shí)施例2高純度低聚半乳糖單一組分的制備方法，與實(shí)施例1所不同的是，還包括步驟(4)：將步驟(3)所得單一組分分別濃縮后經(jīng)凝膠柱二次分離，蒸餾水為洗脫劑，得到純度98％以上的三糖、四糖或五糖單一組分。
實(shí)施例3高純度低聚半乳糖及其單一組分的制備方法，與實(shí)施例1所不同的是，步驟(2)中樹脂柱長度100cm，進(jìn)料量1.5mL，洗脫溫度50℃，洗脫流速15mL/h。步驟(3)中凝膠柱長度140cm，進(jìn)料量4mL，洗脫溫度60℃，洗脫流速15mL/h。
實(shí)施例4高純度低聚半乳糖及其單一組分的制備方法，包括以下步驟：
(1)005×7強(qiáng)酸性聚苯乙烯系陽離子交換樹脂經(jīng)酸洗、堿洗后，轉(zhuǎn)為鈣型，脫氣后裝柱。凝膠經(jīng)溶脹、傾出其中的細(xì)小顆粒，脫氣后裝柱。所用005×7強(qiáng)酸性聚苯乙烯系陽離子交換樹脂的粒度為150-180μm。所用聚丙烯酰胺凝膠的粒度為45-90μm。
(2)低聚半乳糖粗品的組成為葡萄糖7.1％，乳糖40.4％，低聚糖(包括三糖、四糖和五糖)52.5％，配置溶液質(zhì)量濃度為340g/L，采用005×7樹脂柱對該混合物進(jìn)行分離，蒸餾水為洗脫劑，樹脂柱長度90cm，進(jìn)料量1mL，洗脫溫度70℃，洗脫流速20mL/h，每2mL收集一管，分離效果見附圖1，由附圖1可以看出，005×7樹脂雖然對三糖、四糖和五糖之間的分離效果不明顯，但對它們(低聚糖)與乳糖和葡萄糖之間的分離效果較好，收集16-19管的組分得到高純度的低聚糖產(chǎn)品，其純度為88.2％，收率為86.7％。
(3)將步驟(2)的產(chǎn)品濃縮至濃度340g/L，采用Bio-Gel P-2凝膠柱進(jìn)行分離，蒸餾水為洗脫劑，凝膠柱長度120cm，進(jìn)料量3mL，洗脫溫度50℃，洗脫流速20mL/h，每3mL收集一管，分離效果見附圖2，由附圖2可以看出，Bio-Gel P-2不但對乳糖和三糖的分離效果較好，對三糖和四糖、四糖和五糖的分離效果也很好，分段分別收集各種組分，得到低聚三糖、四糖和五糖的純度分別為88.7％、85.1％和86.3％，收率分別為86.9％、79.5％和81.3％。
(4)將步驟(3)中的各種產(chǎn)品分別濃縮至質(zhì)量濃度300g/L，采用Bio-Gel P-2凝膠柱進(jìn)行分離，分離條件同步驟(3)，得到純度98％以上的低聚三糖、四糖和五糖，收率分別為95.5％、74.4％和96.7％，達(dá)到了分析用標(biāo)準(zhǔn)品的純度要求。

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