連續(xù)培養(yǎng)中的細(xì)胞系可能產(chǎn)生不良結(jié)果，如遺傳漂變、衰老以及微生物污染，而且即使是運(yùn)行狀況最好的實(shí)驗(yàn)室也可能會出現(xiàn)設(shè)備故障。已建立的細(xì)胞系是一種寶貴的資源，并且其更換是昂貴且耗時(shí)的。因此，將其冷凍保存以用于長期儲存至關(guān)重要。妥善維護(hù)的冷凍細(xì)胞儲備液是細(xì)胞培養(yǎng)的重要組成部分。

一旦從傳代培養(yǎng)中獲得少量剩余細(xì)胞，理想的保存方法是將其冷凍作為種子儲備液，并加以保護(hù)，并且不能用于一般實(shí)驗(yàn)室用途。可以使用冷凍種子儲備液制備和補(bǔ)充工作儲備液。如果種子儲備液用盡，則可使用凍存的工作儲備液制備新鮮種子儲備液，其代數(shù)將比初始冷凍代數(shù)略微增加。

貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的一般冷凍方法是相同的，但貼壁細(xì)胞需要在開始冷凍程序之前從培養(yǎng)板中取出。培養(yǎng)細(xì)胞的理想凍存方法是使用含二甲亞砜 (DMSO) 等冷凍保護(hù)劑的完全培養(yǎng)基冷凍細(xì)胞并將其保存于液氮中。冷凍保護(hù)劑可降低培養(yǎng)基的凝固點(diǎn)，同時(shí)可降低冷卻速度，從而大大降低了晶體形成的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)榫w會損傷細(xì)胞并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

注：已知 DMSO 溶液可促進(jìn)有機(jī)分子進(jìn)入組織。使用合適的設(shè)備和操作方法處理含 DMSO 的試劑，避免這類材料產(chǎn)生危害。處理試劑時(shí)應(yīng)遵守當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)。

冷凍培養(yǎng)基
應(yīng)始終使用推薦的冷凍培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞凍存。冷凍培養(yǎng)基應(yīng)含有 DMSO 或甘油等冷凍保護(hù)劑。您也可以使用專門配制的凍存完全培養(yǎng)基，如 Gibco Recovery 細(xì)胞培養(yǎng)冷凍培養(yǎng)基或 Gibco Synth-a-Freeze 凍存培養(yǎng)基。

Recovery 細(xì)胞培養(yǎng)冷凍培養(yǎng)基是一種適用于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的即用型凍存完全培養(yǎng)基，其胎牛血清和牛血清比例經(jīng)過優(yōu)化，可提高細(xì)胞存活率和解凍后的細(xì)胞復(fù)蘇率。Synth-a-Freeze 凍存培養(yǎng)基是一種化學(xué)成分明確、不含蛋白質(zhì)的無菌凍存培養(yǎng)基，含有 10% DMSO，適用于凍存除黑色素細(xì)胞以外的多種干細(xì)胞和原代細(xì)胞。

以下方案描述了凍存培養(yǎng)細(xì)胞的通用步驟。具體方案，請始終參閱細(xì)胞特定產(chǎn)品說明書。

制備冷凍培養(yǎng)基并保存于 2-8°C 備用。請注意選擇適用于細(xì)胞系的冷凍培養(yǎng)基。凍存貼壁細(xì)胞時(shí)，應(yīng)按照細(xì)胞傳代時(shí)采用的方法將細(xì)胞從組織培養(yǎng)容器上溫和解離下來。將解離細(xì)胞重懸于適用于該細(xì)胞類型的完全培養(yǎng)基中。利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和臺盼藍(lán)拒染法或 Countess 自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定細(xì)胞總數(shù)和活細(xì)胞百分比。根據(jù)目標(biāo)存活細(xì)胞密度，計(jì)算所需冷凍培養(yǎng)基體積。

以約 100–200 × g 離心細(xì)胞懸液 5-10 分鐘。在不擾動細(xì)胞團(tuán)塊的情況下，無菌傾析上清液。

注：  細(xì)胞類型不同，離心速度和時(shí)間也不同。

按照特定細(xì)胞類型的推薦活細(xì)胞密度，將細(xì)胞團(tuán)塊重懸于冷卻的冷凍培養(yǎng)基中。將細(xì)胞懸液分裝于凍存管中。分裝時(shí)，應(yīng)經(jīng)常輕輕混合細(xì)胞，維持細(xì)胞懸液的均一性。在可控速度冷凍設(shè)備中冷凍細(xì)胞，降溫速度約為 1°C/分鐘?；蛘?，將裝有細(xì)胞的凍存管放在異丙醇凍存盒中，并將其保存于 –80°C 過夜。將凍存細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮，將其放在液氮上方的氣相中。

遵循以下指南對于凍存細(xì)胞系以供未來使用非常重要。與其他細(xì)胞培養(yǎng)操作相同，我們建議您嚴(yán)格遵守細(xì)胞系隨附的使用說明，以獲得最佳結(jié)果。

盡可能凍存高濃度、低代數(shù)的細(xì)胞樣本。應(yīng)保證細(xì)胞在凍存前至少存活 90%。應(yīng)注意，所用細(xì)胞系不同，最佳凍存條件也不同。使用可控速度凍存冰箱或凍存容器，如 Thermo Scientific Nalgene 實(shí)驗(yàn)室器具 (Nalge Nunc) 的“Mr. Frosty”，以約 1°C/分鐘的降溫速度緩慢冷凍細(xì)胞。應(yīng)始終使用推薦的冷凍培養(yǎng)基。冷凍培養(yǎng)基應(yīng)含有冷凍保護(hù)劑，如 DMSO 或甘油（參見什么是傳代培養(yǎng)？）細(xì)胞樣本應(yīng)儲存在低于 -135°C 的氣相液氮中。應(yīng)始終使用無菌凍存管保存冷凍細(xì)胞。裝有冷凍細(xì)胞的凍存管應(yīng)完全浸沒于液氮中或液氮上方的氣相中（參見以下安全說明）。應(yīng)始終穿戴個人防護(hù)設(shè)備。與細(xì)胞直接接觸的所有溶液和設(shè)備都必須無菌。始終使用適當(dāng)?shù)臒o菌技術(shù)，并在層流罩中進(jìn)行操作。

安全說明：生物危險(xiǎn)材料必須保存于液氮上方的氣相中。將密封凍存管保存于氣相中可消除爆炸風(fēng)險(xiǎn)。如果您使用液相保存，應(yīng)警惕玻璃和塑料凍存管的爆炸危險(xiǎn)，并始終佩戴防護(hù)面罩或護(hù)目鏡。

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