（1.陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2.陜西省果業(yè)管理局秦巴山區(qū)藍莓研究所，陜西 漢中 723000；3.陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723000）

摘 要：該研究以藍莓為主要原料，以酵母菌、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）為發(fā)酵菌種制備藍莓酵素，以超氧化物歧化酶（SOD）酶活性為考察指標，首先通過均勻設計試驗確定復合菌種的最佳接種量；其次通過單因素試驗，考察發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始總可溶性固形物含量及料液比對SOD活力的影響；最后通過響應面試驗獲得最佳發(fā)酵工藝條件。結果表明，酵母菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌三種菌株的最佳接種量分別為0.1%、2%、0.47%，藍莓酵素的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時間41.5 h，發(fā)酵溫度31 ℃，初始總可溶性固形物含量12°Bx，料液比1∶5（g∶mL），在此優(yōu)化條件下，藍莓酵素的pH值為3.14，酒精度為0.2%vol，總酚含量為3.14 mg/mL，花色苷含量為26.06 mg/mL，乳酸菌活菌數(shù)為1.01×107 CFU/mL，SOD酶活性為103.01 U/mL。

藍莓是抗氧化性最高的水果之一，富含活性酶和各種酚類物質，包括花色苷、黃酮醇和原花青素[1]。然而，由于藍莓容易受到機械損傷、微生物腐爛和水分流失的影響，因此極易變質，導致保質期短[2]。為了解決這些問題，將藍莓鮮果進行益生菌發(fā)酵用于生產(chǎn)藍莓酵素，可提高食品保質期、營養(yǎng)及感官品質，并去除食品基質中的不良化合物[3]。

隨著人們養(yǎng)生意識的增強，酵素因其較高的營養(yǎng)價值和保健功能逐漸出現(xiàn)在大眾的視野中[4]。酵素是指以動物、植物、菌類等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品[5]。藍莓漿果經(jīng)過微生物發(fā)酵不僅可以提高藍莓漿果的利用率，還能提高原料營養(yǎng)多樣性和生物活性[6-7]。而益生菌發(fā)酵菌種對藍莓酵素的品質和口感密切相關。益生菌的定義為“當攝入足夠量時，為宿主提供健康益處的活的微生物”[8]?；谌樗峋陌l(fā)酵有助于提高食物的營養(yǎng)價值和消化率，控制潛在感染，還與功能性生物活性物質有關[9]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是最常用于發(fā)酵植物性食品的菌種[10]。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）可以產(chǎn)生各種活性酶，將原料基質轉化為功能性成分[11]。酵母菌能夠促進乳酸菌等有益菌群繁殖，抑制病原微生物生長，提高食物消化率及增強人體免疫力[12]。利用益生菌在水果基質中發(fā)酵比乳制品更復雜，并且生長受其他微生物和發(fā)酵條件的影響，例如pH、溫度、時間等[13-14]。目前，已有關于發(fā)酵菌種制備藍莓酵素的研究報道[15-16]。LI S J等[17]從水果中篩選出植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌，發(fā)現(xiàn)其在藍莓汁中具有良好的發(fā)酵能力，活菌數(shù)超過10.0 lg CFU/mL，同時提高了酚類含量和抗氧化能力。白琳等[18]利用植物乳桿菌、乳酸片球菌、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌發(fā)酵藍莓果汁，均勻設計確定其最佳接種體積比例分別為22.45%、42.86%、14.29%、16.33%、4.10%，響應面優(yōu)化最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵時間36 h，發(fā)酵溫度37 ℃，初始接種量5.5×106 CFU/mL，初始總可溶性固形物（total soluble solid，TSS）含量為11°Bx，發(fā)酵后藍莓酵素的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力達87.45 U/g。李虹甫等[19]選擇植物乳桿菌J26對藍莓果汁在發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間24 h、發(fā)酵劑接種量3%的條件下進行發(fā)酵，活菌數(shù)可達1×109 CFU/mL。然而，我國的藍莓酵素還處于初步階段，其生產(chǎn)研究和產(chǎn)業(yè)化都不完善[20-23]。此外，發(fā)酵工藝還存在原料利用率低；發(fā)酵參數(shù)變化復雜、難以控制且發(fā)酵周期較長；營養(yǎng)成分損失大、成本高、品質低、效率差等問題。

本研究以藍莓為主要原料，以酵母菌、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）為發(fā)酵菌種制備藍莓酵素，以SOD酶活性為考察指標，首先通過均勻設計試驗確定復合菌種的最佳體積接種比例；其次通過單因素試驗，考察發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始總可溶性固形物含量及料液比對超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響；最后通過響應面試驗獲得最佳發(fā)酵工藝條件。以期生產(chǎn)具有高抗氧化能力的新型發(fā)酵非乳制飲料，為生產(chǎn)品質優(yōu)良、營養(yǎng)豐富的藍莓酵素提供理論依據(jù)和技術支持，提高藍莓的利用率和附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮藍莓：產(chǎn)自陜西漢中；葡萄酒果酒專用酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：西安灃東新城永勝食品廠；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）21809、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）6104：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；果膠酶（30 000 U/g）、纖維素酶（100 000 U/g）、半纖維素酶（50 000 U/g）：山東隆科特酶制劑有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術有限公司；總超氧化物歧化酶（T-SOD）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；冰乙酸（分析純）：成都市科隆化學品有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；氯化鈉（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

T6紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；DSX-18L高壓蒸汽滅菌鍋：上海博訊醫(yī)療生物儀器有限公司；TDZ4A-WS臺式低速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學儀器廠；NR-EW63WXA-H冰箱：中國海爾公司；CP114電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；PHS-3C pH計：上海儀電科學儀器有限公司；JYL-C50T打漿機：九陽股份有限公司；DH3600BⅡ電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；手持式折光儀：艾普計量儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍莓酵素加工工藝流程及操作要點

藍莓預處理→清洗、打漿→酶解→調整糖度→滅菌→接種→發(fā)酵→靜置→過濾→藍莓酵素成品

操作要點：

酵母菌活化：將葡萄酒果酒專用酵母用10倍蒸餾水攪拌均勻至溶解，放置在30～35 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min，當出現(xiàn)大量泡沫即表明活化完畢，取出備用。植物乳桿菌（干酪乳桿菌）活化：將斜面保藏的植物乳桿菌（干酪乳桿菌）在MRS肉湯培養(yǎng)基中活化，兩次繼代培養(yǎng)后，36 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h，備用。

將冷凍的藍莓（-20 ℃）在4 ℃解凍后清洗晾干，用榨汁機破碎得到藍莓果漿，在55 ℃條件下加入0.8%的果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶（2∶1∶1）酶解3 h[18]。酶解結束后向藍莓果漿中加入一定量的白砂糖，調整初始TSS含量為12°Bx。采用巴氏殺菌法殺菌（85 ℃、15 min）。將活化完成的酵母菌、植物乳桿菌及干酪乳桿菌接種發(fā)酵（采用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)保證菌種的活菌數(shù)達到109 CFU/mL，體積比為0.1%、2%、0.47%），在31 ℃發(fā)酵40 h，4 ℃條件下靜置2 h、使用紗布對其過濾，獲得藍莓酵素成品。

1.3.2 復合菌種接種量優(yōu)化均勻設計試驗

根據(jù)成福等[24-25]的方法進行3因素8水平的試驗設計。均勻設計試驗中，以SOD酶活性、pH值為響應值，以3種復合菌種（酵母菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌）的接種體積比例為影響因素。在溫度為31 ℃，初始TSS含量為12 °Bx，料液比為1∶5的條件下發(fā)酵40 h，均勻設計試驗因素與水平見表1。

表1 復合菌種接種量優(yōu)化均勻設計試驗因素及水平
Table 1 Factors and levels of uniform design tests for inoculum optimization of mixed strains

水平 X1酵母菌/% X2植物乳桿菌/% X3干酪乳桿菌/%1 2 3 4 5 6 7 8 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 0.22 0.24 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65

1.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

固定各菌種初始接種量為109 CFU/mL，參考上述工藝固定其他指標，考察發(fā)酵時間（32 h、36 h、40 h、44 h、48 h）、發(fā)酵溫度（28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃）、料液比（1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8（g∶mL））、初始TSS含量（9°Bx、10°Bx、11°Bx、12°Bx、13°Bx）4個因素對SOD酶活力的影響。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以SOD酶活（Y）為響應值，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，選擇發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始TSS含量（C）、料液比（D）4個因素為自變量，采用4因素3水平的響應面試驗，優(yōu)化藍莓酵素發(fā)酵的最佳工藝條件。發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平見表2。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平
Table 2 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization

水平 A 發(fā)酵時間/h D 料液比（g∶mL）-1 B 發(fā)酵溫度/℃C 初始TSS含量/°Bx 0 1 36 40 44 28 31 34 11 12 13 1∶4 1∶5 1∶6

1.3.5 分析檢測

pH值的測定：采用pH計；SOD酶活力的測定：采用SOD酶試劑盒；總可溶性固形物含量的測定：采用折光計法；乳酸菌活菌數(shù)的測定：參照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》?？偦ㄉ蘸康臏y定：采用pH示差法[26]。酒精度的測定：參照GB 5009.225—2023《酒中乙醇濃度的測定》；總酚含量的測定：采用福林酚法[27]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗均重復3次，結果以“平均值±標準差”表示，采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析和處理，Origin 2021進行繪圖，Design-Expert 13.0進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 復合菌種接種量優(yōu)化均勻設計試驗結果與分析

均勻設計試驗優(yōu)化復合菌種接種量的結果與分析見表3。

表3 復合菌種接種量優(yōu)化均勻設計試驗結果與分析
Table 3 Results and analysis of uniform design tests for inoculum optimization of mixed strains

試驗號X1酵母菌/%X2植物乳桿菌/%X3干酪乳桿菌/%SOD酶活力/（U·mL-1） pH值1 2 3 4 5 6 7 8 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 0.22 0.24 3.50 5.50 3.00 5.00 2.50 4.50 2.00 4.00 0.60 0.50 0.40 0.30 0.65 0.55 0.45 0.35 79.96±0.27 103.49±0.04 97.11±0.87 82.69±0.09 87.39±0.39 92.87±0.12 99.69±0.21 87.37±0.08 3.16±0.04 3.14±0.11 3.15±0.06 3.13±0.08 3.16±0.13 3.12±0.07 3.14±0.08 3.16±0.13

由表3可知，在8組試驗中，各組試驗的pH值差異不明顯，SOD酶活顯示出較大不同。故以SOD酶活（Y）為響應值，運用SPSS 24.0軟件建立二次多項式回歸方程如下：

Y=18.756-32.227X2+561.391X3-8.976X1X2+4.393X22-587.476X3X2

對回歸方程進行方差分析，決定系數(shù)R2=0.96，調整決定系數(shù)R2adj=0.92，F(xiàn)值為11.77，P值為0.01＜0.1，達到極顯著水平，證明該回歸方程可以較準確地預測最佳接種量。運用Excel 2016預測藍莓酵素的最佳接種量分別為酵母菌0.1%、植物乳桿菌2%、干酪乳桿菌0.47%，在此條件下，SOD酶活達105 U/mL。根據(jù)預測出的最佳條件進行3次平行驗證試驗，得出藍莓酵素的SOD酶活為101 U/mL。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗結果

發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、初始可溶性固形物和料液比對藍莓酵素SOD酶活力的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始總可溶性固形物含量（C）和料液比（D）對藍莓酵素SOD酶活的影響
Fig.1 Effects of fermentation time (A), temperature (B), initial total soluble solid content (C), and solid and liquid ratio (D) on SOD activity of blueberry Jiaosu

由圖1A可知，隨著發(fā)酵時間在32～40 h范圍內延長，SOD酶活逐漸增加；發(fā)酵時間為40h時，SOD酶活達到最大，為102 U/mL；發(fā)酵時間＞40 h，SOD酶活力降低。因此，確定最佳發(fā)酵時間為40 h。由圖1B可知，隨著發(fā)酵溫度在28～31 ℃的升高，SOD酶活逐漸增加；發(fā)酵溫度為31 ℃時，SOD酶活達最高值，為92 U/mL；當發(fā)酵溫度高于31 ℃時，SOD酶活力逐步下降。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為31℃。由圖1C可知，隨著初始TSS含量的升高，SOD酶活力逐漸增加；當初始TSS含量為12°Bx時，SOD酶活力達最大值，為105 U/mL；當初始TSS含量＞12°Bx時，SOD酶活力逐漸下降。因此，確定最佳初始TSS含量為12°Bx。由圖1D可知，當料液比為1∶4、1∶5（g∶mL）時，SOD酶活力逐漸增加；當料液比為1∶5（g∶mL）時，SOD酶活達最高值，為102 U/mL；當料液比為1∶5、1∶6、1∶7、1∶8（g∶mL）時，SOD酶活逐漸下降。因此，確定最佳料液比為1∶5（g∶mL）。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗結果與分析

在單因素試驗結果的基礎上，以SOD酶活（Y）為響應值，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，選擇發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始TSS含量（C）、料液比（D）4個因素為自變量進行4因素3水平的響應面試驗，優(yōu)化藍莓酵素發(fā)酵的最佳工藝條件。發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗設計及結果見表4，方差分析見表5。

表4 發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗設計與結果
Table 4 Design and results of response surface tests for fermentation conditions optimization

試驗號A 發(fā)酵時間/h B 發(fā)酵溫度/℃C 初始TSS含量/°Bx D 料液比（g∶mL）SOD酶活/（U·mL-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 36 44 40 40 36 40 40 40 36 44 44 40 40 40 44 36 36 40 40 44 44 40 40 40 40 40 31 31 31 28 34 31 31 28 28 31 34 34 28 31 28 31 31 31 34 31 31 34 31 31 31 28 11 12 11 12 12 12 12 13 12 13 12 12 12 12 12 13 12 12 13 11 12 11 11 13 13 11 1∶5 1∶4 1∶6 1∶4 1∶5 1∶5 1∶5 1∶5 1∶5 1∶5 1∶5 1∶4 1∶6 1∶5 1∶5 1∶5 1∶4 1∶5 1∶5 1∶5 1∶6 1∶5 1∶4 1∶6 1∶4 1∶5 84.87±0.94 83.67±1.89 88.34±0.71 88.40±1.66 91.56±0.80 104.36±1.76 105.08±2.16 86.64±0.96 82.64±0.90 83.88±0.93 79.16±2.14 91.32±1.15 89.30±1.58 106.96±1.62 84.16±1.08 82.28±1.42 88.20±1.62 105.16±1.62 85.36±0.74 78.94±0.68 86.52±0.59 88.04±1.50 85.40±0.89 86.84±1.63 91.52±0.77 81.60±0.68

續(xù)表

試驗號A 發(fā)酵時間/h B 發(fā)酵溫度/℃C 初始TSS含量/°Bx D 料液比（g∶mL）SOD酶活/（U·mL-1）27 28 29 36 40 40 31 31 34 12 12 12 1∶6 1∶5 1∶6 89.44±1.20 106.04±2.33 92.76±1.78

表5 回歸模型方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model

注：“**”表示對結果影響極顯著（P＜0.01）；“*”表示對結果影響顯著
（P＜0.05）。

方差來源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 顯著性模型*******14 ABCDA B AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2殘差失擬項總利差1 853.37 42.79 19.92 7.25 1.83 48.44 14.18 0.648 0 14.90 0.072 9 14.52 954.40 516.97 796.50 260.01 15.87 11.86 1 869.24 111111111111111 4 116.77 37.74 17.57 6.40 1.62 42.73 12.50 0.571 6 13.14 0.064 3 12.80 841.81 455.99 702.54 229.34＜0.000 1＜0.000 1 0.000 9 0.024 1 0.224 3＜0.000 1 0.003 3 0.462 2 0.002 8 0.803 5 0.003 0＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1****************10 28 132.38 42.79 19.92 7.25 1.83 48.44 14.18 0.648 0 14.90 0.0729 14.52 954.40 516.97 796.50 260.01 1.13 1.19 1.18 0.472 7

通過Design-Expert 13.0軟件對表4結果進行方差分析和二元多次回歸擬合，獲得SOD酶活與發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始TSS含量、料液比的二次多項式回歸方程如下：

Y=105.52-1.89A+1.29B+0.78C+0.39D-3.48AB+1.88AC+0.4AD-

1.93BC+0.14BD-1.91CD-12.13A2-8.93B2-11.08C2-6.33D2

由表5可知，該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項P值為0.472 7＞0.05，即失擬項不顯著，決定系數(shù)R2=0.991，調整決定系數(shù)R2Adj=0.983，說明此模型擬合效果良好，能夠分析預測藍莓酵素的發(fā)酵工藝參數(shù)。由P值可知，一次項A、B，交互項AB、AC、BC、CD，二次項A2、B2、C 2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01）；一次項C對結果影響顯著（P＜0.05）；其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，各因素對SOD酶活影響大小順序為A＞B＞C＞D。

響應面的等高線形狀及響應面坡度可以反映自變量之間的交互影響，響應面坡面越陡，表明因素之間的相互作用越顯著。由圖2可知，發(fā)酵時間（A）與發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（A）與初始TSS值（C）、發(fā)酵溫度（B）與初始TSS（C）、初始TSS含量（C）與料液比（D）之間存在交互作用，且這些因素的相互作用對SOD酶活力影響極顯著（P＜0.01）。

圖2 各因素間交互作用對藍莓酵素SOD酶活影響的響應曲面及等高線
Fig.2 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on SOD activity of blueberry Jiaosu

根據(jù)響應面試驗結果得到藍莓酵素的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時間41.43 h，發(fā)酵溫度31.09 ℃，初始TSS含量12.04 °Bx，料液比1∶4.99（g∶mL）。在此優(yōu)化條件下，藍莓酵素的SOD酶活力預測值可達103.29 U/mL。為方便實際操作，將最佳發(fā)酵工藝條件修正為發(fā)酵時間41.5 h，發(fā)酵溫度31 ℃，初始TSS含量12°Bx，料液比1∶5（g∶mL），在此條件下進行3次平行驗證試驗，得到SOD酶活實際值為103.01 U/mL，與預測值相差不大。

2.4 藍莓酵素的品質評價

藍莓酵素成品呈深紫紅色，色澤均勻，果香濃郁，口感酸甜適宜，無外來雜質。制備的藍莓酵素pH值為3.14，酒精度為0.2%vol，總酚含量為3.14 mg/mL，花色苷含量為26.06 mg/mL，乳酸菌活菌數(shù)為1.01×107CFU/mL，SOD酶活性為103.01 U/mL，符合行業(yè)標準QB/T 5323—2018《植物酵素》要求。

3 結論

該研究以藍莓為主要原料，以酵母菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌為發(fā)酵菌種制備藍莓酵素，確定酵母菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌三種菌株的最佳接種體積比分別為0.1%、2%、0.47%，藍莓酵素的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時間41.5 h，發(fā)酵溫度31 ℃，初始總可溶性固形物含量12°Bx，料液比1∶5（g∶mL）。在此優(yōu)化條件下，藍莓酵素的SOD酶活力可達103.01 U/mL，pH值為3.14，酒精度為0.2%vol，總酚含量為3.14 mg/mL，花色苷含量為26.06 mg/mL，乳酸菌活菌數(shù)為1.01×107CFU/mL。本研究開發(fā)出一款具有高SOD酶活力的藍莓酵素產(chǎn)品，今后可進一步研究酵素制品對人類健康的益處。

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