摘 要 大麥若葉(barley leaf,BL)對腸道健康具有潛在益處,但對結(jié)直腸癌的預(yù)防作用及機(jī)制尚未明確。為探究BL對結(jié)直腸癌的影響并闡述作用機(jī)制,研究分別建立了氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉(azoxymethane/dextran sodium sulfate,AOM/DSS)誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌小鼠模型和CT26移植瘤小鼠模型,研究發(fā)現(xiàn)BL明顯減少了AOM/DSS誘導(dǎo)模型小鼠腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量但并不影響移植瘤小鼠腫瘤的生長。同時,通過蛋白印跡法,發(fā)現(xiàn)BL降低了結(jié)腸組織中重要結(jié)直腸癌致癌基因環(huán)氧合酶-2與表皮生長因子受體的蛋白表達(dá)水平;通過16S測序分析以及GC-MS分析,發(fā)現(xiàn)5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BL干預(yù)能夠改善腸道菌群失調(diào),使乙酸含量提升了2.53倍、丙酸3.63倍、丁酸3.81倍;通過細(xì)胞實驗,發(fā)現(xiàn)乙酸鈉、丙酸鈉及丁酸鈉可以抑制由表皮生長因子介導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程相關(guān)信號通路中p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)水平,從而明顯抑制小鼠表皮細(xì)胞JB 6P+的惡性轉(zhuǎn)化。綜上所述,大麥若葉通過改善小鼠腸道菌群失調(diào),提高部分短鏈脂肪酸的含量,下調(diào)腫瘤相關(guān)信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá),抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,進(jìn)而緩解結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界第三大癌癥,其發(fā)病率和死亡率僅次于肺癌與乳腺癌[1],流行病學(xué)統(tǒng)計顯示截止2022年1月,美國有超過140萬患者被診斷為CRC,僅在2022年就有151 030例CRC新增病例,并且自21世紀(jì)初CRC的發(fā)展趨向年輕化[2-3]。CRC成因復(fù)雜,大量研究表明腸炎、紅肉及低膳食纖維的攝入、腸道菌群等對CRC的發(fā)病有一定影響[4-5]。臨床上,對CRC患者主要采取手術(shù)切除、放療及化療手段,但其產(chǎn)生的副作用(骨髓抑制、惡病質(zhì)、腹瀉等)會降低療效,也不利于預(yù)后恢復(fù)[6-7]。因此,尋找更好的策略以降低CRC發(fā)病風(fēng)險是很有必要的。

腸道菌群在CRC的發(fā)展過程中起著重要的作用[8]。當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生改變時(如:飲食習(xí)慣、藥物影響等[9]),腸道菌群穩(wěn)態(tài)可能會被打破,引發(fā)相關(guān)腸道疾病(潰瘍性腸炎、腸易激綜合征等),進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)腸癌的發(fā)生。DENG等[10]報道,黃連素通過改善小鼠腸道菌群組成、抑制炎癥性癌轉(zhuǎn)化信號從而減緩CRC的發(fā)展。MALLA[11]也指出菌群失調(diào)會促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,腸道菌群通過調(diào)節(jié)其代謝產(chǎn)物影響CRC的發(fā)展。

大麥若葉(barley leaf,BL)是大麥生長到20～30 cm時的嫩葉,屬于麥屬禾本科,富含膳食纖維、天然維生素、活性酵素及多種活性成分,具有抗氧化、降血脂、降血壓等功能[12]。BL的天然營養(yǎng)成分對腸道健康有著潛在的促進(jìn)作用。LI等[13]報道,BL可以促進(jìn)腸道蠕動、增強(qiáng)腸屏障功能從而減輕潰瘍性結(jié)腸炎和菌群失調(diào)。但BL對CRC發(fā)展的影響還有待進(jìn)一步研究。

本研究通過建立CT26移植瘤小鼠模型、氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉(azoxymethane/dextran sodium sulfate,AOM/DSS)誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌小鼠模型及細(xì)胞模型來探究BL對CRC發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物

SPF級Balb/c雄性小鼠(5周齡,體重18～20 g)、SPF級C57BL/6 N雄性小鼠[5周齡,體重(20±1) g],北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 實驗細(xì)胞

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26、人源結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116及HT29、小鼠表皮細(xì)胞JB 6P+,美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.3 抗體

環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2,COX-2,#12282)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR,#4267)、p-AKT(Ser473,磷酸化蛋白激酶B,#4060),CST;AKT(蛋白激酶B,#A2696)、p-ERK(磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶,#AP0974)、ERK(細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶,#4782)、β-actin(肌動蛋白,#AC038),ABclonal;兔二抗(#SA00001-2)、鼠二抗(#SA00001-1),proteintech。

1.1.4 實驗試劑

氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)、噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)試劑,Sigma-Aldrich;硫酸葡聚糖鈉鹽(dextran sulfate sodium,DSS),MP Biomedicals;五氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),Solarbio;乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒,碧云天生物技術(shù)公司;表皮細(xì)胞生長因子表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)重組蛋白,ThermoFisher。

1.2 儀器與設(shè)備

Eppendorf移液槍、1510 Multiscan GO全波長酶標(biāo)儀、Forma 371型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,美國Thermo;Fluor Chem FC3凝膠成像系統(tǒng),美國Proteinsimple;石蠟包埋機(jī)、切片機(jī),德國徠卡;切片掃描儀,匈牙利3DHistech;真空凍干機(jī),美國LABCONCO;Western Blot電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、PCR儀,美國Bio-Rad;倒置顯微鏡,日本尼康;高通量組織研磨儀,新芝;UV-2000紫外分析割膠儀,上海天能;GCMS-QP2100氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、超微量分光光度計,日本島津。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物實驗

CT26移植瘤小鼠模型建立:5周齡SPF級Balb/c雄性小鼠飼養(yǎng)于江南大學(xué)實驗動物中心SPF屏障環(huán)境[SYXK(蘇)2016-0045],適應(yīng)一周后,小鼠右前肢皮下注射CT26細(xì)胞,106 cells/只。小鼠隨機(jī)分組為:空白組、模型組、BL組(5% BL)、5-Fu組、聯(lián)用組(5-Fu+5% BL),每組10只。其中,5-Fu劑量為25 mg/(kg·3 d),腹腔注射;BL以未經(jīng)過任何純化的粗粉形式,按質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%添加到標(biāo)準(zhǔn)飼料(CD)中。定期測量小鼠腫瘤體積和體重。給藥處理19 d后,根據(jù)動物福利原則處死小鼠,并收集小鼠腫瘤、肝臟、脾臟、腎臟、血清等樣本。腫瘤體積依據(jù)公式(1)計算:

腫瘤體積=0.5×長徑×短徑×短徑

(1)

AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌小鼠模型建立:5周齡SPF級C57BL/6N雄性小鼠在屏障環(huán)境適應(yīng)一周后,隨機(jī)分組:空白組、模型組(AOM/DSS)、L BL干預(yù)組(AOM/DSS+2.5% BL)、H BL干預(yù)組(AOM/DSS+5% BL)、H BL組(5% BL),每組10只。其中,模型組及干預(yù)組小鼠單次腹腔注射10 mg/kg AOM,7 d后以3% DSS的飲用水挑戰(zhàn)一周,BL以未經(jīng)過任何純化的粗粉形式,按質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%和5%添加到標(biāo)準(zhǔn)飼料(CD)中。每天觀察小鼠生活狀態(tài),定期測量小鼠體重。實驗結(jié)束后,根據(jù)動物福利原則處死小鼠,并收集結(jié)腸組織、肝臟、脾臟、腎臟、血清等樣本。

1.3.2 小鼠結(jié)腸組織蘇木精-伊紅染色實驗

AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌小鼠的結(jié)直腸組織,縱向剖開攤平,腸內(nèi)壁朝上,由肛門端向盲腸端緊密卷起,經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟、包埋和切片步驟完成標(biāo)本的制作。標(biāo)本經(jīng)過烤片、二甲苯脫蠟、復(fù)水、蘇木精-伊紅染色、脫水、透明及中性樹膠封片后,在切片掃描儀下觀察。

1.3.3 細(xì)胞毒性實驗

將JB 6P+細(xì)胞按5 000 cells/孔鋪于96孔板中,過夜后,將培養(yǎng)基更換為含不同濃度短鏈脂肪酸鈉的MEM培養(yǎng)基(1、3、10 mmol/L)。24 h后,加入20 μL MTT(5 mg/mL)孵育4 h。然后棄去液體并加入DMSO復(fù)溶,振蕩后測定490 nm處的吸光值,每組設(shè)置6個復(fù)孔。受試短鏈脂肪酸鈉為乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉。

1.3.4 細(xì)胞增殖實驗

將HCT116和HT29細(xì)胞按5 000 cells/孔鋪于96孔板中,過夜后,更換培養(yǎng)基為含不同濃度短鏈脂肪酸鈉的DMEM培養(yǎng)基(1、3、10 mmol/L)。分別于24、48、72 h,加入20 μL MTT(5 mg/mL)孵育4 h。后續(xù)操作同1.3.3節(jié)。

1.3.5 蛋白提取

JB 6P+細(xì)胞蛋白提取:將JB 6P+細(xì)胞等量接種在6 cm培養(yǎng)皿中,細(xì)胞密度達(dá)80%左右時進(jìn)行饑餓處理,24 h后,加入不同終濃度的短鏈脂肪酸鈉(1、3、10 mmol/L)預(yù)處理1.5 h,隨后加入終質(zhì)量濃度為20 ng/mL的EGF刺激15 min。刺激完成后,棄去培養(yǎng)基、PBS洗2次、加入RIPA裂解液進(jìn)行裂解、裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中,然后經(jīng)過超聲破碎、離心、轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管中。根據(jù)說明書測定蛋白濃度并統(tǒng)一定量,然后加入5×loading buffer于95 ℃下金屬浴5 min使蛋白變性,得到蛋白樣品。

小鼠結(jié)腸組織蛋白提取:稱取20 mg結(jié)腸組織,加入30倍體積的RIPA裂解液,充分研磨破碎后,后續(xù)操作同細(xì)胞樣本。

1.3.6 Western Blot分析

20 μg蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用封閉液(含5% BSA的TBST溶液)封閉1.5 h后4 ℃過夜孵育一抗,孵育完成后TBST洗滌(3次,每次5 min),然后常溫孵育二抗2 h,孵育完成后TBST洗滌(3次,每次5 min),最后加入顯影液,避光顯影20 s后,置于成像儀下觀察。

1.3.7 短鏈脂肪酸含量測定

小鼠盲腸內(nèi)容物進(jìn)行真空冷凍干燥,稱取凍干后的內(nèi)容物20～50 mg,加入500 μL飽和NaCl靜置30 mim并振蕩均勻,加入40 μL 10%(體積分?jǐn)?shù))硫酸溶液酸化后再加入1 mL乙醚并振蕩均勻,然后離心取上層乙醚相(12 000 r/min,4 ℃,15 min),加入0.25 g無水硫酸鈉并靜置15 min后以相同條件離心。將上層乙醚相轉(zhuǎn)移至氣相小瓶中,上機(jī)分析。采用GC-MS測定短鏈脂肪酸的含量,通過檢測不同濃度混合短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品,以峰面積為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)而計算出樣品中短鏈脂肪酸濃度。

1.3.8 小鼠糞便腸道菌群的測定

依據(jù)MP糞便DNA提取試劑盒說明書提取小鼠糞便中的DNA,DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增V3～V4區(qū),然后通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化,在500 bp處切取目標(biāo)條帶并使用膠回收試劑盒回收DNA。依據(jù)Qubit Assay Tubes試劑盒說明書建立文庫,然后在通過Miseq Reagent Kit v3上機(jī)測序,得到文庫數(shù)據(jù)。測得的腸道菌群下機(jī)數(shù)據(jù)用微生物生態(tài)定量研究平臺(QIIME2)進(jìn)行測序分析。

1.3.9 上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化實驗

配制終濃度為10%胎牛血清、0.5%瓊脂和1×BME的底層培養(yǎng)基,以3 mL/孔鋪于6孔板,凝固后備用;按JB 6P+單細(xì)胞懸液和底層培養(yǎng)基體積比為1∶2配制上層培養(yǎng)體系,以1 mL/孔(含1×104 cells)鋪上層,完全凝固后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d,并拍照統(tǒng)計細(xì)胞克隆數(shù)。實驗組分為:空白組、模型組(EGF,20 ng/mL)及不同濃度短鏈脂肪酸鈉干預(yù)組(1、3、10 mmol/L),每組3個平行。受試短鏈脂肪酸鈉為乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉。

1.4 統(tǒng)計分析

用Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計,認(rèn)為P<0.05的分析結(jié)果具有顯著性差異,實驗結(jié)果中*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.000 1,ns表示無顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥若葉對移植瘤小鼠的影響

本研究建立了CT26移植瘤小鼠模型,用5-Fu及BL干預(yù)以探究BL對腫瘤生長及化療藥物5-Fu抗腫瘤活性的影響。圖1-a為動物實驗示意圖,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),BL干預(yù)不影響小鼠體重變化(圖1-b),不影響腫瘤生長,也不影響5-Fu的抗腫瘤活性(圖1-d與圖1-e);值得注意的是,膳食補(bǔ)充BL可以提高小鼠的存活率(圖1-c、腫瘤體積超過1 000 mm3視為小鼠死亡),減緩移植瘤小鼠及5-Fu造成的結(jié)直腸縮短(圖1-f),緩解癌性脾腫大(圖1-g)。

a-動物實驗示意圖;b-小鼠體重變化;c-小鼠生存曲線;d-小鼠腫瘤體積變化;e-瘤體比指數(shù);f-小鼠結(jié)腸長度;g-小鼠脾臟指數(shù)

圖1 大麥若葉對CT26移植瘤的影響

Fig.1 Effects of BL on CT26 transplanted tumor

2.2 大麥若葉減緩AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸腫瘤發(fā)生

BL對移植瘤小鼠的腫瘤生長無影響,因此本研究又建立了AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌小鼠模型以探究BL對原發(fā)性結(jié)直腸癌是否具有預(yù)防作用。圖2-a為動物實驗示意圖;圖2-b為小鼠體重變化,經(jīng)過9周的膳食干預(yù),空白組平均體重為27.12 g,模型組為24.44 g,模型+L BL組為26.01 g,模型+H BL組為26.67 g,H BL組為27.23 g,結(jié)果說明BL干預(yù)顯著減輕了AOM/DSS誘導(dǎo)導(dǎo)致的小鼠體重下降;圖2-c和圖2-d顯示,BL干預(yù)能顯著減輕AOM/DSS誘導(dǎo)導(dǎo)致的小鼠結(jié)直腸縮短;圖2-e～圖2-g反映了小鼠結(jié)直腸腫瘤生長情況,結(jié)果表明5% BL干預(yù)使腫瘤數(shù)量由12.10個降低到6.80個、直徑大于2 mm的腫瘤數(shù)量占比由61.55%降低到36.98%,BL干預(yù)顯著減輕了結(jié)直腸腫瘤負(fù)荷;進(jìn)一步對小鼠結(jié)直腸組織進(jìn)行病理學(xué)分析,如圖3所示,模型組小鼠結(jié)直腸厚度明顯增加、隱窩結(jié)構(gòu)破壞、有較大的腺瘤產(chǎn)生且病灶處的細(xì)胞形態(tài)明顯改變,而BL干預(yù)后顯著減輕了這些變化。以上實驗結(jié)果說明,膳食攝入BL能減緩結(jié)直腸癌的發(fā)展。

a-動物實驗示意圖;b-小鼠體重變化;c-小鼠結(jié)腸組織;d-小鼠結(jié)腸長度;e-小鼠單位長度結(jié)腸質(zhì)量;f-小鼠結(jié)腸組織腫瘤數(shù)量;g-小鼠結(jié)腸組織不同體積的腫瘤占比

圖2 大麥若葉對AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸腫瘤影響

Fig.2 Effects of BL on tumorigenesis induced by AOM/DSS

圖3 小鼠結(jié)直腸組織病理切片分析

Fig.3 Histopathological analysis of mouse colorectal tissue

2.3 大麥若葉降低腫瘤發(fā)生相關(guān)蛋白表達(dá)水平

COX-2和EGFR是重要的CRC致癌基因,在CRC發(fā)展過程中高表達(dá)。本研究通過Western Blot檢測AOM/DSS誘導(dǎo)的原發(fā)性結(jié)直腸癌小鼠結(jié)直腸組織中COX-2與EGFR的蛋白表達(dá)水平,如圖4所示,模型組的COX-2和EGFR表達(dá)水平顯著增高,而BL干預(yù)顯著降低其表達(dá)水平,這進(jìn)一步說明膳食攝入BL可以減緩結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。

圖4 小鼠結(jié)腸組織Western Blot分析

Fig.4 Western Blot analysis of mouse colorectal tissue

2.4 大麥若葉減輕腸道菌群失調(diào)

腸道微生物在CRC發(fā)展過程中起著重要作用。為了研究CRC發(fā)展期間BL對腸道菌群的影響,本研究對小鼠糞便中的腸道菌群進(jìn)行了分析。圖5-a為小鼠腸道菌群α多樣性分析,結(jié)果顯示AOM/DSS誘導(dǎo)降低了腸道菌群的均勻度和豐富度,而BL干預(yù)顯著改善了這一變化;圖5-b為β多樣性分析(基于Bray-curits距離的PCoA分析),結(jié)果顯示BL干預(yù)改變了結(jié)直腸腫瘤小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu);圖5-c和圖5-d為門水平和屬水平的腸道菌群組成,各組小鼠腸道菌群中門水平優(yōu)勢菌群主要由擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)組成,其次為變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomiccrobia)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、放線菌門(Actinobacteria)等,經(jīng)BL干預(yù),擬桿菌門豐度升高、變形菌門豐度降低,屬水平上主要由乳桿菌屬(Lactobacillus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、阿克曼菌屬(Akkermansia)、Muribaculaceae、另枝菌屬(Alistipes)、瘤胃球菌科UCG014屬(Ruminococcaceae UCG-014)、毛螺菌科NK4A136屬(Lachnospiraceae NK4A136 group)等組成,BL干預(yù)提高了擬桿菌屬、另枝菌屬、瘤胃球菌科UCG014屬、毛螺菌科的豐度;圖5-e為LEfSe分析(α=0.05,LDA=2.0),結(jié)果顯示BL干預(yù)組的差異菌群數(shù)顯著多于模型組,高劑量BL干預(yù)組顯著富集了腸桿菌屬(Enterorhabdus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、Butyricimonas、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)等,高劑量BL組主要富集了擬普雷沃氏菌屬(Alloprevotella)、普雷沃氏菌屬(Prevotellaceae)、另枝菌屬(Alistipes)、毛螺菌科UCG006屬(Lachnospiraceae UCG-006)等,這些菌群在腸道內(nèi)可以促進(jìn)膳食纖維的分解產(chǎn)生短鏈脂肪酸。

a-小鼠腸道菌群α多樣性分析;b-小鼠腸道菌群β多樣性分析;c-門水平小鼠腸道菌群組成;d-屬水平小鼠腸道菌群組成;e-小鼠腸道菌群LEfSe分析

圖5 大麥若葉對腸道菌群的影響

Fig.5 Effects of BL on gut microbiota

2.5 大麥若葉攝入增加短鏈脂肪酸的含量

膳食攝入BL改善了菌群失調(diào),促進(jìn)了產(chǎn)短鏈脂肪酸菌群的富集,同時BL含有豐富的膳食纖維,因此本研究進(jìn)一步探究了BL對AOM/DSS誘導(dǎo)模型小鼠體內(nèi)短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)水平的影響。如圖6所示,經(jīng)過5% BL干預(yù)后,乙酸含量由70.03 μmol/g提高至177.6 μmol/g,丙酸含量由14.94 μmol/g提高至54.25 μmol/g,丁酸含量由27.22 μmol/g提高至103.6 μmol/g,異丁酸含量由1.84 μmol/g提高至2.59 μmol/g,戊酸含量由2.06 μmol/g提高至3.79 μmol/g,BL顯著提升了小鼠盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸水平。短鏈脂肪酸在盲腸中由腸道菌群發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生,然后通過載體介導(dǎo)機(jī)制以陰離子形式進(jìn)入腸上皮被吸收并發(fā)揮其生物學(xué)功能[14],而異丁酸與戊酸的含量很低,因此后續(xù)聚焦于乙酸鈉、丙酸鈉及丁酸鈉對結(jié)直腸癌發(fā)展的影響。

a-乙酸含量;b-丙酸含量;c-丁酸含量;d-異丁酸含量;e-戊酸含量

圖6 小鼠盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸含量

Fig.6 Concentration of SCFA in mouse cecal contents

2.6 短鏈脂肪酸鹽對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響

結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性增殖是CRC發(fā)展的關(guān)鍵步驟,本研究選取結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和HT29來探究短鏈脂肪酸對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響。如圖7所示,3種短鏈脂肪酸鈉對HCT116和HT29細(xì)胞增殖均有抑制作用,且呈時間依賴及劑量依賴,其中丁酸鈉的抑制作用最為明顯,48 h時1 mmol/L丁酸鈉將HCT116細(xì)胞活力抑制到42.85%、HT29為21.75%,3 mmol/L的丁酸鈉將HCT116細(xì)胞活力抑制到11.43%、HT29為8.70%,10 mmol/L的丁酸鈉將HCT116細(xì)胞活力抑制到5.70%、HT29為1.60%。

a-不同濃度乙酸鈉(上)、丙酸鈉(中)和丁酸鈉(下)對HCT116細(xì)胞活力的影響;b-不同濃度乙酸鈉(上)、丙酸鈉(中)和丁酸鈉(下)對HT29細(xì)胞活力的影響

圖7 短鏈脂肪酸鈉對HCT116和HT29細(xì)胞活力的影響

Fig.7 Effects of SCFAs sodium on cell activity of HCT116 and HT29

2.7 短鏈脂肪酸鹽對JB 6P+細(xì)胞活力影響

本實驗意在探究乙酸鈉、丙酸鈉及丁酸鈉對JB 6P+細(xì)胞活力的影響。

實驗結(jié)果表明,1、3、10 mmol/L的乙酸鈉、丙酸鈉及丁酸鈉對JB 6P+細(xì)胞活力無明顯抑制作用(圖8)。

圖8 短鏈脂肪酸鈉對JB 6P+細(xì)胞活力的影響

Fig.8 Effects of SCFAs sodium on cell activity of JB 6P+

2.8 短鏈脂肪酸鹽對上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響

CRC發(fā)展過程中細(xì)胞癌變的第一步就是上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化,JB 6P+細(xì)胞是小鼠表皮癌前病變狀態(tài)的上皮細(xì)胞,通過刺激因子的誘導(dǎo)會發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。本研究用EGF誘導(dǎo)JB 6P+細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化并加入不同濃度的乙酸鈉、丙酸鈉及丁酸鈉進(jìn)行干預(yù)。如圖9所示,JB 6P+細(xì)胞經(jīng)EGF刺激后發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化并形成了單細(xì)胞克隆,而乙酸鈉、丙酸鈉及丁酸鈉干預(yù)后顯著降低了克隆數(shù)。實驗結(jié)果說明乙酸鈉、丙酸鈉及丁酸鈉可以抑制上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。

a-不同濃度乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉對JB 6P+細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響;b-細(xì)胞克隆數(shù)統(tǒng)計

圖9 短鏈脂肪酸鈉對上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響

Fig.9 Effects of SCFAs sodium on malignant transformation of epithelial cells

2.9 短鏈脂肪酸鹽對上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程相關(guān)信號通路的影響

EGF可以激活PI3K/AKT、MAPK/ERK信號通路,本研究進(jìn)一步探究了短鏈脂肪酸鈉對JB 6P+細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程相關(guān)信號通路的影響。如圖10所示,EGF顯著上調(diào)了p-AKT和p-ERK表達(dá)水平,3種短鏈脂肪酸鈉均顯著抑制p-AKT表達(dá),丙酸鈉和丁酸鈉顯著抑制p-ERK表達(dá)且呈劑量依賴。

圖10 短鏈脂肪酸鈉對PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的影響

Fig.10 Effects of SCFAs sodium on PI3K/AKT and MAPK/ERK pathway

3 討論

CRC是一種結(jié)腸炎相關(guān)的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅人們的健康[15]。雖然其發(fā)病機(jī)制尚未明確,但飲食可能是一種重要的影響因素[16],如:加工肉類、紅肉的攝入會增加CRC的發(fā)病風(fēng)險,而高膳食纖維、水果的攝入則會降低CRC的發(fā)病風(fēng)險[17]。TIAN等[18]指出,BL中的膳食纖維通過調(diào)節(jié)腸道菌群減緩潰瘍性結(jié)腸炎,但BL在潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)癌變的作用尚不明確。本研究主要探討了BL對結(jié)直腸癌的預(yù)防作用,并發(fā)現(xiàn)BL通過改善菌群失調(diào)、調(diào)節(jié)腸道菌群代謝產(chǎn)生短鏈脂肪酸,進(jìn)而抑制上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及結(jié)腸癌細(xì)胞增殖以減緩CRC的發(fā)生。

本研究先建立了移植瘤小鼠模型并以5-Fu治療來模擬臨床上結(jié)直腸腫瘤患者的化療[19],以考察BL對移植瘤及5-Fu化療的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),BL不影響移植瘤的生長和5-Fu的抗腫瘤活性,因此本研究又考察了BL對原發(fā)性結(jié)直腸癌的影響。AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌是一種模擬人類結(jié)直腸癌的動物模型[20],該模型已被廣泛用于研究CRC潛在的發(fā)病機(jī)制和治療靶點。本研究結(jié)果表明,BL能減緩結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。炎癥性腸病是CRC發(fā)病重要的影響因素,其中包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病,因此抑制炎癥反應(yīng)也是預(yù)防CRC的一個重要手段。此前,有研究報道BL可以緩解DSS誘導(dǎo)的潰瘍性腸炎[13],這為其對CRC發(fā)展的影響提供了研究基礎(chǔ)。參與炎癥-癌癥轉(zhuǎn)化過程的生物學(xué)因子有很多,COX-2就是一個重要的靶標(biāo)分子,在炎癥及癌癥發(fā)展過程中存在高表達(dá),有研究報道COX-2選擇性抑制劑可能是一類新的治療結(jié)直腸癌的藥物[21]。此外,EGFR作為重要的原癌基因在CRC發(fā)展過程中起著重要的作用,有研究報道EGFR介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化會促進(jìn)結(jié)腸炎相關(guān)的腫瘤發(fā)生[22]。而本研究結(jié)果顯示BL可以降低COX-2和EGFR的蛋白表達(dá)?？傊?本研究在動物模型上驗證了BL可以減緩結(jié)直腸癌的發(fā)展。高膳食纖維飲食會降低結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險[23],本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)BL干預(yù)改善了AOM/DSS誘導(dǎo)引起的菌群失調(diào),促進(jìn)擬桿菌、毛螺菌、胃瘤球菌等產(chǎn)短鏈脂肪酸菌群的富集,進(jìn)一步檢測盲腸內(nèi)容物中的短鏈脂肪酸水平也發(fā)現(xiàn)BL顯著提高了短鏈脂肪酸的含量。一般來說,結(jié)直腸腫瘤的形成會經(jīng)過腸上皮細(xì)胞癌變、癌變細(xì)胞惡性增殖、異型增生、最終形成結(jié)直腸腫瘤,而短鏈脂肪酸對CRC的預(yù)防具有潛在的保護(hù)作用[24]。因此,本研究考察了短鏈脂肪酸對上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化以及結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示乙酸鈉、丙酸鈉及丁酸鈉通過抑制上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖來減緩CRC的發(fā)展。為進(jìn)一步探究短鏈脂肪酸鈉抑制上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制,本研究考察了PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路,這2種信號通路在很多人類癌癥疾病中都被激活[25],是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及凋亡的關(guān)鍵信號通路[26]。本研究發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸鈉是通過調(diào)節(jié)p-AKT及p-ERK表達(dá)來抑制上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。

4 結(jié)論

本研究表明,BL可以預(yù)防AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌發(fā)生,改善腸道菌群失調(diào),調(diào)節(jié)腸道菌群代謝短鏈脂肪酸,并進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化;BL不影響移植瘤的生長也不影響化療藥物5-Fu的抗腫瘤活性,但其可以改善小鼠生存狀態(tài)、緩解癌性脾腫大及5-Fu造成的結(jié)腸縮短。本文研究成果為結(jié)直腸癌的預(yù)防提供了一個新的策略。

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