編譯：微科盟蔚藍(lán)，編輯：微科盟居居、江舜堯。

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導(dǎo)讀

人體微生物組由棲息在人體不同解剖位置的動(dòng)態(tài)微生物群落組成。微生物組與宿主的共同進(jìn)化導(dǎo)致這些群落在促進(jìn)人類健康方面發(fā)揮著深遠(yuǎn)的作用。因此，人體微生物組的紊亂會(huì)導(dǎo)致或加劇多種疾病。本篇綜述介紹了目前對(duì)人類健康與疾病發(fā)展之間關(guān)系的理解，重點(diǎn)關(guān)注消化、呼吸、泌尿、生殖系統(tǒng)以及皮膚中發(fā)現(xiàn)的微生物組。本文還進(jìn)一步討論了可以調(diào)節(jié)人體微生物組的組成和功能進(jìn)而對(duì)宿主發(fā)揮治療作用的多種策略。最后，還研究了多組學(xué)方法和微生物細(xì)胞重編程等技術(shù)，這些技術(shù)可以使微生物組研究和工程取得重大進(jìn)展。  

圖文摘要      

論文ID

原名：Microbiome and Human Health: Current Understanding, Engineering, and Enabling Technologies

譯名：微生物組與人類健康：當(dāng)前的理解、工程和支持技術(shù)

期刊：Chemical Reviews

IF：62.1

發(fā)表時(shí)間：2022.11

通訊作者：Matthew Wook Chang

通訊作者單位：新加坡國(guó)立大學(xué)

DOI號(hào)：10.1021/acs.chemrev.2c00431

綜述目錄

1 前言

2 人體微生物組

2.1 影響人體微生物組的因素

2.2 人體不同部位的微生物群及其與健康/疾病的關(guān)系

3 設(shè)計(jì)用于治療應(yīng)用的微生物組的策略

3.1 改變微生物組的種群動(dòng)態(tài)

3.2 改變微生物組的功能

3.3 天然和合成的微生物菌群

3.4 微生物組工程當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)和局限性

4 微生物組研究和工程的支持技術(shù)

4.1 功能組學(xué)方法

4.2 合成生物學(xué)和微生物的細(xì)胞重編程

4.3 底盤工程

5 挑戰(zhàn)和限制

主要內(nèi)容

3.3 天然和合成的微生物菌群

微生物群落，如人類微生物群落，執(zhí)行由群落內(nèi)部和與環(huán)境的動(dòng)態(tài)相互作用形成的復(fù)雜功能。這種復(fù)雜的功能不太可能由單一種群實(shí)現(xiàn)，這引起了對(duì)微生物群落的高度興趣。此外，群落內(nèi)微生物多樣性的增加也可能賦予其應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的能力，例如營(yíng)養(yǎng)限制。目前，兩種類型的微生物群落被應(yīng)用于治療：一種是天然存在的菌群，成分不確定，如腸道微生物群，可用作糞便微生物群移植(FMT)；合成菌群，包括預(yù)先確定的益生菌或共生微生物的混合物。在此，我們將討論將這些微生物菌群用于治療各種疾病的一些例子以及這些方法面臨的挑戰(zhàn)。

3.3.1 糞便微生物群移植

FMT包括給藥干燥的糞便，來自患者自身或健康供體(圖4)。給藥途徑可能有所不同，包括口服凍干膠囊、經(jīng)小腸/大腸輸注以及灌腸。其目的是將原生疾病相關(guān)的微生物組重建使其更健康，以提供積極的健康影響。FMT在復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染中顯示出巨大潛力，其治愈率為85-90%，被強(qiáng)烈推薦用于輕度、重度病例。在一項(xiàng)隨機(jī)臨床試驗(yàn)中，經(jīng)初始萬(wàn)古霉素治療后，艱難梭菌感染患者的FMT療效高于持續(xù)使用萬(wàn)古霉素的治療療效，同時(shí)伴有擬桿菌門和梭菌的增加以及變形菌門的減少。在給予廣譜抗生素的小鼠和人類中，自體FMT能夠在幾天內(nèi)快速完全恢復(fù)失調(diào)的微生物組，是最有效的干預(yù)措施。令人驚訝的是，與自然恢復(fù)相比，益生菌混合物的給藥顯著延遲了微生物組的恢復(fù)且其恢復(fù)并不完全。這歸因于益生菌產(chǎn)生的可溶性因子對(duì)原生微生物組的抑制作用。除艱難梭菌感染外，F(xiàn)MT還被用于治療潰瘍性結(jié)腸炎、2型糖尿病、腸易激綜合征和癌癥；然而，迄今為止只報(bào)告了有限的案例研究和臨床試驗(yàn)。需要進(jìn)一步精心設(shè)計(jì)的臨床試驗(yàn)來證實(shí)FMT對(duì)艱難梭菌感染以外適應(yīng)癥的療效。 在FMT廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐之前，有部分方面必須考慮和研究。選擇合適的供體是FMT成功的關(guān)鍵因素之一。盡管自體FMT相容性較好，但可能并不總是可行，因此需要糞便供體。FMT前需要仔細(xì)篩查供體腸道微生物組的潛在致病物種以確保操作的安全性。因?yàn)樵趩蝹€(gè)糞便樣本中檢測(cè)到SARS-CoV-2病毒，這在COVID-19大流行時(shí)期尤其重要。此外，已經(jīng)進(jìn)行了研究以確定糞便樣本最有可能成功植入腸道微生物組的供體。高分類多樣性和供體糞便中特定細(xì)菌科的存在被認(rèn)為是受體腸道穩(wěn)態(tài)的疾病特異性恢復(fù)的關(guān)鍵。除了供體選擇之外，受體的遺傳、飲食和生活方式也可能在FMT維持中發(fā)揮作用。

Seres Therapeutics開發(fā)了SER-109作為FMT的替代方案，這是一種來自健康供體細(xì)菌孢子的天然聯(lián)合體，用于治療復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染。這種孢子主要來自厚壁菌門細(xì)菌，因?yàn)槠渌?xì)菌門不產(chǎn)生孢子。這是有利的，因?yàn)榧韧芯勘砻骱癖诰T與相對(duì)較高濃度的次級(jí)膽汁酸有關(guān)，后者可抑制艱難梭菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。此外，這些膽汁酸還可以防止艱難梭菌孢子萌發(fā)(復(fù)發(fā)性感染的主要原因)。由于孢子對(duì)胃酸具有抗性，因此純化孢子聯(lián)合體可以口服給藥，從而降低FMT中病原體傳播的風(fēng)險(xiǎn)。在一項(xiàng)包含182名患者的隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照3期臨床試驗(yàn)中，與抗生素治療后接受安慰劑的患者相比，標(biāo)準(zhǔn)抗生素治療后口服SER-109的患者組艱難梭菌感染的復(fù)發(fā)率降低(12% vs 40%)。接受SER-109的患者在1周內(nèi)植入了給藥菌種，并在研究期間持續(xù)存在(8周)，厚壁菌門的豐度增加，促炎腸桿菌科減少。給予SER-109的患者糞便樣本中也觀察到了較高濃度的次級(jí)膽汁酸。

圖4. 通過糞便微生物群移植(FMT)和合成菌群來改造微生物組。

3.3.2合成微生物菌群

由于天然存在的微生物群落結(jié)構(gòu)尚不明確，難以量化單個(gè)成員對(duì)特定功能的貢獻(xiàn)，所以并不適合進(jìn)一步優(yōu)化。合成菌群可以滿足這種未實(shí)現(xiàn)的需求，因?yàn)樗山?jīng)合理設(shè)計(jì)并降低微生物復(fù)雜性以執(zhí)行可預(yù)測(cè)地為宿主帶來治療益處的功能。例如，Tanoue等人從健康人類供體的糞便中分離出一個(gè)由11種菌株組成的菌群，可以穩(wěn)定地誘導(dǎo)腸道中產(chǎn)生干擾素γ的CD8+ T細(xì)胞。這11株菌株是低豐度微生物組成員，包括Bacteroides、Parabacteroides的某些物種以及Eubacterium limosum、Ruminococcaceae bacterium cv2、Phascolarctobacterium faecium和Fusobacterium ulcerans。在小鼠體內(nèi)定植后，微生物群提供了對(duì)Listeria monocytogenes感染的抵抗力，并增強(qiáng)了腫瘤模型中免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效。 GUT-108是一個(gè)由11種菌株組成的設(shè)計(jì)合理的菌群，在小鼠模型中也被證明可以逆轉(zhuǎn)結(jié)腸炎。該菌群包括可執(zhí)行IBD患者腸道微生物組中減少的功能的菌株。這些功能包括生產(chǎn)SCFA(如丁酸鹽和丙酸鹽)、次級(jí)膽汁酸、脫氧膽酸、石膽酸、吲哚及其衍生物。 此外，GUT-108中的一些菌株產(chǎn)生抗菌因子，阻止可能會(huì)進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)的條件致病菌的生長(zhǎng)。在接受磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的小鼠中觀察到，實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠模型給予GUT-108可阻止腸桿菌科致病菌的擴(kuò)增。在小鼠中觀察到GUT-108的10種菌株的成功植入導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子減少、誘導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生，并增加促進(jìn)粘膜愈合和免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)的代謝物水平。 除了由野生型菌株組成的合成菌群外，具有明確特征的工程細(xì)菌也可用于開發(fā)合成菌群。例如，Kong等人創(chuàng)造了6個(gè)具有從共生到捕食的獨(dú)特相互作用的雙菌株群落。他們利用這些菌株進(jìn)一步開發(fā)了具有可預(yù)測(cè)行為的三株和四株成員群落，證明了細(xì)菌群落中相互作用的成功工程。這種方法可以設(shè)計(jì)出具有更復(fù)雜行為的合成菌群從而使宿主獲益。 與單一微生物種群相比，微生物菌群的設(shè)計(jì)面臨著獨(dú)特的挑戰(zhàn)。與天然微生物組類似，合成群落應(yīng)能夠維持體內(nèi)平衡并防止某些成員在不同的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中超過其他成員。但這很難實(shí)現(xiàn)，因?yàn)槲⑸锿ǔ１憩F(xiàn)出不同的代謝各種資源的能力，這使得長(zhǎng)期預(yù)測(cè)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)不可行。應(yīng)用合成生物學(xué)將遺傳回路納入微生物中可能會(huì)緩解菌群成員之間的競(jìng)爭(zhēng)。另一個(gè)挑戰(zhàn)是預(yù)測(cè)微生物群落的行為，這可以歸因于缺乏對(duì)微生物之間代謝相互作用的組學(xué)水平的理解。通過多組學(xué)研究與計(jì)算機(jī)建模相結(jié)合獲得的知識(shí)最終將提升設(shè)計(jì)具有可預(yù)測(cè)和可控功能的合成菌群的能力。

3.4微生物組工程當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)和局限性

前面給出的示例(總結(jié)在表2中)表明，在宿主體內(nèi)設(shè)計(jì)微生物組以實(shí)現(xiàn)各種治療結(jié)果是可行的。迄今為止，對(duì)調(diào)節(jié)微生物組組成和功能的不同方法的體外和體內(nèi)評(píng)估已經(jīng)顯示出有希望的結(jié)果。除FMT外，大多數(shù)治療方法仍在等待成功的臨床轉(zhuǎn)化。前文已經(jīng)提到過開發(fā)基于合理設(shè)計(jì)微生物組的不同治療方法存在獨(dú)特的挑戰(zhàn)。然而，為了進(jìn)一步加速微生物組工程以開發(fā)安全有效的治療產(chǎn)物，需要彌補(bǔ)微生物-微生物和微生物-宿主相互作用相關(guān)知識(shí)的差距，并構(gòu)建新的工具來擴(kuò)大微生物組工程的范圍，如下文所述。

表2. 設(shè)計(jì)針對(duì)不同疾病的微生物組的方法總結(jié)。

3.4.1多組學(xué)研究應(yīng)用不充分

作為人類微生物組計(jì)劃(HMP)的一部分，使用16S rRNA基因測(cè)序?qū)θ梭w中的不同微生物群落進(jìn)行全面表征以破譯微生物組的分類復(fù)雜性。同時(shí)，宏基因組全基因組鳥槍法測(cè)序提供了對(duì)微生物組及其功能的深入了解。然而，這些數(shù)據(jù)集并未闡明微生物群落內(nèi)的相互作用、微生物組如何與宿主相互作用以及宿主對(duì)其常駐微生物組的反應(yīng)。深入了解這些相互作用對(duì)于確定微生物組在疾病發(fā)展中所起的因果作用是必要的，最終將利用微生物組工程產(chǎn)生新的療法。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，健康和患病隊(duì)列必須接受各種多組學(xué)分析(包括微生物組和宿主)。HMP第二階段正進(jìn)行早產(chǎn)、IBD和2型糖尿病的研究。對(duì)于IBD，收集IBD患者和健康對(duì)照者的糞便樣本用于多組學(xué)分析，如16S rRNA基因測(cè)序、宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)。此外，對(duì)結(jié)腸活檢樣本進(jìn)行RNA-seq以研究宿主基因組的DNA甲基化，并探索具有不同代謝物的宿主細(xì)胞來確定宿主的相應(yīng)變化。重要的是，該研究還將納入微生物組中發(fā)現(xiàn)的酵母菌和病毒的調(diào)查。

3.4.2工程微生物組的時(shí)空控制

為了使工程微生物組安全地給宿主提供健康益處，它應(yīng)該有可預(yù)測(cè)的時(shí)空行為。環(huán)境擾動(dòng)和空間組織是影響微生物組復(fù)雜和動(dòng)態(tài)相互作用的主要變量。例如，Sheth等人研究了小鼠腸道微生物的生物地理學(xué)，并顯示了個(gè)體分類群之間的正、負(fù)關(guān)聯(lián)。此外，作者表明低脂肪或高脂肪飲食小鼠出現(xiàn)物種豐富度的改變以及結(jié)腸微生物組空間組織的改變。因此，工程微生物組應(yīng)能適應(yīng)任何擾動(dòng)，并能夠在不同的時(shí)間尺度上適應(yīng)其群落結(jié)構(gòu)，以繼續(xù)為宿主提供預(yù)期的治療效果。這對(duì)于有相關(guān)適應(yīng)成本的工程微生物組尤其重要，這可能通過隨機(jī)突變和水平基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)致進(jìn)化適應(yīng)。在共生微生物脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)中也觀察到了類似的適應(yīng)，并導(dǎo)致其在人體腸道中長(zhǎng)期流行。此外，保護(hù)宿主免受意外微生物群功能影響的機(jī)制應(yīng)該作為一種安全功能內(nèi)置。 合成生物學(xué)是實(shí)現(xiàn)這種水平的微生物組組成和功能動(dòng)態(tài)控制的潛在方法?？梢詫⑦z傳功能(如生物傳感器)整合到微生物組中，這樣就可以通過外部刺激來控制。此外，可以設(shè)計(jì)遺傳回路進(jìn)行微生物組的自主反饋控制。

3.4.3遺傳難治性微生物

大多數(shù)與人類健康最相關(guān)的微生物組成員仍然難以培養(yǎng)，且難以在遺傳上處理，如Clostridium和其他厭氧厚壁菌門細(xì)菌。這阻礙了我們研究這些微生物調(diào)控人類健康的機(jī)制。闡明這些機(jī)制不僅將加深我們對(duì)宿主-微生物組和微生物組內(nèi)相互作用的理解，而且還有助于更有效的基于微生物組的療法，包括促進(jìn)健康的細(xì)菌。因此，急需開發(fā)可用于這些遺傳難治性微生物的新型基因工程工具。這些工具范圍從特征明確的啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、終止子和報(bào)告基因到更復(fù)雜的基因組操作系統(tǒng)，如 CRISPR-Cas和同源重組。 在下一節(jié)中，我們將討論如何借助支持技術(shù)克服這些挑戰(zhàn)，促進(jìn)我們對(duì)微生物組-宿主相互作用的理解以及基于微生物組的有效療法的開發(fā)。

4微生物組研究和工程的支持技術(shù)

包括第3節(jié)中提及的例子在內(nèi)的許多研究都支持工程微生物治療微生物組相關(guān)疾病的可行性。雖然已進(jìn)行了許多概念驗(yàn)證研究，但一些使用工程微生物的臨床試驗(yàn)未顯示出療效或由于療效缺乏而在2期試驗(yàn)中終止(如NCT03447730、NCT03234465和NCT03447730)。這些工程微生物療效缺乏的一個(gè)促成因素可能是缺乏調(diào)控機(jī)制。通常這些機(jī)制控制微生物組中穩(wěn)定啟動(dòng)子下外源基因的表達(dá)，以增強(qiáng)療效或減少副作用。與傳統(tǒng)化學(xué)藥物相比，利用微生物作為治療劑的優(yōu)點(diǎn)之一是其具有很高的可編程性。合成生物學(xué)方法有望提高效率并減少副作用，利用對(duì)工程微生物實(shí)施精確的空間/時(shí)間控制所賦予的高可編程性。 為了充分利用工程益生菌進(jìn)行治療，必須牢記基于對(duì)微生物組相關(guān)疾病和微生物組本身的機(jī)制見解的更復(fù)雜知識(shí)的工程方法和設(shè)計(jì)。如第3.1.1所述，在不改變腸道微生物組組成的情況下，對(duì)超重/肥胖個(gè)體施用巴氏殺菌的A. muciniphila可改善胰島素敏感性，降低膽固醇和體重。除了強(qiáng)調(diào)監(jiān)測(cè)微生物組活性的重要性外，這一結(jié)果表明微生物組的功能或活性變化可能比微生物組組成更為重要。因此，代謝組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)和多元組學(xué)等功能元組學(xué)在分子、基因和通路水平上研究微生物組相關(guān)疾病的因果關(guān)系正受到關(guān)注。 本節(jié)將回顧各種元組學(xué)方法以了解微生物群落和宿主相互作用中的分子見解。還將介紹許多可以促進(jìn)微生物重編程的合成生物學(xué)工具，以開發(fā)與其他微生物組工程策略相比具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的強(qiáng)大療法。

4.1功能組學(xué)方法

宏基因組學(xué)是研究微生物群動(dòng)態(tài)的有力工具，揭示了微生物群組成與許多疾病之間的關(guān)聯(lián)。然而宏基因組數(shù)據(jù)對(duì)微生物組相關(guān)的健康狀態(tài)提供的機(jī)制見解有限。為了解決這一差距，將代謝組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏蛋白質(zhì)組學(xué)等功能元組學(xué)方法應(yīng)用于微生物群有望提供進(jìn)一步的見解。本節(jié)將回顧將功能組學(xué)應(yīng)用于微生物群以研究關(guān)鍵代謝物、微生物組活性和宿主/疾病的相互作用的最新進(jìn)展。此外，還回顧了微生物組和宿主遺傳學(xué)的相互作用。

4.1.1新型代謝物的發(fā)現(xiàn)和生物合成

微生物群衍生的代謝物在宿主-微生物相互作用中起著比共生微生物本身更關(guān)鍵的作用。然而，宿主-微生物相互作用背后的代謝物和生物合成途徑尚不清楚。一些研究表明，微生物通過代謝物調(diào)節(jié)信號(hào)通路與宿主相互作用。例如乙酸鹽、丁酸鹽和丙酸鹽等SCFAs在結(jié)腸中由膳食纖維發(fā)酵而來。已知SCFAs通過激活G蛋白偶聯(lián)受體調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)的分化和聚集，被激活的Treg細(xì)胞產(chǎn)生可以抑制IBD等腸道炎癥疾病的抗炎因子IL-10。由于代謝途徑的功能冗余，微生物組組成與代謝物之間的聯(lián)系是間接的，這表明某些物種具有互換性。因此，分析微生物組成的差異可能無法反映功能代謝物的差異。事實(shí)上，從代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育預(yù)測(cè)未成功，這表明將微生物組和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)聯(lián)系起來存在困難。因此，識(shí)別與疾病相關(guān)的代謝物可以為實(shí)施用于治療目的的合成方法提供更直接的數(shù)據(jù)。 利用質(zhì)譜的非靶向代謝組學(xué)已被用于發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的關(guān)鍵代謝物。Koh等人進(jìn)行了2型糖尿病的非靶向代謝組分析，發(fā)現(xiàn)咪唑丙酸在2型糖尿病患者中濃度較高。腸道微生物從組氨酸中產(chǎn)生咪唑丙酸，并通過mTORC1損害胰島素信號(hào)傳導(dǎo)。此前，研究人員確定了體外產(chǎn)生咪唑丙酸的UrdA基因，發(fā)現(xiàn)UrdA基因在2型糖尿病患者中更為豐富。另一個(gè)例子是苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)，非靶向代謝組分析將其鑒定為2型糖尿病患者患心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)較高相關(guān)的生物標(biāo)志物。在腸道中，PAGln通過微生物porA基因由膳食苯丙氨酸轉(zhuǎn)化而來，研究表明它通過刺激G蛋白偶聯(lián)受體來增強(qiáng)血小板活化相關(guān)表型。 非靶向質(zhì)譜法是將目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)的光譜模式與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行比較來識(shí)別分子，因此代謝物鑒定完全依賴于分析中使用的參考物。這意味著非靶向鑒定無法識(shí)別未知化學(xué)物質(zhì)。事實(shí)上，據(jù)估計(jì)，微生物組中>90%的代謝物在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中均不能匹配。這種未表征的代謝物被稱為“暗物質(zhì)”。為了解決這一問題，基于機(jī)器學(xué)習(xí)的數(shù)據(jù)庫(kù)生成日益重要。機(jī)器學(xué)習(xí)是一種自動(dòng)構(gòu)建用于分類或預(yù)測(cè)的數(shù)學(xué)模型的方法，機(jī)器學(xué)習(xí)中算法從訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中學(xué)習(xí)模式。機(jī)器學(xué)習(xí)已被廣泛用于各種應(yīng)用程序，證明了其多功能性。目前，機(jī)器學(xué)習(xí)被用于數(shù)據(jù)預(yù)處理(峰值檢測(cè)、比對(duì)和鑒定)、數(shù)據(jù)處理(結(jié)構(gòu)鑒定和化合物定量)和生物學(xué)解釋過程中識(shí)別微生物組代謝物。例如，DarkChem使用深度學(xué)習(xí)方法生成MS/MS文庫(kù)，用于預(yù)測(cè)代謝組學(xué)和化學(xué)鑒定中的化學(xué)性質(zhì)。

4.1.2宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏蛋白質(zhì)組學(xué)

宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)中使用RNA測(cè)序分析微生物群的轉(zhuǎn)錄活性。與宏基因組學(xué)不同，宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)允許鑒定微生物群落中的活性微生物、基因和通路。此后，宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)已被應(yīng)用于許多不同類型的微生物群，包括來自海水、土壤和人類的微生物群。同樣，人類微生物群的宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法也使人們能夠更深入地了解宿主-微生物群相互作用、活性微生物及其通路以及疾病進(jìn)展中的表達(dá)變化。Nowicki等人展示了如何將宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)應(yīng)用于牙齦炎患者的齦下菌斑，該研究發(fā)現(xiàn)隨著牙齦炎的進(jìn)展，微生物群組成發(fā)生了顯著變化，毒力基因表達(dá)增加，證明轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析對(duì)于了解疾病進(jìn)展過程中的分子機(jī)制的重要性。而Schirmer等人對(duì)IBD縱向隊(duì)列進(jìn)行了宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，以闡明健康個(gè)體和IBD患者之間的基因表達(dá)及其差異。在這項(xiàng)研究中，他們發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄活性中的物種特異性偏差。一個(gè)例子是甲基赤蘚糖醇磷酸途徑(MEP)基因，他們證明在重度IBD中Bacteroides vulgatus是MEP的主要轉(zhuǎn)錄貢獻(xiàn)者。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析是監(jiān)測(cè)微生物組活動(dòng)并進(jìn)一步了解微生物組在疾病中的作用的有力工具。 雖然RNA表達(dá)可以很好地反映基因表達(dá)，但它并不總是反映蛋白質(zhì)的豐度。宏蛋白質(zhì)組學(xué)可以作為監(jiān)測(cè)微生物群中基因活性的一種替代方法。在2009年的一項(xiàng)研究中，宏蛋白質(zhì)組學(xué)最初被應(yīng)用于研究環(huán)境中以及雙胞胎腸道微生物組樣本的微生物功能。到目前為止，多項(xiàng)研究已經(jīng)證明了如何將宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析用于人類微生物組樣本。雖然宏蛋白質(zhì)組學(xué)不如宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)那樣普遍，因?yàn)榕c基于深度測(cè)序的分析相比，宏蛋白質(zhì)組學(xué)的通量較低，但宏蛋白質(zhì)組學(xué)可以提供有關(guān)蛋白質(zhì)翻譯后修飾以及宿主細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)表達(dá)的信息，而這兩者都不能通過宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 Zhang等人的另一項(xiàng)研究分析了克羅恩病患者和陰性對(duì)照受試者腸道微生物組中蛋白質(zhì)的賴氨酸乙酰化(Kac)變化。這項(xiàng)研究采用了肽免疫親和富集策略，然后用質(zhì)譜法來表征Kac肽及其在人類腸道微生物組中的變化。使用該方法，他們鑒定了52種宿主蛋白Kac位點(diǎn)和136種微生物蛋白Kac位點(diǎn)，這些蛋白在克羅恩病患者和非患者之間發(fā)生了不同的修飾。同樣，Lobel等人研究了飲食對(duì)慢性腎臟疾病(CKD)模型小鼠腸道微生物組中蛋白質(zhì)翻譯后修飾的影響，發(fā)現(xiàn)含有高硫氨基酸的飲食會(huì)誘導(dǎo)微生物色氨酸酶的翻譯后修飾。蛋白質(zhì)修飾減少了CKD模型小鼠中尿毒癥毒素的產(chǎn)生。這些研究表明，翻譯后修飾可以改變微生物組功能，而不會(huì)改變其組成，這表明了宏蛋白質(zhì)組學(xué)在研究微生物組相關(guān)表型的機(jī)制見解方面的重要性。 鑒于元組學(xué)方法相關(guān)的優(yōu)缺點(diǎn)，多元組學(xué)方法已被用于全面了解微生物群基因活性以及微生物群內(nèi)或微生物群與宿主之間的相互作用。一個(gè)人類微生物組研究團(tuán)隊(duì)對(duì)IBD縱向隊(duì)列進(jìn)行了多組學(xué)分析，以闡明宿主的分子譜和微生物組活性。該研究對(duì)來自132名受試者的1年的糞便和血清樣本進(jìn)行了宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析。這項(xiàng)研究提供了宿主和微生物活性的全面描述，有助于識(shí)別導(dǎo)致失調(diào)的微生物、生化和宿主因素。Mills等人聯(lián)合宏基因組學(xué)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)方法研究250份潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者的糞便樣本，發(fā)現(xiàn)來自B. vulgatus的蛋白酶活性與UC嚴(yán)重程度有關(guān)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還表明，用蛋白酶抑制劑治療可以緩解UC癥狀，突出了多組學(xué)方法在從復(fù)雜的微生物組中鑒定致病基因方面的潛力。

4.1.3微生物組全基因組關(guān)聯(lián)研究

傳統(tǒng)上認(rèn)為微生物組組成的個(gè)體間變異主要受環(huán)境因素(而不是宿主遺傳因素)的影響。然而雙胞胎和家族的研究表明微生物組與宿主遺傳之間存在相互作用。在一項(xiàng)英國(guó)雙胞胎研究中，同卵雙胞胎中腸道微生物群的相對(duì)豐度比異卵雙胞胎更密切相關(guān)，這表明微生物組和宿主遺傳學(xué)之間的相互作用影響了腸道微生物群組成。深入了解宿主遺傳學(xué)和微生物組相互作用可輔助精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)療法并提高工程微生物療法的療效。 與微生物組變異相關(guān)的大部分已鑒定遺傳位點(diǎn)與宿主的飲食偏好或其免疫力有關(guān)。LCT位點(diǎn)是復(fù)制最多的基因組位點(diǎn)之一。對(duì)英國(guó)、荷蘭、加拿大和芬蘭人群的研究表明，LCT位點(diǎn)與Actinobacteria或Bifidobacterium之間存在關(guān)聯(lián)。LCT編碼在腸道中消化乳酸的乳糖酶。LCT位點(diǎn)與Bifidobacterium最密切相關(guān)的是功能SNP rs4988235。已知該SNP與乳糖不耐受和乳糖酶表達(dá)密切相關(guān)。因此，乳糖不耐受是乳糖酶表達(dá)過低而導(dǎo)致乳糖無法消化。Bifidobacterium具有消化乳糖的能力，表明它們代償了宿主中降低的乳糖酶活性。微生物組組成中另一個(gè)復(fù)制良好的位點(diǎn)是ABO。德國(guó)、芬蘭和荷蘭人群中進(jìn)行的研究中報(bào)告了微生物組與ABO位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)。但與ABO位點(diǎn)相關(guān)的細(xì)菌在三個(gè)國(guó)家之間有所不同。除ABO位點(diǎn)外，F(xiàn)UT2也與微生物組有關(guān)，F(xiàn)UT2基因決定了粘膜細(xì)胞上的ABO抗原。ABO和FUT2之間的功能關(guān)聯(lián)表明ABO位點(diǎn)是微生物組組成的一個(gè)促成因素。然而微生物組改變背后的機(jī)制尚未闡明。盡管許多基因組位點(diǎn)與微生物群組成有關(guān)，但在其他研究中大多數(shù)基因位點(diǎn)并未被復(fù)制。 最后，宿主遺傳變異會(huì)影響宿主的健康狀態(tài)。一個(gè)眾所周知的例子是ATG16L1位點(diǎn)。ATG16L1編碼自噬相關(guān)ATG12-ATG5/ATG16L1復(fù)合物的一個(gè)亞基，并參與自噬體的形成。但它的功能并不局限于自噬，它還參與炎癥等免疫反應(yīng)。一些全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWASs)顯示了IBD與ATG16L1位點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)。Chu等人揭示了ATG16L1對(duì)B. fragilis的免疫調(diào)節(jié)至關(guān)重要，已知B. fragilis分泌外膜囊泡(OMV)，包括誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)分子。該研究表明，ATG16L1(A300)的風(fēng)險(xiǎn)等位基因沒有表現(xiàn)出OMV介導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞誘導(dǎo)粘膜炎癥抑制的作用，也表現(xiàn)出ATG16L1的缺陷。這些結(jié)果表明宿主變異-微生物群的相互作用以及考慮宿主遺傳因素對(duì)于治療的重要性。

4.2微生物的合成生物學(xué)和細(xì)胞重編程

合成生物學(xué)旨在設(shè)計(jì)和制造具有可預(yù)測(cè)和一致所需功能的生物體。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，合成生物學(xué)引入了生物工程原理，如模塊化、邏輯門和電路設(shè)計(jì)。這些工作使研究人員能夠選擇最佳遺傳部分(例如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、終止子、肽標(biāo)簽和生物傳感器)，構(gòu)建所有類型的邏輯門(AND、OR、NOR、NOT、XOR和NAND)以及類似于振蕩器等機(jī)器和基因撥動(dòng)開關(guān)的可以控制微生物的合成設(shè)備。反過來，這些特性良好且可調(diào)的部件允許通過稱為設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)循環(huán)(DBTL循環(huán))的優(yōu)化周期組裝功能更強(qiáng)大的系統(tǒng)。本小節(jié)將回顧如何將合成生物學(xué)用于細(xì)胞重編程。我們還將討論合成生物學(xué)如何允許工程微生物的時(shí)空調(diào)控，以及如何將這些技術(shù)應(yīng)用于微生物組環(huán)境。

4.2.1使用遺傳邏輯電路調(diào)節(jié)微生物行為

邏輯門是一種通過將二進(jìn)制輸入處理為二進(jìn)制輸出來執(zhí)行基本邏輯功能的電子裝置。大多數(shù)邏輯門按照真值表將兩個(gè)輸入處理成一個(gè)輸出(圖5A)。例如，僅當(dāng)兩個(gè)輸入均為1時(shí)，AND門輸出為1，當(dāng)任一輸入為1時(shí)，OR門輸出為1。每個(gè)邏輯門都可以操作一個(gè)簡(jiǎn)單的任務(wù)。但具有多個(gè)邏輯門的裝置可以像計(jì)算機(jī)一樣處理復(fù)雜的任務(wù)。合成生物學(xué)主要通過轉(zhuǎn)錄因子連接的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)遺傳邏輯門的開發(fā)和實(shí)施。在合成邏輯門中，表達(dá)式表示1，沒有表達(dá)式表示0。AND門可以通過使用需要兩個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子的啟動(dòng)子來構(gòu)建(圖5B)。AND門可以成為調(diào)控輸入和輸出的非常強(qiáng)大而有用的工具。例如，Merk等人構(gòu)建了一個(gè)遺傳AND門，當(dāng)ITPG和連四硫酸鹽同時(shí)存在時(shí)，該門表達(dá)輸出基因。由于IPTG是一種人工誘導(dǎo)劑，而連四硫酸鹽是腸道炎癥標(biāo)志物，因此AND門允許特定基因表達(dá)的時(shí)間和空間調(diào)控。雖然在研究者的概念驗(yàn)證研究中被GFP用于輸出，但AND門可以通過相應(yīng)地改變輸出在時(shí)間或空間上控制藥物的原位分泌。 此外，這種邏輯門是可擴(kuò)展的，可以通過連接多個(gè)可處理更復(fù)雜環(huán)境的邏輯門來適應(yīng)輸出和輸入數(shù)量的增加。Taketani等人通過組合三個(gè)NOR門開發(fā)了一個(gè)2輸入和3輸出邏輯電路。然后在Bacteroides thetaiotaomicron中實(shí)施該電路，使細(xì)菌能以環(huán)境依賴性方式表達(dá)不同的基因，例如生物反應(yīng)器階段，腸道階段以及從宿主中釋放后。在這項(xiàng)研究中，他們使用無水四環(huán)素(aTc)和脫氧膽酸(DCA)作為輸入，并展示了在人類胃腸道模型中工程化的B. thetaiotaomicron如何以依賴輸入的方式改變其行為。這些概念驗(yàn)證研究表明，可擴(kuò)展的邏輯門允許在復(fù)雜環(huán)境下對(duì)工程微生物進(jìn)行空間和時(shí)間調(diào)控。因此，以環(huán)境依賴性方式表現(xiàn)的獨(dú)立工程微生物的使用可提高其活性的特異性和定位，從而提高整體功效。 振蕩器是一種輸出周期性信號(hào)的電子設(shè)備。Elowitz和Leibler構(gòu)建了一個(gè)周期性表達(dá)標(biāo)記基因的遺傳振蕩器。在原始遺傳振蕩器中，三個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子LacI、TetR和cI編碼在一個(gè)稱為壓縮振蕩子的質(zhì)粒中，GFP編碼在另一個(gè)質(zhì)粒中的pLtetO1。因?yàn)門etR抑制cI，cI抑制LacI，而LacI抑制TetR表達(dá)，所以每個(gè)基因的表達(dá)周期性變化。GFP報(bào)告基因受TetR調(diào)控，其表達(dá)也呈周期性變化。盡管最初的壓縮振蕩子顯示出周期性的GFP表達(dá)，但只有40%細(xì)胞的表達(dá)正常。該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不夠穩(wěn)健，導(dǎo)致誤差通過隨機(jī)效應(yīng)傳播。Potvin-Trottier等人進(jìn)行的后續(xù)研究通過去除附著在阻遏物上的降解標(biāo)簽并引入吸收TetR分子的“海綿”序列來改進(jìn)原始研究。這些變化降低了隨機(jī)效應(yīng)，提高了遺傳振蕩器的穩(wěn)健性。最近，Riglar等人在小鼠腸道環(huán)境中測(cè)試了振蕩器的更新版本，以量化體內(nèi)細(xì)菌動(dòng)力學(xué)。他們開發(fā)了RINGS方法來估計(jì)同步后的細(xì)菌世代。振蕩系統(tǒng)用于監(jiān)測(cè)體內(nèi)細(xì)菌動(dòng)力學(xué)，但振蕩系統(tǒng)也可用于原位藥物的周期性給藥。此外，這些研究強(qiáng)調(diào)了合成遺傳回路如何通過DBTL循環(huán)在微生物組環(huán)境中正常運(yùn)作。 前面介紹的遺傳回路示例演示了如何使用不同的遺傳部分(例如啟動(dòng)子，抑制因子和激活因子)重編程微生物以表現(xiàn)出所需的行為。在后續(xù)章節(jié)中，我們將回顧不同類型的細(xì)胞重編程，這些細(xì)胞重編程可以潛在地提高微生物療法對(duì)微生物組相關(guān)疾病的療效。  

圖5. (A)邏輯門及其真值表。(B)轉(zhuǎn)錄AND門的一個(gè)例子。只有A和B都被誘導(dǎo)時(shí)，才會(huì)激活輸出基因的表達(dá)。(C)合成邏輯門在工程微生物時(shí)空控制中的應(yīng)用。(D)在壓縮振蕩子中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。

4.2.2生物傳感器和群體感應(yīng)

為了處理環(huán)境信息，微生物可以配備生物傳感器，可以檢測(cè)pH、溫度、光、金屬以及化學(xué)和生物化合物等。在合成生物學(xué)中，生物傳感器被集成到合成遺傳回路中，以檢測(cè)和處理下游加工的環(huán)境信息，這使得工程微生物能夠以環(huán)境依賴的方式改變其行為，并在細(xì)菌群落之間進(jìn)行交流。 為了設(shè)計(jì)治療性微生物，將生物傳感器植入到基因回路中可以提供幾個(gè)優(yōu)勢(shì)。首先，基于生物傳感器的表達(dá)可以減輕工程微生物的遺傳負(fù)擔(dān)并提高遺傳穩(wěn)定性。眾所周知，應(yīng)用合成遺傳回路會(huì)對(duì)微生物造成負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致基因突變、工程功能喪失和工程微生物的生長(zhǎng)缺陷。大多數(shù)遺傳負(fù)擔(dān)來自細(xì)胞資源的消耗、細(xì)胞適應(yīng)性的降低。因此，通過生物傳感器沉默遺傳回路活性可以減輕遺傳負(fù)擔(dān)并保持工程微生物的功能。另一種減輕遺傳負(fù)擔(dān)的方法是通過群體感應(yīng)(QS)使多個(gè)工程微生物協(xié)同工作。 其次，基于生物傳感器的表達(dá)可以降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)和由此產(chǎn)生的副作用。所有藥物都有副作用，主要是因?yàn)槠鋭┝炕虿槐匾陌邢??；谏飩鞲衅鞯谋磉_(dá)控制通常用于癌癥治療的發(fā)展，需要特定的靶向以減少嚴(yán)重的副作用。一種常見的策略是在來自可在腫瘤微環(huán)境中定植的細(xì)菌(例如Salmonella typhimurium、Clostridium novyi和EcN)缺氧啟動(dòng)子下表達(dá)抗癌產(chǎn)物。He等人設(shè)計(jì)了EcN，在氧依賴性Pvhb下表達(dá)Tum-5或p53，在腫瘤微環(huán)境等缺氧區(qū)域激活轉(zhuǎn)錄。He團(tuán)隊(duì)的研究將工程化的EcN注射到荷瘤小鼠中。他們證實(shí)，工程化的EcN可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，并且非特異性靶向不會(huì)產(chǎn)生明顯的副作用。使用QS機(jī)器和抗菌劑使工程微生物感知并消除分泌QS信號(hào)分子的特定細(xì)菌。第三，生物傳感器可以結(jié)合記憶系統(tǒng)用于診斷工具，這將在下一節(jié)中討論。 生物傳感器的特異性對(duì)于工程微生物的正常功能至關(guān)重要，特別是在復(fù)雜的異質(zhì)環(huán)境中，例如包含幾種結(jié)構(gòu)相似配體的人體腸道。然而，野生型生物傳感器通常是非特異性的，并且對(duì)幾種結(jié)構(gòu)相似的分子起反應(yīng)。因此，需要開發(fā)能夠在體內(nèi)區(qū)分這些配體的生物傳感器，以確保對(duì)疾病的精確反應(yīng)。Meyer等人采用定向進(jìn)化設(shè)計(jì)了12個(gè)具有較低交叉反應(yīng)性的高特異性生物傳感器。最近，Rottinghaus等人基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，通過合理提高生物傳感器特異性，設(shè)計(jì)了可用于芳香族氨基酸或神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)特異性感應(yīng)的EcN。這些研究擴(kuò)大了用于治療目的的高質(zhì)量生物傳感器的工具箱。

4.2.3記憶系統(tǒng)

細(xì)胞記憶是一種將瞬態(tài)信號(hào)轉(zhuǎn)換為長(zhǎng)時(shí)間響應(yīng)的現(xiàn)象。細(xì)胞記憶在大多數(shù)生物體中很常見，并廣泛用于生物事件，例如分化、表觀遺傳學(xué)和免疫。由于其潛在的應(yīng)用，基于轉(zhuǎn)錄因子、DNA重組和RNAi等各種機(jī)制，研究者已構(gòu)建了許多類型的合成記憶電路。 記憶系統(tǒng)可分為可逆或不可逆兩類。可逆記憶系統(tǒng)可以在檢測(cè)到另一個(gè)信號(hào)時(shí)關(guān)閉。Gardner等人構(gòu)建了一個(gè)遺傳開關(guān)，該開關(guān)可以通過實(shí)現(xiàn)LacI和cI或TetR相互抑制其表達(dá)，從而作為可逆記憶系統(tǒng)(圖6A)。由于抑制因子相互抑制表達(dá)，共表達(dá)處于不穩(wěn)定穩(wěn)態(tài)，在沒有任何刺激的情況下，在每個(gè)細(xì)胞中任一抑制因子的表達(dá)隨機(jī)占主導(dǎo)地位。Gardner等人還證明，短暫暴露于抑制因子抑制劑可以改變細(xì)胞狀態(tài)，并且在抑制劑停用后這種狀態(tài)可持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間。另一方面，一個(gè)不可逆記憶系統(tǒng)無法在檢測(cè)到信號(hào)時(shí)關(guān)閉。O'Gorman等人利用Flippase開發(fā)了一種不可逆記憶系統(tǒng)，該系統(tǒng)在受到特定刺激后刪除報(bào)告基因，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中保持報(bào)告基因的表達(dá)。

圖6. (A) Gardner等人開發(fā)的遺傳開關(guān)的基因回路。TetR和lacI各自抑制轉(zhuǎn)錄。在沒有誘導(dǎo)劑時(shí)tetR或lacI表達(dá)占主導(dǎo)地位。每種誘導(dǎo)劑(aTc或IPTG)抑制抑制因子并誘導(dǎo)表達(dá)。細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)劑時(shí)lacI或tetR占主導(dǎo)地位。(B)作為腸道炎癥診斷工具的開關(guān)切換記憶電路。當(dāng)ttrS/ttrR組分檢測(cè)到炎癥標(biāo)志物連四硫酸鹽時(shí)，Cro被激活。電路檢測(cè)到連四硫酸鹽時(shí)cro的表達(dá)占主導(dǎo)地位。

合成記憶電路是研究基本生物學(xué)機(jī)制的有用研究工具，并在醫(yī)學(xué)和工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用前景。例如，用于創(chuàng)建組織特異性敲除菌株的Cre-loxP系統(tǒng)是一個(gè)不可逆的記憶系統(tǒng)，可用于研究特定器官和組織中的基因功能，因?yàn)樗粫?huì)干擾其他器官和組織中的基因功能。該系統(tǒng)還被用于追蹤細(xì)胞的發(fā)育譜系。對(duì)于工業(yè)應(yīng)用，合成記憶電路可用于降低誘導(dǎo)劑的成本，以實(shí)現(xiàn)持續(xù)誘導(dǎo)以產(chǎn)生感興趣的生化物質(zhì)。通過結(jié)合生物傳感器，合成記憶系統(tǒng)可以作為腸道微生物組相關(guān)疾病的非侵入性診斷工具。Kotula等人證明，使用cI/cro雙穩(wěn)態(tài)遺傳開關(guān)的合成記憶電路可以在體內(nèi)發(fā)揮作用。在Riglar等人的后續(xù)研究中，他們通過記憶系統(tǒng)和生物傳感器來檢測(cè)大腸桿菌菌株NGF-1中的炎癥標(biāo)志物連四硫酸鹽，進(jìn)而開發(fā)了一種腸道炎癥診斷工具(圖6B)。他們使用TtrR/TtrS雙組分系統(tǒng)檢測(cè)連四硫酸鹽，觸發(fā)記憶設(shè)備和記憶設(shè)備的cI/cro雙穩(wěn)態(tài)遺傳開關(guān)。這可能允許在癥狀惡化之前檢測(cè)腸道器官的疾病發(fā)生。 生物傳感器是合成生物學(xué)方法中處理環(huán)境線索的重要組成部分。然而，能用于監(jiān)測(cè)微生物組內(nèi)部狀態(tài)的生物傳感器數(shù)量仍然有限。為了克服這個(gè)問題，Naydich等人開發(fā)了一種高通量記憶系統(tǒng)，可用于篩選在小鼠腸道中起作用的生物傳感器。他們將cI/cro雙穩(wěn)態(tài)撥動(dòng)開關(guān)作為記憶設(shè)備。在記憶關(guān)閉狀態(tài)下，cI抑制因子占主導(dǎo)地位，而cro和下游lacZ表達(dá)關(guān)閉。觸發(fā)裝置由目標(biāo)條件觸發(fā)的候選啟動(dòng)子下cI的顯性陰性突變體(cIDN)組成，cIDN的DNA結(jié)合區(qū)有一個(gè)N55K突變，與野生型(WT) cI形成二聚體并抑制cro和lacZ的表達(dá)。一旦cro表達(dá)足夠高，即使沒有刺激，cro也可以繼續(xù)抑制cI。因此，生成觸發(fā)器設(shè)備庫(kù)后，高通量記憶系統(tǒng)可用于篩選在目標(biāo)條件下活躍的啟動(dòng)子。他們測(cè)試了這種高通量記憶系統(tǒng)以篩選對(duì)炎癥小鼠腸道環(huán)境反應(yīng)增加的啟動(dòng)子。這項(xiàng)研究說明了如何將合成生物學(xué)方法作為調(diào)查工具。

4.2.4生物控制和藥物輸送的殺滅開關(guān)

隨著開發(fā)微生物作為治療劑的研究取得進(jìn)展，出現(xiàn)了與轉(zhuǎn)基因生物的生物安全有關(guān)的問題，這引起了人們對(duì)潛在危險(xiǎn)生物材料向環(huán)境傳播的風(fēng)險(xiǎn)增加的擔(dān)憂。因此，實(shí)施有效的生物控制系統(tǒng)對(duì)于現(xiàn)實(shí)世界的使用至關(guān)重要，特別是使用在野生環(huán)境中比常用的實(shí)驗(yàn)室菌株更具抗性的工程野生型共生微生物的情況下。已經(jīng)通過合成生物學(xué)方法制定了許多生物控制戰(zhàn)略。最簡(jiǎn)單的方法是引入營(yíng)養(yǎng)缺陷突變，其中微生物被設(shè)計(jì)成依賴于特定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)。然而，營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株可以在提供營(yíng)養(yǎng)的自然環(huán)境中存活。因此該方法只能用于可在體外分離和培養(yǎng)的微生物。所以殺滅開關(guān)可以作為生物控制的替代策略。 殺滅開關(guān)長(zhǎng)期以來一直用于合成生物學(xué)。1987年，Molin等人通過在色氨酸抑制的Trp啟動(dòng)子下表達(dá)Hok基因，開發(fā)了一種條件殺滅開關(guān)。Hok基因使細(xì)胞膜去極化并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。他們發(fā)現(xiàn)，Hok可以在廣泛的革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌中起作用。2016年，Chan等人開發(fā)了被動(dòng)激活的“deadman”和“passcode”殺滅開關(guān)。deadman開關(guān)激活毒素基因，并在缺乏信號(hào)(ATc)的情況下使必需基因失活。為了提高魯棒性，在deadman開關(guān)中實(shí)現(xiàn)了遺傳撥動(dòng)開關(guān)(圖7A)。另一方面，passcode殺滅開關(guān)采用了混合LacI-GalR家族TFs，允許控制細(xì)胞死亡的多個(gè)輸入分子(圖7B)。他們發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)期培養(yǎng)后IS1和IS5的丟失導(dǎo)致密碼電路中大量的失活突變，增加了passcode的穩(wěn)定性。

圖7. (A) deadman殺滅開關(guān)的遺傳回路。撥動(dòng)開關(guān)的輸出激活毒素并使殺死細(xì)胞的必需基因失活，這可以通過IPTG誘導(dǎo)。隨后Mf-lon蛋白酶降解lacI和必需基因，以增加電路穩(wěn)定性。(B) password殺滅開關(guān)的遺傳回路。A、B和C代表抑制基因。輸入a或b的缺失或輸入c的增加激活毒素基因的表達(dá)。

4.3 底盤工程

為促進(jìn)所需微生物的細(xì)胞重編程，必須將相關(guān)的遺傳回路引入微生物中。這種微生物通常被稱為“底盤”，該術(shù)語(yǔ)基于設(shè)備和機(jī)器(如汽車)的結(jié)構(gòu)框架。據(jù)此，微生物通常用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化以引入新功能，而不會(huì)改變其基因組DNA。事實(shí)上，早期的許多概念驗(yàn)證研究都是通過基于質(zhì)粒的方法完成的?；谫|(zhì)粒的方法存在的問題包括質(zhì)粒DNA的穩(wěn)定性較低以及細(xì)胞間拷貝數(shù)差異引起的表達(dá)噪聲。因此，將遺傳部分或設(shè)備整合到底盤基因組DNA中是優(yōu)選做法，特別是用于治療目的。此外，底盤工程能夠去除或增強(qiáng)生物體特征，以設(shè)計(jì)出更合適的用于治療目的底盤。盡管底盤開發(fā)具有優(yōu)勢(shì)，但共生微生物的遺傳操作仍然落后于E. coli和S. cerevisiae等模式生物，這兩者都不是人類微生物組的主要成員。在本小節(jié)中，我們將回顧當(dāng)前基于CRISPR的微生物基因操作和原位DNA轉(zhuǎn)移方法的發(fā)展，這些方法允許對(duì)遺傳難處理微生物進(jìn)行遺傳修飾。

4.3.1基于CRISPR的基因編輯/操作工具

CRISPR最初是作為古細(xì)菌的免疫系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)的，盡管現(xiàn)在它被認(rèn)為是一種遺傳學(xué)工具。CRISPR主要通過引入DNA斷裂進(jìn)行基因編輯，然后利用供體DNA進(jìn)行同源重組。CRISPR導(dǎo)向的同源重組加速了許多生物體的基因組工程，包括那些以前被認(rèn)為難以操縱的基因組。目前，CRISPR工具可用于多種共生細(xì)菌和酵母的定點(diǎn)誘變和基因缺失/插入，例如大腸桿菌、乳桿菌、梭菌、擬桿菌、葡萄球菌、芽孢桿菌、酵母菌和念珠菌。CRISPR還被用于設(shè)計(jì)微生物組和共生微生物，以表征微生物組相關(guān)表型的基因功能。Guo等人使用CRISPR/Cas9證明了宿主免疫反應(yīng)與梭菌產(chǎn)生的SCFAs之間的潛在聯(lián)系。在這項(xiàng)研究中，Guo等人開發(fā)了一種CRISPR/Cas9系統(tǒng)，用于操縱Clostridium sporogenes并刪除SCFA相關(guān)基因，導(dǎo)致SCFA產(chǎn)生減少。通過比較用野生型菌株和敲除菌株給藥的小鼠的免疫反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)SCFA的缺失使IgA漿細(xì)胞增加。這支持了SCFA的免疫調(diào)節(jié)功能。最終，該研究表明基于CRISPR的微生物組遺傳學(xué)可以幫助識(shí)別合成生物學(xué)方法所需的因果基因及其相互作用。 盡管CRISPR驅(qū)動(dòng)的基因編輯廣泛應(yīng)用于許多生物體中，但在大多數(shù)同源重組活性有限的共生微生物中，由CRISPR/Cas9引起的DNA斷裂往往導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而不是基因編輯。因此，CRISPR/Cas9不能用于大多數(shù)非模式共生菌。對(duì)于這些微生物，CRISPRi、CRISPRa或堿基編輯器可能是毒性較小的替代品。CRISPRi和CRISPRa是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性(而不是編輯基因)的工具。這兩種工具都采用具有DNA結(jié)合活性而非DNase活性的dCas9，分別與轉(zhuǎn)錄抑制因子或激活因子融合以調(diào)節(jié)sgRNA識(shí)別位點(diǎn)附近的轉(zhuǎn)錄。因此，CRISPRi和CRISPRa作為可編程轉(zhuǎn)錄因子，理想情況下可以靶向任何基因的啟動(dòng)子，其可編程性允許使用CRISPRi文庫(kù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行敲除篩選。因此，Peters等人構(gòu)建了一個(gè)CRISPRi文庫(kù)，該文庫(kù)涵蓋了B. subtilis用于功能篩選的所有必需基因，并確定了抗生素的作用機(jī)制。 CRISPRi和CRISPRa具有很高的可編程性，因此其可以用作構(gòu)建遺傳回路的自定義轉(zhuǎn)錄因子。此后，構(gòu)建出了許多基于CRISPR的合成基因回路。使用CRISPRi和CRISPRa成功合成多個(gè)邏輯門、緩沖區(qū)、NOT、AND、OR、NAND、NOR、XOR和NIMPLY。除了合成邏輯門，CRISPRi和CRISPRa也實(shí)現(xiàn)了雙穩(wěn)態(tài)撥動(dòng)開關(guān)、振蕩器等合成基因電路。到目前為止，雖然CRISPRi和CRISPRa構(gòu)建的大多數(shù)遺傳回路都是在E. coli或S. cerevisiae中，但這種方法也可促進(jìn)非模式生物中遺傳回路的構(gòu)建。 CRISPR/Cas9基因編輯通過DNA鏈斷裂和隨后的同源重組引入突變，而堿基編輯器使用脫氨酶使DNA突變。堿基編輯器使用dCas9或切口酶Cas9融合到可以轉(zhuǎn)換核苷酸的脫氨酶上。例如，胞嘧啶堿基編輯器將C轉(zhuǎn)換為G，而腺嘌呤堿基編輯器促進(jìn)A到T的轉(zhuǎn)換。由于堿基編輯是一種新技術(shù)，目前還沒有將其用于微生物組工程的研究。然而，與使用細(xì)菌相比，使用堿基編輯器編輯微生物組的毒性較低，預(yù)計(jì)將很快應(yīng)用于治療。 另一個(gè)有前景的微生物組工程CRISPR相關(guān)工具是CRISPR相關(guān)的Tn7轉(zhuǎn)座子(CAST)。2017年P(guān)eters等人首次報(bào)道了CAST。他們發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌攜帶Tn7樣轉(zhuǎn)座子，包括CRISPR亞型I-F的Cas效應(yīng)蛋白。Tn7樣轉(zhuǎn)座子缺乏介導(dǎo)Tn7轉(zhuǎn)座子的目標(biāo)插入的TnsE。因此研究者假設(shè)這種類型的轉(zhuǎn)座子劫持并利用CRISPR系統(tǒng)進(jìn)行DNA識(shí)別，通過CRISPR介導(dǎo)的方式進(jìn)行CAST轉(zhuǎn)置。2019年，兩個(gè)團(tuán)隊(duì)都證明了CAST以CRISPR介導(dǎo)的方式插入大腸桿菌的靶位點(diǎn)。兩者都表明可以通過改變gRNA序列來重編程靶位點(diǎn)。Strecker等人的結(jié)果顯示DNA插入效率在不進(jìn)行任何選擇的情況下可以達(dá)到80%，脫靶插入頻率<1%。根據(jù)研究結(jié)果，插入效率高度依賴于目標(biāo)位點(diǎn)。Strecker團(tuán)隊(duì)還在測(cè)試的48個(gè)位點(diǎn)中檢測(cè)到29個(gè)位點(diǎn)的靶向插入。2022年，Rubin等人應(yīng)用CAST開發(fā)了DNA編輯一體式RNA引導(dǎo)的CRISPR-Cas轉(zhuǎn)座酶(DART)系統(tǒng)，該系統(tǒng)在小鼠腸道微生物群落中具有位點(diǎn)和物種特異性。 總而言之，CRISPR能夠操縱多種基因組DNA。DNA傳遞仍然是下游過程實(shí)驗(yàn)操作的第一步，但大多數(shù)共生微生物是不可培養(yǎng)的。因此，下一節(jié)將回顧微生物群原位基因操作的當(dāng)前進(jìn)展。

4.3.2微生物的原位遺傳操作

如第2節(jié)所述，多組學(xué)研究揭示了微生物群基因如何與多種人類疾病和健康狀況相關(guān)。然而，闡明微生物群基因與宿主疾病的因果關(guān)系仍然很困難，主要是由于在非模式微生物群中進(jìn)行遺傳操作的困難以及體外培養(yǎng)存在的挑戰(zhàn)。而化學(xué)轉(zhuǎn)化和電穿孔等傳統(tǒng)DNA遞送方法只能在體外應(yīng)用。因此，在微生物組工程中將DNA原位轉(zhuǎn)移到微生物群中的替代技術(shù)越來越受歡迎。 為了適應(yīng)不同的條件，環(huán)境細(xì)菌在不同物種之間積極交換質(zhì)粒DNA，這一過程稱為水平基因轉(zhuǎn)移(HGT)。最廣泛使用的HGT方法之一是細(xì)菌接合，通過IV型分泌系統(tǒng)將質(zhì)粒DNA從供體細(xì)菌轉(zhuǎn)移到受體細(xì)菌。腸道微生物群被認(rèn)為是接合基因轉(zhuǎn)移的良好環(huán)境。據(jù)報(bào)道，細(xì)菌接合可用于來自不同供體的腸道微生物群的原位操縱。作為一種微生物組工程工具，最近細(xì)菌接合變得越來越重要。Ronda等人開發(fā)了一種稱為通過原位接合改變腸道微生物組宏基因組(MAGIC)的技術(shù)，該技術(shù)能夠使用Inc.Palpha家族RP4接合系統(tǒng)將大腸桿菌供體菌株的質(zhì)粒DNA原位轉(zhuǎn)移到腸道微生物群。該系統(tǒng)允許他們將DNA引入革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌。編碼轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座盒的結(jié)合質(zhì)粒將DNA原位整合到基因組DNA中。熒光激活細(xì)胞分選(FACS)和16S RNA分析表明，至少有5%的腸道細(xì)菌被成功地原位修飾。然而，72小時(shí)后接合子將不再被檢測(cè)到，可能是由于毒性或載體不穩(wěn)定。因此，需要進(jìn)一步改進(jìn)MAGIC，以用于腸道微生物群的穩(wěn)定基因組操作，以研究和鑒定微生物組相關(guān)疾病的致病基因。 另一種將DNA原位轉(zhuǎn)移到復(fù)雜群落細(xì)菌中的方法是使用噬菌體。噬菌體是感染特定細(xì)菌并將其基因組DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)菌細(xì)胞中的病毒。感染后，噬菌體來源的質(zhì)粒DNA被整合到宿主基因組DNA中或在宿主中復(fù)制。通過將所需的DNA片段克隆到噬菌體的基因組DNA中，外源基因可以轉(zhuǎn)移到細(xì)菌細(xì)胞中，在那里它們以相當(dāng)高的效率賦予新功能。值得注意的是，P2噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可以達(dá)到接近100%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他DNA傳遞方法。由于噬菌體具有靶標(biāo)特異性、高效性和原位活性等特點(diǎn)，在微生物組工程中得到了廣泛的應(yīng)用。Lam等人證明噬菌體可以將CRISPR/Cas9盒傳遞到小鼠腸道的大腸桿菌中，表明由噬菌體原位遞送的CRISPR/Cas9可能導(dǎo)致染色體大量缺失。 由于沒有適用于所有共生微生物的通用DNA轉(zhuǎn)移方法，因此了解遺傳易感微生物并為感興趣的微生物選擇最佳的原位DNA轉(zhuǎn)移方法至關(guān)重要。Rubin等人開發(fā)了環(huán)境轉(zhuǎn)化測(cè)序(ET-seq)和DNA編輯一體式RNA引導(dǎo)的CRISPR-Cas轉(zhuǎn)座酶(DART)系統(tǒng)，這些技術(shù)允許在微生物群落中鑒定遺傳可處理的細(xì)菌以及原位生物體和位點(diǎn)特異性遺傳操作。在ET-seq中，含有非靶向mariner轉(zhuǎn)座子的DNA通過接合、電穿孔或自然轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移到微生物群落，之后通過深度測(cè)序鑒定轉(zhuǎn)座子整合位點(diǎn)。在鑒定可處理細(xì)菌和最佳DNA傳遞方法后，設(shè)計(jì)了生物體和位點(diǎn)特異性CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒，并將其引入土壤和嬰兒腸道微生物群中。利用DART靶向大腸桿菌的菌株特異性基因組位點(diǎn)，并證明DART可以改變大腸桿菌菌株組成。另一個(gè)優(yōu)化DNA操作的例子是由Jin等人完成的。他們開發(fā)了一種在體外和宿主中操縱非模型腸道微生物群(梭菌)的工具。他們的工具包括鑒定兼容的rep和ori載體組合，大腸桿菌和梭菌的抗體選擇，最后是減少限制性修飾以提高穩(wěn)定接合和基因組修飾的穩(wěn)定性。

5挑戰(zhàn)和限制

在第2節(jié)中，本文回顧了微生物組研究，這些研究表明微生物組與疾病/健康狀態(tài)之間存在聯(lián)系。這些研究表明，微生物組通過微生物組與宿主的相互作用在人類健康中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。第3節(jié)回顧了微生物組的組成和功能改變?nèi)绾斡绊懭祟惤】禒顩r，表明微生物組可能是多種疾病的促成因素。揭示疾病中微生物組的因果關(guān)系使其可通過各種策略進(jìn)行調(diào)控。然而，微生物組工程療法尚未產(chǎn)生可行的商業(yè)產(chǎn)品。雖然在某些病例中我們正在等待臨床評(píng)估的結(jié)果，但由于療效的缺乏，其他療法(特別是工程細(xì)菌療法)迄今為止無法在臨床試驗(yàn)中取得好結(jié)果。

因此，作者提出了阻礙利用工程微生物組療法治療疾病的可行性的三個(gè)限制：

(1)缺乏微生物組相關(guān)疾病的多層次機(jī)制理解；

(2)改變遺傳難處理生物體所面臨的挑戰(zhàn)；

(3)工程微生物組的時(shí)空調(diào)控。

在第4節(jié)中，我們回顧了可以幫助解決這些局限性的元組學(xué)研究和合成生物學(xué)工具的當(dāng)前進(jìn)展。尤其是代謝組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)和多元組學(xué)方法，能夠在代謝物、基因和基因相互作用水平上進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，從而加深我們對(duì)微生物組相關(guān)疾病的分子機(jī)制的了解，并允許設(shè)計(jì)針對(duì)特定靶標(biāo)的可預(yù)測(cè)和調(diào)節(jié)行為的重編程微生物。此外，使用細(xì)菌接合和噬菌體的CRISPR和原位DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)允許在體外和原位操縱遺傳難處理微生物。 本文還回顧了合成生物學(xué)中來自工程領(lǐng)域的常見設(shè)計(jì)原則如何促進(jìn)具有合成遺傳回路的工程微生物的時(shí)空調(diào)節(jié)。雖然大多數(shù)實(shí)驗(yàn)是在體外條件下進(jìn)行的，但也有些實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于腸道微生物組，證明了微生物組環(huán)境中時(shí)空調(diào)節(jié)的可行性。 如前所述，功能元組學(xué)和合成生物學(xué)方法有助于解決阻礙工程微生物治療可行性的限制。然而，因?yàn)楹铣缮飳W(xué)的出現(xiàn)獨(dú)立于微生物組研究，實(shí)驗(yàn)工具仍需專門用于研究微生物組。因此大多數(shù)可用的工具都是為大腸桿菌設(shè)計(jì)的，以便在恒定的實(shí)驗(yàn)室條件下研究。迄今為止，非模式共生微生物組的標(biāo)準(zhǔn)化遺傳部分的收集仍然有限或無法實(shí)現(xiàn)。例如，最初大腸桿菌基因部分是為體外目的而開發(fā)的，所以它們?cè)谖⑸锝M環(huán)境中的大多數(shù)功能沒有得到很好的評(píng)估，可能導(dǎo)致遺傳回路穩(wěn)定性的喪失。由于個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的微生物組多樣性，穩(wěn)健的設(shè)計(jì)對(duì)于治療應(yīng)用至關(guān)重要。因此，體外平臺(tái)(如器官芯片和類器官)的發(fā)展將加速體內(nèi)環(huán)境遺傳部件和基因回路的優(yōu)化。

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