【摘要】：前言腦缺血是嚴(yán)重威脅人類健康的高發(fā)的疾病之一,其損傷機(jī)制有興奮性毒性,鈣超載,細(xì)胞凋亡,炎癥,自由基,一氧化氮以及線粒體的損傷。血腦屏障結(jié)構(gòu)破壞和功能的變化是腦缺血早期的重要病理過程之一,并且是腦缺血早期死亡的主要危險因素之一。因此,研究腦缺血時血腦屏障通透性的變化以及可能的保護(hù)機(jī)制對腦缺血的治療具有重要的意義。綠茶多酚(green tea polyphenols, GTPs)是綠茶中所含的一類多羥基酚類化合物的總稱,其主要成分是兒茶素類化合物,其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)的含量最高,約占兒茶素的80%,被認(rèn)為是綠茶多酚生物活性的主要來源。近年來研究發(fā)現(xiàn),綠茶多酚具有多方面的藥理作用,如抗氧化、抗焦慮、抗腫瘤、抗輻射損傷、抗炎、降低血糖和血脂作用等,其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制與金屬螯合,自由基清除,影響細(xì)胞存活和凋亡基因的過度表達(dá)以及對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,線粒體功能和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有關(guān),通過這些機(jī)制,綠茶多酚對帕金森病和阿爾茨海默氏癥等神經(jīng)變性疾病具有防治作用。但綠茶多酚對腦缺血時血腦屏障通透性的影響尚未見報道。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障的重要組成部分,內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)膜表面含有豐富的內(nèi)陷囊狀結(jié)構(gòu),即胞膜窖(caveolae)。物質(zhì)通過血腦屏障一般有兩種途徑：細(xì)胞旁途徑和跨細(xì)胞途徑。Caveolae介導(dǎo)的內(nèi)化途徑是經(jīng)典的跨細(xì)胞途徑之一,caveolin-1是caveolae的標(biāo)志性蛋白,內(nèi)皮細(xì)胞有可能是通過ERK1/2和p38MAPK途徑下調(diào)caveolin-1的表達(dá)。本研究通過給大鼠灌胃服用綠茶多酚,旨在探討綠茶多酚對腦缺血大鼠血腦屏障通透性的影響和可能的相關(guān)機(jī)制。材料和方法一、實(shí)驗(yàn)材料(一)實(shí)驗(yàn)動物本研究采用中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供的Wistar大鼠,雄性,體重250～300g。(二)主要試劑綠茶多酚(杭州禾田生物有限公司)；兔抗大鼠caveolin-1,p-ERKl/2和ERK1／2抗體(美國Santa Cruz公司)；小鼠抗大鼠β-actin抗體(武漢博士德試劑公司)；β-actin,辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二次抗體(北京中山公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗(武漢博士德試劑公司)；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑(福州邁新生物技術(shù)有限公司)；RT-PCR試劑盒(Takara公司)；伊文思藍(lán)(日本Fluka公司)。(三)主要儀器大鼠腦立體定位儀(日本光電株式會社)；激光多普勒腦血流儀(moorLAB, England); PCR儀(德國Biometra公司)；電子分析天平；恒溫水浴箱；低溫冷凍離心機(jī)(Hitachi, Japan);通用電泳儀(Bio-Rad, USA);轉(zhuǎn)印儀(北京市六一儀器廠)；-80℃深度冰箱(Toshiba, Japan);恒溫冷凍切片機(jī)(Leica, GER)。二、實(shí)驗(yàn)方法(一)動物準(zhǔn)備及分組：實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成兩組：對照組和綠茶多酚組,根據(jù)缺血時間不同,將每組大鼠進(jìn)一步分為：缺血0h組,缺血1h組,缺血2h組及缺血4h組。綠茶多酚組大鼠按400mg/kg灌服綠茶多酚蒸餾水溶液,每日2次,每次1mL；對照組給予等體積蒸餾水,自由飲食,活動。灌胃30天后,進(jìn)行局灶性腦缺血模型的制作。(二)大鼠腦缺血模型的制備。(三)大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分和腦梗死體積的測定。(四)應(yīng)用伊文思藍(lán)滲透性評估血腦屏障通透性的變化。(五)RT-PCR法檢測缺血腦組織微血管段caveolin-1的mRNA表達(dá)。(六)免疫組化法檢測缺血腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞caveolin-1的分布和表達(dá)變化。(七)Wesrern blot法檢測缺血腦組織微血管段caveolin-1, p-ERK1/2蛋白表達(dá)的變化。(八)圖象分析免疫組化結(jié)果用Motic Images Advanced 3.2實(shí)時圖象分析系統(tǒng)采集照片并進(jìn)行定量分析。Western blot結(jié)果用Chemi Imager 5500V 2.03軟件掃描,用Fluor Chen2.0軟件定量分析顯色帶的IDV值。(九)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果一、應(yīng)用激光多普勒血流儀監(jiān)測大腦中動脈供血區(qū)腦組織的血流變化各組大鼠于MCAO前記錄局部大腦中動脈供血區(qū)腦血流值,作為基礎(chǔ)值。行MCAO后,再次檢測該區(qū)腦血流,其血流值下降到基礎(chǔ)值的30%以下即可認(rèn)為MCAO缺血模型成功。血流值未下降到30%以下和手術(shù)導(dǎo)致皮層出血的大鼠舍棄。二、綠茶多酚對神經(jīng)功能、梗死體積和血腦屏障通透性的影響在缺血0h,1h和2h組未發(fā)現(xiàn)梗死區(qū)。與對照組缺血4h相比,綠茶多酚顯著降低了梗死體積(P<0.01)；與對照組缺血2h和4h組相比,綠茶多酚也顯著改善了大鼠的神經(jīng)功能缺損(P<0.05,P<0.01)。應(yīng)用伊文思藍(lán)滲透性評估血腦屏障通透性的變化,發(fā)現(xiàn)對照組和綠茶多酚組大鼠在缺血0h腦組織未見藍(lán)染,隨著缺血時間延長,缺血部位腦組織藍(lán)染有不同程度加重；而綠茶多酚組大鼠在缺血1h,2h和4h的缺血藍(lán)染程度較對照組明顯減輕。在對照組內(nèi),與缺血0h組相比,缺血1h,2h和4h組腦組織EB含量均顯著高于0h組(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。綠茶多酚缺血0h組的腦組織EB含量與對照組0h組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而綠茶多酚缺血1h,4h組的EB含量與對照組缺血1h,4h組相比下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,P<0.05),綠茶多酚缺血2h組的EB含量與對照缺血2h組相比則顯著下降(P<0.01)。三、綠茶多酚對缺血區(qū)腦組織微血管段caveol in-1的mRNA表達(dá)的影響在對照組中,與缺血0h組相比,缺血1h,2h和4h組caveolin-1的mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01,P<0.01,P<0.01),缺血4h組與其它對照組相比,均有顯著差異(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。綠茶多酚缺血0h組與對照缺血0h組相比,caveolin-1的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異(P>0.05),綠茶多酚缺血1h、2h、4h組與對照缺血同時點(diǎn)組相比,caveolin-1的mRNA表達(dá)均顯著下降(P<0.01,P<0.01,P<0.05)。四、綠茶多酚對缺血區(qū)腦組織微血管段內(nèi)皮細(xì)胞caveolin-1蛋白表達(dá)的影響Caveolin-1蛋白在各組大鼠腦組織中均沿血管呈陽性表達(dá)；免疫組化結(jié)果顯示缺血組隨著缺血時間延長caveolin-1的表達(dá)量增加,與對照缺血0h組相比,缺血1h,2h和4h組caveolin-1的表達(dá)水平顯著增加(P<0.01,P<0.01,P<0.01)；綠茶多酚缺血0h組與對照缺血0h相比,caveolin-1的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05),但缺血1h,2h和4h組與對照缺血1h,2h和4h組相比則顯著下降(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。五、綠茶多酚對缺血區(qū)腦組織微血管段caveolin-1蛋白表達(dá)水平的影響Western blot結(jié)果顯示caveolin-1蛋白的表達(dá)變化趨勢與免疫組化結(jié)果一致,即缺血組隨著缺血時間延長,caveolin-1蛋白表達(dá)量增加,在對照組內(nèi)：與缺血0h相比,缺血1h,2h,4h組的caveolin-1的蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。綠茶多酚缺血0h組與對照缺血0h相比,caveolin-1的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05),但缺血1h,2h和4h組與對照缺血1h,2h和4h組相比顯著下降(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。六、綠茶多酚對缺血區(qū)腦組織微血管段p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平的影響Western blot結(jié)果顯示p-ERK1/2蛋白的表達(dá)變化趨勢與caveolin-1表達(dá)結(jié)果一致,在缺血組中隨著缺血時間延長,p-ERK1/2蛋白表達(dá)量增加。在對照組中,與缺血0h相比,缺血1h,2h,4h組的ERK1/2的蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。綠茶多酚缺血Oh組與對照組缺血0h相比,p-ERK1/2的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05),缺血1h,2h和4h組與對照組缺血1h,2h和4h相比均顯著下降(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。討論在本研究中,預(yù)先對大鼠進(jìn)行灌胃服用綠茶多酚溶液,然后建立局灶性腦缺血模型,觀察綠茶多酚對大鼠腦缺血后血腦屏障通透性變化的影響。發(fā)現(xiàn)與對照組缺血0h相比,缺血1h,2h和4h組缺血區(qū)腦組織EB含量顯著增加；綠茶多酚的缺血1h,2h,4h組的EB含量與對照組缺血同時點(diǎn)組相比顯著下降,綠茶多酚顯著下調(diào)缺血腦組織微血管段的caveolin-1 mRNA,蛋白水平和p-ERK1/2蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果提示,綠茶多酚對腦缺血時血腦屏障的通透性具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞的caveolin-1 mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)相關(guān),p-ERK1/2表達(dá)下調(diào)可能與caveolin-1的變化相關(guān)。腦缺血導(dǎo)致血腦屏障開放,已有研究證明綠茶多酚能預(yù)防中風(fēng),可以作為腦缺血后的神經(jīng)保護(hù)因子。目前關(guān)于綠茶多酚的研究主要是對神經(jīng)元的保護(hù)作用。綠茶多酚口服吸收后分布廣泛,也可通過血腦屏障進(jìn)入腦組織,減少腦缺血導(dǎo)致的梗死體積和神經(jīng)元損傷。在動物實(shí)驗(yàn)中,EGCG具有顯著的抗氧化功能,可以預(yù)防局部腦缺血造成的神經(jīng)損傷和梗塞,腦缺血再灌注后腦梗死體積明顯降低,依然能顯示抗氧化和預(yù)防神經(jīng)損傷的功能。在本研究中與對照組相比,綠茶多酚組顯著降低了缺血組增高的血腦屏障通透性,首次證實(shí)綠茶多酚對缺血時血腦屏障的通透性具有保護(hù)作用。Caveolin是caveolae的主要結(jié)構(gòu)成分,在內(nèi)皮細(xì)胞的功能有：跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)作用,入胞作用,調(diào)節(jié)內(nèi)皮組織通透性,致動脈粥樣硬化,并參與G-蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),酪氨酸激酶的級聯(lián)反應(yīng),蛋白激酶C和eNOS的信號通路等,在血腦屏障中具有重要作用,但其作用機(jī)制還不清楚。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)包括ERKl和ERK2,統(tǒng)稱為ERK1／2,磷酸化激活后,可將信號從表面受體傳至核內(nèi),作用于多種轉(zhuǎn)錄因子,在神經(jīng)系統(tǒng)中ERK1／2調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化,可塑性及神經(jīng)元存活,介導(dǎo)了胞外因子的神經(jīng)保護(hù)作用。在本研究中,腦缺血后微血管內(nèi)皮細(xì)胞ERK1／2磷酸化水平表達(dá)增加,而綠茶多酚則使ERK1／2活性顯著降低。我們推測綠茶多酚有可能通過調(diào)節(jié)NOS活性,進(jìn)而改變內(nèi)皮細(xì)胞caveolin-1的表達(dá)水平,ERK1／2可能是其發(fā)揮作用的重要物質(zhì)之一。結(jié)論1、綠茶多酚組顯著降低了腦缺血時增高的血腦屏障通透性。2、綠茶多酚顯著降低了腦缺血時增加的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞caveolin-1的mRNA和蛋白表達(dá),這可能是綠茶多酚對缺血時血腦屏障通透性起到保護(hù)作用的機(jī)制之一。3、綠茶多酚顯著降低了腦缺血時增加的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)。

【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010

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