N-糖基化（N-linked glycosylation）是一種重要的蛋白質修飾。影響一些如蛋白質的折疊、半衰期、轉運等基本的細胞過程和免疫原性，以及其在細胞間以及細胞外基質成分或病原體之間的相互作用。在真核細胞中，N-Glycan是在兩個專門的細胞器，即內質網(ER)和高爾基體中合成的。這兩個細胞器共里有幾十種功能不同的糖基轉移酶和糖苷酶，它們依次對不斷增長的寡糖進行修飾。然而，考慮到相關的酶促反應沒有任何模板并且相互競爭相同的底物，這種酶促反應的順序如何安排以保證N-Glycan的正常合成就不是非常清楚了。本文將簡單的梳理一下N-Glycan從內質網到高爾基體的合成過程以及相關問題。

圖1：N-糖基化在內質網與高爾基體中的合成過程圖示 

N-Glycan 在內質網的生物合成過程   

N-Glycan的合成基石  

N-Glycan在內質網的早期合成中都是保守的，其異質性是出現在其后續(xù)的加工過程中。所有的N-Glycan都有一個共同的核心結構(asn-GlcNAc2Man3-)，通過在核心結構上添加一些其他末端的糖殘基進一步延長。根據所使用的糖殘基和連接類型，這些添加物可以顯著影響N-Glycan的結構。作為添加物使用的主要是N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）、甘露糖（Mannose）、半乳糖（Galactose）、巖藻糖（Fucose）和唾液酸（N-乙酰神經氨酸（Neu5Ac））。在某些情況下，N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）殘基可以用來構建N-Glycan。葡萄糖（Glucose）殘基在內質網的合成過程中也被暫時納入生長中的N-Glycan中，但是葡萄糖會在N-Glycan后續(xù)的合成過程中被移除。

前體合成  

內質網腔存在一系列Alg（Asparagine-linked glycosyltransferase）家族的糖基化轉移酶，該系列的酶負責協(xié)調將脂質連接的寡糖（lipid-linked oligosaccharide，LLO）前體（Glc3Man9-GlcNAc2）裝配到膜包埋的磷酸多萜醇（Dol-P）載體上。它們利用核苷酸糖（UDP-GlcNAc、GDP-Man、Dol-P-Man和Dol-P-Glc）作為供體底物，逐步組裝LLO。LLO的組裝開始于內質網膜的細胞質面，第一個GlcNAc是由糖基化轉移酶Alg7p添加的，它使用核苷酸糖UDP-GlcNAc在磷酸多萜醇（Dol-P）載體上生成GlcNAc-PP-dol，隨后，Alg13p/Alg14p轉移酶使用UDP-GlcNAc中加入第二個GlcNAc，產生成GlcNAc2-PP-dol。接下來，內質網甘露糖轉移酶（Alg1、Alg2和Alg11）也相互形成復合物，從核苷酸糖GDP-Man供體中加入五個甘露糖殘基，形成Man5GlcNAc2-PP-Dol中間物。因此，在內質網膜的細胞質面上的LLO前體合成涉及三個主要的酶復合物，一個是由Alg7/Alg13/Alg14形成，另外兩個由Alg1/Alg2和Alg1/Alg11形成。這種安排可能確保每個甘露糖殘基將正確地與前體連接。

隨后將Man5GlcNAc2-PP-Dol中間物轉運到內質網腔內，這一過程被目前認為是由一種被稱為Rft1的蛋白介導的。在內質網腔內，甘露糖基轉移酶（Alg3/Alg9/Alg12）和葡萄糖基轉移酶（Alg6/Alg8/Alg10）分別通過附加四個甘露糖殘基和三個葡萄糖殘基來進一步拉長LLO前體。這就完成了前體的合成，產生了Glc3Man9GlcNAc2-PP-Dol結構，該結構以后將被用作供體底物，用于將一個N-glycan整體轉移到一個合適的多肽鏈。值得注意的是，與內質網細胞質面的初始催化步驟不同，在內質網腔內完成LLO前體的合成并不使用核苷酸糖作為供體。相反，在這種情況下，膜包埋的Dol-P-Man和Dol-P-Glc被用作糖供體。它們的合成也發(fā)生在內質網膜的細胞質面（分別來自GDP-Man和UDP-Glc），然后被轉運到腔內側。

最常見的糖基化位點序列為Asn-X-Ser/Thr（X不為脯氨酸），這兩者中，Asn-X-Thr序列比Asn-X-Ser更受歡迎，主要是因為蘇氨酸的側鏈甲基與寡糖轉移酶（Oligosaccharyltransferase complex，OST）結合域中的天冬酰胺-賴氨酸結構之間的相互作用增加了復合物的穩(wěn)定性。氨基酸X和側翼氨基酸的性質也有助于特定序列的糖基化。此外，序列在多肽中的位置、蛋白質的二級和三級結構等都會影響糖基化出現的可能性。因此，單憑序列的存在不能作為N-糖基化的充分預測因素。事實上，在分泌的糖蛋白中，大約有三分之一的已確定的序列仍然是非糖基化的。

葡萄糖殘基的移除與蛋白質折疊的質量控制  

一旦多肽被轉運到內質網腔內并開始折疊，新連接的Glc3Man9GlcNAc2結構將被進一步修改。第一步是由一個跨膜酶α-葡萄糖苷酶I去除末端的葡萄糖殘基，然后由可溶性的α-葡萄糖苷酶 II快速去除第二個葡萄糖殘基，所得到的單葡萄糖化的寡糖是伴侶蛋白鈣連蛋白calnexin和鈣網蛋白calreticulin的配體，這些伴侶蛋白也很容易與一種二硫鍵異構酶ERp57結合，ERp57催化鏈間和鏈內二硫鍵的形成，從而幫助新生糖蛋白的正確折疊。隨后最后一個葡萄糖殘基會在蛋白折疊過程中被α-葡萄糖苷酶II除去。暴露出疏水區(qū)塊的未折疊或者錯誤折疊的蛋白會被UGGT（UDP-glucose-glycoprotein glucosyl-transferase）所識別，此種酶可以再一次將蛋白的甘露糖殘基重新添加上葡萄糖從而重新創(chuàng)建一個Glc1Man9GlcNAc2的寡糖結構，該結構再次被伴侶蛋白-二硫鍵異構酶復合物所作用，進而重新進行蛋白折疊。這種去除和重新添加葡萄糖殘基的過程可以持續(xù)幾個周期，直到蛋白質被正確折疊。

隨后甘露糖被內質網甘露糖苷酶I（ERMan1）修剪，從N-連接寡糖的中間分支上去除末端的甘露糖殘基。然后生成的Man8GlcNAc2結構可以被LMAN1（Lectin mannose-binding 1）識別，這種甘露糖特異性凝集素可以將糖基化蛋白打包利索裝進包被蛋白復合物II（Coat Protein complex II，COPII）從而通過內質網—高爾基體中間體(ERGIC)運送到高爾基體。

內質網中各種條件的變化，比如鈣平衡的改變、氧化還原狀態(tài)和葡萄糖剝奪或突變會導致錯誤折疊或者未組裝的蛋白在內質網中積累并對細胞活力造成損害。細胞本身可以通過啟動內質網應激抑制翻譯速率并增加伴侶蛋白的表達等來減少損害。如果這些措施還是失敗的話，錯誤折疊的蛋白會被引導通過內質網相關蛋白降解(ER-associated degradation，ERAD)的途徑進行清除。此過程開始于內質網甘露糖苷酶I（ERMan1）和 EDEM (內質網 降解增強子 α-甘露糖苷酶樣蛋白) 被招募來從一個N-Glycan上裂解出兩個甘露糖殘基，因此聚糖變得無法被LMAN1識別，從而阻止糖蛋白的后續(xù)轉運。所生產的Man7GlcNAc2結構中暴露的α（1,6）連接的甘露糖被一個OS-9/XTP3-B凝集素復合物識別，隨后通過泛素化將其標記為蛋白酶體降解。

N-Glycan在高爾基體中處理   

N-Glycan在高爾基中的進一步處理  

進入順面膜囊的正確折疊的糖蛋白通常攜帶有8個甘露糖殘基的N-Glycan（Man8GlcNAc2）。雖然有些N-Glycan可能未經修飾就離開高爾基體，但它們在人類中的比例通常很低。部分原因是高爾基體中存在一種質量控制機制。高爾基體膜上有一種甘露糖結合凝集素VIP36（Vesicular integral-membrane protein 36），它可以將高甘露糖類型的N-聚糖回收到內質網，VIP36還與位于內質網的伴侶蛋白相互作用，所以，VIP36可以阻止不適當的糖基化糖蛋白分泌到后高爾基體。另一個防止高甘露糖型N-糖蛋白通過高爾基體的機制是在攜帶單葡萄糖（Glc1Man9GlcNAc2）的糖蛋白到達高爾基體時。糖的部分被高爾基體內切α-甘露糖苷酶在Glcα1-3Manα1-2-Manα1-2支鏈的兩個Man殘基之間進行內部裂解，從而產生Man8GlcNAc2異構體，與內質網甘露糖苷酶I在內質網產生的異構體不同。

正常情況下，絕大多數N-糖在高爾基體中被一組不同的糖苷酶和一系列糖基轉移酶（Mannosyl-glycoprotein-N-acetylglucosaminyltransferase1-5，MGAT1-5）加工成復雜和/或混合型N-糖。處理過程涉及MGAT同聚體和異聚體之間復雜的相互作用，甘露糖苷酶II（ManII）充當中心樞紐。因此，在到達高爾基體后，內質網衍生的MGAT同聚體不僅與其他MGATs，而且與相關的UDP-N-乙酰葡萄糖胺轉運體形成異聚體復合物。因此，它們在高爾基體膜上組織成多酶/多轉運體集合體。它們的相互作用可能涉及不同的或動態(tài)的復合體，以促進順面膜囊和中間膜囊中N-Glycan的有效處理和分岔。

圖3：真核生物的細胞表面存在的主要N-Glycan類型。高甘露糖型N-聚糖的特點是在高爾基體中沒有經過任何加工?；旌闲蚇糖通常只有一個分支在高爾基體中被處理過。復合型N-聚糖則有兩到五個分支，在中間膜囊和反面膜囊中形成和終止。

加工開始于順面膜囊，高爾基體甘露糖苷酶IA-C負責去除三個甘露糖殘基，產生Man5GlcNAc2結構。然后， MGAT1使用核苷酸激活的N-乙酰葡糖胺作為供體底物添加第一個GlcNAc。一旦這個GlcNAc被添加，另外兩個甘露糖殘基被高爾基α-甘露糖苷酶II去除。這為MGAT2創(chuàng)造了一個支架，使其在暴露的甘露糖殘基上添加第二個GlcNAc，產生了所有復合型N-聚糖的前體。然后MGAT4和MGAT5可以分別啟動第三和第四個GlcNAc分支的合成。另外，MGAT3可以在三甘露糖基核心結構上增加一個GlcNAc（圖3中間）。如果在MGAT4和MGAT5添加它們的GlcNAc之前添加這個GlcNAc，MGAT4和MGAT5的第三和第四GlcNAc分支的合成就會停止。這個GlcNAc也不能與任何其他糖殘基進一步拉長。它的加入也大大改變了N-Glycan的構象，并抑制了末端糖殘基的加入，如唾液酸和巖藻糖。此類GlcNAc的出現也可以抑制α-甘露糖苷酶II。然而，并非所有的hybrid型N-Glycan都包含在三甘露糖核心上一分為二的GlcNAc。因此，第一條GlcNAc快速伸長分支的延伸也可能抑制α-甘露糖苷酶對兩個末端甘露糖的必要清除，從而抑制其他GlcNAc分支的建立。

通常情況下，  GlcNAc分支通過添加半乳糖、N乙酰葡萄糖胺和唾液酸進一步拉長  。半乳糖幾乎總是以β(1,4)-連接的方式被添加到GlcNAc中。這種結構被稱為N乙酰半乳糖胺  （LacNAc）  ，可以在一個分支中重復數次，形成多LacNAc結構。聚LacNAc結構又可以作為底物，使更多的分支成為觸角。這是由一組被稱為GCNT2s A-C的特殊酶完成的，通過向內部半乳糖殘基添加額外的帶有β（1,6）-連接的GlcNAc殘基。這些GlcNAc殘基也可以隨后被β（1,4）-半乳糖基轉移酶拉長，形成額外的LacNAc結構。這種支化的N-聚糖被稱為I-支化聚糖。它們最常出現在成人紅細胞、粘膜上皮、眼睛和嗅球的細胞中。 N-Glycan支鏈末端經常被各種唾液酸轉移酶蓋住，除了聚唾液酸化外阻止了分支的進一步延伸。聚唾液酸化N-聚糖通常在神經系統(tǒng)的神經細胞粘附分子  （NCAMs）  中檢測到。巖藻糖是另一個不能進一步拉長的殘基。它可以被特定的高爾基體巖藻糖轉移酶添加到天冬酰胺連接的GlcNAc上，以產生 "核心巖藻糖 "的N-Glycan，或者添加到分叉的GlcNAc殘基上。 

IgG的N-Glycan  

N-糖基化是所有免疫球蛋白的一個重要翻譯后修飾，有助于影響其結合特性和效應功能。雖然它們的合成可能與其他N-Glycan沒有任何區(qū)別，但有一些特殊的問題值得討論。IgG的N-Glycan通常存在于Fc區(qū)，但有一小部分（15-25%）的血清IgG在其可變區(qū)中可能含有N-Glycan。這些所謂的 "Fab糖"與Fc區(qū)的N-Glycan不同，具有較高比例的末端半乳糖化和唾液酸化以及在三甘露糖核心上將天線一分為二的一個GlcNAc，同時保有核心巖藻糖的比例較低。然而，尚不清楚為什么IgG N-聚糖中的觸角數量似乎只限于兩個觸角（或者如果將雙等分甘露糖天線的GlcNAc也視為分支，則為三個）。一種可能的解釋是，產生抗體的漿細胞不表達進一步分支所需的MGAT4或MGAT5酶。另一種解釋是，添加雙等分甘露糖的GlcNAc（或其他一些調節(jié)系統(tǒng)）將阻止IgG N-Glycan的進一步分岔。這種系統(tǒng)的存在是合乎邏輯的，因為額外的分支帶來的N-Glycan "體積 "的增加可能會干擾內質網中Fc區(qū)域的折疊和配對，從而改變已知對其與Fc受體結合和抗體效應功能很重要的構象。同樣，目前還不清楚為什么Fab N-Glycan比Fc N-Glycan顯示出更高比例的更成熟（更完全加工）的N-Glycan。這種差異是否是由于Fab糖比Fc糖更容易獲得，還是其他原因，如細胞外糖基化的增加或糖苷酶的降解減少，還有待探討。

總結  

N-糖基化是蛋白質的一種頻繁而復雜的修飾，對單細胞和多細胞生命都是必不可少的。它調節(jié)著大量的細胞功能，從蛋白質的折疊、販運、分類、定位、半衰期和信號傳遞到增殖、遷移和與周圍環(huán)境的粘附。對于治療性抗體來說，不同的糖基化修飾對于抗體功能的影響也是巨大的，例如敲除核心巖藻糖可以極大的提高ADCC活性，高半乳糖則會提高抗體與FcγR的結合能力，詳細內容我們會后續(xù)專門梳理。

參考文獻：Antibody Glycosylation（doi：10.1007/978-3-030-76912-3）

Hetero-oligomeric interactions between early glycosyltransferases of the dolichol cycle（doi:10.1093/glycob/cwp001）

作者：制藥農民工

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來源：醫(yī)藥速覽 2022-08-26

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網址: N糖的生物合成，從內質網到高爾基體 http://www.u1s5d6.cn/newsview439780.html