N-糖基化（N-linked glycosylation）是一種重要的蛋白質(zhì)修飾。影響一些如蛋白質(zhì)的折疊、半衰期、轉(zhuǎn)運(yùn)等基本的細(xì)胞過(guò)程和免疫原性，以及其在細(xì)胞間以及細(xì)胞外基質(zhì)成分或病原體之間的相互作用。在真核細(xì)胞中，N-Glycan是在兩個(gè)專門(mén)的細(xì)胞器，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和高爾基體中合成的。這兩個(gè)細(xì)胞器共里有幾十種功能不同的糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶，它們依次對(duì)不斷增長(zhǎng)的寡糖進(jìn)行修飾。然而，考慮到相關(guān)的酶促反應(yīng)沒(méi)有任何模板并且相互競(jìng)爭(zhēng)相同的底物，這種酶促反應(yīng)的順序如何安排以保證N-Glycan的正常合成就不是非常清楚了。本文將簡(jiǎn)單的梳理一下N-Glycan從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的合成過(guò)程以及相關(guān)問(wèn)題。

圖1：N-糖基化在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體中的合成過(guò)程圖示 

N-Glycan 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生物合成過(guò)程   

N-Glycan的合成基石  

N-Glycan在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的早期合成中都是保守的，其異質(zhì)性是出現(xiàn)在其后續(xù)的加工過(guò)程中。所有的N-Glycan都有一個(gè)共同的核心結(jié)構(gòu)(asn-GlcNAc2Man3-)，通過(guò)在核心結(jié)構(gòu)上添加一些其他末端的糖殘基進(jìn)一步延長(zhǎng)。根據(jù)所使用的糖殘基和連接類型，這些添加物可以顯著影響N-Glycan的結(jié)構(gòu)。作為添加物使用的主要是N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）、甘露糖（Mannose）、半乳糖（Galactose）、巖藻糖（Fucose）和唾液酸（N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac））。在某些情況下，N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）殘基可以用來(lái)構(gòu)建N-Glycan。葡萄糖（Glucose）殘基在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的合成過(guò)程中也被暫時(shí)納入生長(zhǎng)中的N-Glycan中，但是葡萄糖會(huì)在N-Glycan后續(xù)的合成過(guò)程中被移除。

前體合成  

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔存在一系列Alg（Asparagine-linked glycosyltransferase）家族的糖基化轉(zhuǎn)移酶，該系列的酶負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)將脂質(zhì)連接的寡糖（lipid-linked oligosaccharide，LLO）前體（Glc3Man9-GlcNAc2）裝配到膜包埋的磷酸多萜醇（Dol-P）載體上。它們利用核苷酸糖（UDP-GlcNAc、GDP-Man、Dol-P-Man和Dol-P-Glc）作為供體底物，逐步組裝LLO。LLO的組裝開(kāi)始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的細(xì)胞質(zhì)面，第一個(gè)GlcNAc是由糖基化轉(zhuǎn)移酶Alg7p添加的，它使用核苷酸糖UDP-GlcNAc在磷酸多萜醇（Dol-P）載體上生成GlcNAc-PP-dol，隨后，Alg13p/Alg14p轉(zhuǎn)移酶使用UDP-GlcNAc中加入第二個(gè)GlcNAc，產(chǎn)生成GlcNAc2-PP-dol。接下來(lái)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)甘露糖轉(zhuǎn)移酶（Alg1、Alg2和Alg11）也相互形成復(fù)合物，從核苷酸糖GDP-Man供體中加入五個(gè)甘露糖殘基，形成Man5GlcNAc2-PP-Dol中間物。因此，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的細(xì)胞質(zhì)面上的LLO前體合成涉及三個(gè)主要的酶復(fù)合物，一個(gè)是由Alg7/Alg13/Alg14形成，另外兩個(gè)由Alg1/Alg2和Alg1/Alg11形成。這種安排可能確保每個(gè)甘露糖殘基將正確地與前體連接。

隨后將Man5GlcNAc2-PP-Dol中間物轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，這一過(guò)程被目前認(rèn)為是由一種被稱為Rft1的蛋白介導(dǎo)的。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，甘露糖基轉(zhuǎn)移酶（Alg3/Alg9/Alg12）和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（Alg6/Alg8/Alg10）分別通過(guò)附加四個(gè)甘露糖殘基和三個(gè)葡萄糖殘基來(lái)進(jìn)一步拉長(zhǎng)LLO前體。這就完成了前體的合成，產(chǎn)生了Glc3Man9GlcNAc2-PP-Dol結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)以后將被用作供體底物，用于將一個(gè)N-glycan整體轉(zhuǎn)移到一個(gè)合適的多肽鏈。值得注意的是，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞質(zhì)面的初始催化步驟不同，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)完成LLO前體的合成并不使用核苷酸糖作為供體。相反，在這種情況下，膜包埋的Dol-P-Man和Dol-P-Glc被用作糖供體。它們的合成也發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的細(xì)胞質(zhì)面（分別來(lái)自GDP-Man和UDP-Glc），然后被轉(zhuǎn)運(yùn)到腔內(nèi)側(cè)。

最常見(jiàn)的糖基化位點(diǎn)序列為Asn-X-Ser/Thr（X不為脯氨酸），這兩者中，Asn-X-Thr序列比Asn-X-Ser更受歡迎，主要是因?yàn)樘K氨酸的側(cè)鏈甲基與寡糖轉(zhuǎn)移酶（Oligosaccharyltransferase complex，OST）結(jié)合域中的天冬酰胺-賴氨酸結(jié)構(gòu)之間的相互作用增加了復(fù)合物的穩(wěn)定性。氨基酸X和側(cè)翼氨基酸的性質(zhì)也有助于特定序列的糖基化。此外，序列在多肽中的位置、蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等都會(huì)影響糖基化出現(xiàn)的可能性。因此，單憑序列的存在不能作為N-糖基化的充分預(yù)測(cè)因素。事實(shí)上，在分泌的糖蛋白中，大約有三分之一的已確定的序列仍然是非糖基化的。

葡萄糖殘基的移除與蛋白質(zhì)折疊的質(zhì)量控制  

一旦多肽被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)并開(kāi)始折疊，新連接的Glc3Man9GlcNAc2結(jié)構(gòu)將被進(jìn)一步修改。第一步是由一個(gè)跨膜酶α-葡萄糖苷酶I去除末端的葡萄糖殘基，然后由可溶性的α-葡萄糖苷酶 II快速去除第二個(gè)葡萄糖殘基，所得到的單葡萄糖化的寡糖是伴侶蛋白鈣連蛋白calnexin和鈣網(wǎng)蛋白calreticulin的配體，這些伴侶蛋白也很容易與一種二硫鍵異構(gòu)酶ERp57結(jié)合，ERp57催化鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵的形成，從而幫助新生糖蛋白的正確折疊。隨后最后一個(gè)葡萄糖殘基會(huì)在蛋白折疊過(guò)程中被α-葡萄糖苷酶II除去。暴露出疏水區(qū)塊的未折疊或者錯(cuò)誤折疊的蛋白會(huì)被UGGT（UDP-glucose-glycoprotein glucosyl-transferase）所識(shí)別，此種酶可以再一次將蛋白的甘露糖殘基重新添加上葡萄糖從而重新創(chuàng)建一個(gè)Glc1Man9GlcNAc2的寡糖結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)再次被伴侶蛋白-二硫鍵異構(gòu)酶復(fù)合物所作用，進(jìn)而重新進(jìn)行蛋白折疊。這種去除和重新添加葡萄糖殘基的過(guò)程可以持續(xù)幾個(gè)周期，直到蛋白質(zhì)被正確折疊。

隨后甘露糖被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)甘露糖苷酶I（ERMan1）修剪，從N-連接寡糖的中間分支上去除末端的甘露糖殘基。然后生成的Man8GlcNAc2結(jié)構(gòu)可以被LMAN1（Lectin mannose-binding 1）識(shí)別，這種甘露糖特異性凝集素可以將糖基化蛋白打包利索裝進(jìn)包被蛋白復(fù)合物II（Coat Protein complex II，COPII）從而通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)—高爾基體中間體(ERGIC)運(yùn)送到高爾基體。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中各種條件的變化，比如鈣平衡的改變、氧化還原狀態(tài)和葡萄糖剝奪或突變會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊或者未組裝的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累并對(duì)細(xì)胞活力造成損害。細(xì)胞本身可以通過(guò)啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制翻譯速率并增加伴侶蛋白的表達(dá)等來(lái)減少損害。如果這些措施還是失敗的話，錯(cuò)誤折疊的蛋白會(huì)被引導(dǎo)通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(ER-associated degradation，ERAD)的途徑進(jìn)行清除。此過(guò)程開(kāi)始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)甘露糖苷酶I（ERMan1）和 EDEM (內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 降解增強(qiáng)子 α-甘露糖苷酶樣蛋白) 被招募來(lái)從一個(gè)N-Glycan上裂解出兩個(gè)甘露糖殘基，因此聚糖變得無(wú)法被LMAN1識(shí)別，從而阻止糖蛋白的后續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)。所生產(chǎn)的Man7GlcNAc2結(jié)構(gòu)中暴露的α（1,6）連接的甘露糖被一個(gè)OS-9/XTP3-B凝集素復(fù)合物識(shí)別，隨后通過(guò)泛素化將其標(biāo)記為蛋白酶體降解。

N-Glycan在高爾基體中處理   

N-Glycan在高爾基中的進(jìn)一步處理  

進(jìn)入順面膜囊的正確折疊的糖蛋白通常攜帶有8個(gè)甘露糖殘基的N-Glycan（Man8GlcNAc2）。雖然有些N-Glycan可能未經(jīng)修飾就離開(kāi)高爾基體，但它們?cè)谌祟愔械谋壤ǔ：艿?。部分原因是高爾基體中存在一種質(zhì)量控制機(jī)制。高爾基體膜上有一種甘露糖結(jié)合凝集素VIP36（Vesicular integral-membrane protein 36），它可以將高甘露糖類型的N-聚糖回收到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，VIP36還與位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的伴侶蛋白相互作用，所以，VIP36可以阻止不適當(dāng)?shù)奶腔堑鞍追置诘胶蟾郀柣w。另一個(gè)防止高甘露糖型N-糖蛋白通過(guò)高爾基體的機(jī)制是在攜帶單葡萄糖（Glc1Man9GlcNAc2）的糖蛋白到達(dá)高爾基體時(shí)。糖的部分被高爾基體內(nèi)切α-甘露糖苷酶在Glcα1-3Manα1-2-Manα1-2支鏈的兩個(gè)Man殘基之間進(jìn)行內(nèi)部裂解，從而產(chǎn)生Man8GlcNAc2異構(gòu)體，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)甘露糖苷酶I在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生的異構(gòu)體不同。

正常情況下，絕大多數(shù)N-糖在高爾基體中被一組不同的糖苷酶和一系列糖基轉(zhuǎn)移酶（Mannosyl-glycoprotein-N-acetylglucosaminyltransferase1-5，MGAT1-5）加工成復(fù)雜和/或混合型N-糖。處理過(guò)程涉及MGAT同聚體和異聚體之間復(fù)雜的相互作用，甘露糖苷酶II（ManII）充當(dāng)中心樞紐。因此，在到達(dá)高爾基體后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生的MGAT同聚體不僅與其他MGATs，而且與相關(guān)的UDP-N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)運(yùn)體形成異聚體復(fù)合物。因此，它們?cè)诟郀柣w膜上組織成多酶/多轉(zhuǎn)運(yùn)體集合體。它們的相互作用可能涉及不同的或動(dòng)態(tài)的復(fù)合體，以促進(jìn)順面膜囊和中間膜囊中N-Glycan的有效處理和分岔。

圖3：真核生物的細(xì)胞表面存在的主要N-Glycan類型。高甘露糖型N-聚糖的特點(diǎn)是在高爾基體中沒(méi)有經(jīng)過(guò)任何加工?；旌闲蚇糖通常只有一個(gè)分支在高爾基體中被處理過(guò)。復(fù)合型N-聚糖則有兩到五個(gè)分支，在中間膜囊和反面膜囊中形成和終止。

加工開(kāi)始于順面膜囊，高爾基體甘露糖苷酶IA-C負(fù)責(zé)去除三個(gè)甘露糖殘基，產(chǎn)生Man5GlcNAc2結(jié)構(gòu)。然后， MGAT1使用核苷酸激活的N-乙酰葡糖胺作為供體底物添加第一個(gè)GlcNAc。一旦這個(gè)GlcNAc被添加，另外兩個(gè)甘露糖殘基被高爾基α-甘露糖苷酶II去除。這為MGAT2創(chuàng)造了一個(gè)支架，使其在暴露的甘露糖殘基上添加第二個(gè)GlcNAc，產(chǎn)生了所有復(fù)合型N-聚糖的前體。然后MGAT4和MGAT5可以分別啟動(dòng)第三和第四個(gè)GlcNAc分支的合成。另外，MGAT3可以在三甘露糖基核心結(jié)構(gòu)上增加一個(gè)GlcNAc（圖3中間）。如果在MGAT4和MGAT5添加它們的GlcNAc之前添加這個(gè)GlcNAc，MGAT4和MGAT5的第三和第四GlcNAc分支的合成就會(huì)停止。這個(gè)GlcNAc也不能與任何其他糖殘基進(jìn)一步拉長(zhǎng)。它的加入也大大改變了N-Glycan的構(gòu)象，并抑制了末端糖殘基的加入，如唾液酸和巖藻糖。此類GlcNAc的出現(xiàn)也可以抑制α-甘露糖苷酶II。然而，并非所有的hybrid型N-Glycan都包含在三甘露糖核心上一分為二的GlcNAc。因此，第一條GlcNAc快速伸長(zhǎng)分支的延伸也可能抑制α-甘露糖苷酶對(duì)兩個(gè)末端甘露糖的必要清除，從而抑制其他GlcNAc分支的建立。

通常情況下，  GlcNAc分支通過(guò)添加半乳糖、N乙酰葡萄糖胺和唾液酸進(jìn)一步拉長(zhǎng)  。半乳糖幾乎總是以β(1,4)-連接的方式被添加到GlcNAc中。這種結(jié)構(gòu)被稱為N乙酰半乳糖胺  （LacNAc）  ，可以在一個(gè)分支中重復(fù)數(shù)次，形成多LacNAc結(jié)構(gòu)。聚LacNAc結(jié)構(gòu)又可以作為底物，使更多的分支成為觸角。這是由一組被稱為GCNT2s A-C的特殊酶完成的，通過(guò)向內(nèi)部半乳糖殘基添加額外的帶有β（1,6）-連接的GlcNAc殘基。這些GlcNAc殘基也可以隨后被β（1,4）-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶拉長(zhǎng)，形成額外的LacNAc結(jié)構(gòu)。這種支化的N-聚糖被稱為I-支化聚糖。它們最常出現(xiàn)在成人紅細(xì)胞、粘膜上皮、眼睛和嗅球的細(xì)胞中。 N-Glycan支鏈末端經(jīng)常被各種唾液酸轉(zhuǎn)移酶蓋住，除了聚唾液酸化外阻止了分支的進(jìn)一步延伸。聚唾液酸化N-聚糖通常在神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞粘附分子  （NCAMs）  中檢測(cè)到。巖藻糖是另一個(gè)不能進(jìn)一步拉長(zhǎng)的殘基。它可以被特定的高爾基體巖藻糖轉(zhuǎn)移酶添加到天冬酰胺連接的GlcNAc上，以產(chǎn)生 "核心巖藻糖 "的N-Glycan，或者添加到分叉的GlcNAc殘基上。 

IgG的N-Glycan  

N-糖基化是所有免疫球蛋白的一個(gè)重要翻譯后修飾，有助于影響其結(jié)合特性和效應(yīng)功能。雖然它們的合成可能與其他N-Glycan沒(méi)有任何區(qū)別，但有一些特殊的問(wèn)題值得討論。IgG的N-Glycan通常存在于Fc區(qū)，但有一小部分（15-25%）的血清IgG在其可變區(qū)中可能含有N-Glycan。這些所謂的 "Fab糖"與Fc區(qū)的N-Glycan不同，具有較高比例的末端半乳糖化和唾液酸化以及在三甘露糖核心上將天線一分為二的一個(gè)GlcNAc，同時(shí)保有核心巖藻糖的比例較低。然而，尚不清楚為什么IgG N-聚糖中的觸角數(shù)量似乎只限于兩個(gè)觸角（或者如果將雙等分甘露糖天線的GlcNAc也視為分支，則為三個(gè)）。一種可能的解釋是，產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞不表達(dá)進(jìn)一步分支所需的MGAT4或MGAT5酶。另一種解釋是，添加雙等分甘露糖的GlcNAc（或其他一些調(diào)節(jié)系統(tǒng)）將阻止IgG N-Glycan的進(jìn)一步分岔。這種系統(tǒng)的存在是合乎邏輯的，因?yàn)轭~外的分支帶來(lái)的N-Glycan "體積 "的增加可能會(huì)干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Fc區(qū)域的折疊和配對(duì)，從而改變已知對(duì)其與Fc受體結(jié)合和抗體效應(yīng)功能很重要的構(gòu)象。同樣，目前還不清楚為什么Fab N-Glycan比Fc N-Glycan顯示出更高比例的更成熟（更完全加工）的N-Glycan。這種差異是否是由于Fab糖比Fc糖更容易獲得，還是其他原因，如細(xì)胞外糖基化的增加或糖苷酶的降解減少，還有待探討。

總結(jié)  

N-糖基化是蛋白質(zhì)的一種頻繁而復(fù)雜的修飾，對(duì)單細(xì)胞和多細(xì)胞生命都是必不可少的。它調(diào)節(jié)著大量的細(xì)胞功能，從蛋白質(zhì)的折疊、販運(yùn)、分類、定位、半衰期和信號(hào)傳遞到增殖、遷移和與周?chē)h(huán)境的粘附。對(duì)于治療性抗體來(lái)說(shuō)，不同的糖基化修飾對(duì)于抗體功能的影響也是巨大的，例如敲除核心巖藻糖可以極大的提高ADCC活性，高半乳糖則會(huì)提高抗體與FcγR的結(jié)合能力，詳細(xì)內(nèi)容我們會(huì)后續(xù)專門(mén)梳理。

參考文獻(xiàn)：Antibody Glycosylation（doi：10.1007/978-3-030-76912-3）

Hetero-oligomeric interactions between early glycosyltransferases of the dolichol cycle（doi:10.1093/glycob/cwp001）

作者：制藥農(nóng)民工

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