丙酮酸作為氨基酸和各類工業(yè)化學品生物合成的重要組成部分，其處在糖酵解途徑和三羧酸（TCA）循環(huán)的上游。這種情況導致高達 50% 的丙酮酸以二氧化碳的形式損失。

2 月 5 日，來自中國科學院微生物研究所的溫廷益、張蕓團隊發(fā)表論文 Model-guided metabolic rewiring to bypass pyruvate oxidation for pyruvate derivative synthesis by minimizing carbon loss，該團隊基于 T7 RNAP-sRNA 系統(tǒng)調(diào)節(jié)基因表達，建立了一種新的葡萄糖生長細菌代謝模式。從而在維持生長適應性并最大限度減少有氧條件下碳損失的基礎(chǔ)上，合成丙酮酸衍生產(chǎn)品。

研究結(jié)果表明，構(gòu)建的工程化菌株能夠分別達到 L-亮氨酸的最大滴度為 22.46 g/L、L-丙氨酸最大滴度為 27.62 g/L 以及 L-纈氨酸最大滴度為 6.28 g/L。

（來源：Applied and Industrial Microbiology）

在利用葡萄糖的有氧代謝過程中，丙酮酸經(jīng)丙酮酸脫氫酶復合物（PDHC）氧化生成乙酰輔酶 A，為 TCA 循環(huán)提供能量。值得注意的是，該途徑導致高達 50% 的丙酮酸通過二氧化碳損失，而另一部分丙酮酸則被募集合成氨基酸。這就說明丙酮酸節(jié)點的代謝通量具有靈活、可調(diào)節(jié)的特性。

對此，研究團隊采取提高丙酮酸利用率的策略，通過改造大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌以阻止丙酮酸氧化，從而最大程度地減少丙酮酸經(jīng)二氧化碳所造成的消耗。

該項研究中，研究人員使用高效的遺傳工具和適應性實驗室進化（ALE）工具開展中心碳代謝重編程，以生產(chǎn)丙酮酸衍生的 L-丙氨酸、L-纈氨酸和 L-亮氨酸。根據(jù)谷氨酸棒桿菌模型 iCW773 模擬結(jié)果表明，L-丙氨酸、L-纈氨酸和 L-亮氨酸的合成能夠與丙酮酸損耗途徑形成競爭。

為了修改 L-亮氨酸合成途徑以提升產(chǎn)量，研究人員逐步進行途徑改造，通過提升 leuC、leuD 和 leuB 基因的轉(zhuǎn)錄水平，使 LtbR 失活以及刪除 alaT、ldhA 和 pyc 等方式，提升 L-亮氨酸滴度。

▲圖丨L-亮氨酸積累的計算機設(shè)計和重編程丙酮酸代謝（來源：Applied and Industrial Microbiology）

在此之后，研究團隊進一步構(gòu)建了約 3,000 個前導順反子變體的文庫，以在翻譯階段微調(diào)目標基因的表達。該團隊通過表達異源的雙功能磷酸解酮酶（FxpK），引入雙歧分流途徑使一分子葡萄糖生成三分子非丙酮酸衍生的乙酰輔酶 A，從而繞過丙酮酸的氧化。

接下來，研究者通過噬菌體 T7 RNA 聚合酶（T7 RNAP）介導的 sRNA 開關(guān)動態(tài)下調(diào) TCA 循環(huán)，該方法能夠以可控的方式調(diào)節(jié)細胞生長和 L-亮氨酸生物合成之間丙酮酸通量分布。數(shù)據(jù)表明，攜帶 ?PT7(C4)-anti-aceE 和 PT7(H9)-anti-gltA sRNAs 的菌株其 L-亮氨酸產(chǎn)量比沒有表達 sRNA 時的結(jié)果高 16%。

另一方面，基于此前代謝工程領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)，研究團隊在底盤菌株中建立了有氧條件下葡萄糖的新代謝模式。利用乙醛酸分流作為唯一的 C4 回補途徑，結(jié)合雙歧分流作為非丙酮酸衍生的乙酰輔酶 A 合成途徑，可最大限度地減少碳損失。

經(jīng)補料分批發(fā)酵，在生物反應器中反應 55 小時 L-亮氨酸的最大滴度達到了 22.46 g/L，已接近于該物質(zhì)溶解度。對于 L-丙氨酸的合成而言，通過編碼來自球形賴氨酸芽孢桿菌的丙氨酸脫氫酶可構(gòu)建新的合成途徑，然后使用 sRNA 開關(guān)動態(tài)控制丙酮酸分配。在搖瓶培養(yǎng)中，最大 L-丙氨酸滴度可達 27.62±0.44 g/L。L-纈氨酸的生產(chǎn)也類似于上述情況，其產(chǎn)量可達到 6.28±0.27 g/L。

▲圖丨用于生產(chǎn)丙酮酸衍生產(chǎn)品的工程化底盤細胞和發(fā)酵結(jié)果（來源：Applied and Industrial Microbiology）

本次研究在細胞水平上通過“過程控制”，實現(xiàn)了對于丙酮酸通量的動態(tài)控制，從而讓細胞資源在生長和生產(chǎn)之間被按需分配。該過程中，T7 RNAP 介導的 sRNA 工具箱實現(xiàn)了對于多種基因表達的調(diào)節(jié)，其能夠在基因組規(guī)模上構(gòu)建用于代謝網(wǎng)絡調(diào)控的 RNAi 文庫。

總體而言，該研究建立了一種新型的葡萄糖生長細菌代謝模式，能夠最大限度地減少有氧條件下的碳損失，并為制造丙酮酸衍生產(chǎn)品的細胞設(shè)計提供了寶貴的見解。

素材來源官方媒體/網(wǎng)絡新聞

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