編譯：微科盟小喵，編輯：微科盟居居、江舜堯。

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導讀  

肝細胞癌(HCC)是全球癌癥相關死亡的主要原因，而晚期HCC的治療選擇有限。本研究觀察到腸道生態(tài)失調會影響抗腫瘤免疫監(jiān)測并推動肝病向癌癥發(fā)展。Nlrp6-/-小鼠中失調的微生物群誘導肝單核型髓系抑制性細胞(mMDSC)擴增，并抑制T細胞增殖。這種表型可通過糞便菌群移植傳播，經(jīng)抗生素治療后可逆轉，表明腫瘤微環(huán)境具有高度可塑性。Akkermansia muciniphila的缺失與mMDSC豐度相關，重新引入此菌可恢復腸道屏障功能并降低肝臟炎癥和纖維化。肝硬化患者肝組織中細菌豐度增加，可引起明顯的轉錄變化，包括激活纖維-炎癥通路以及介導癌癥免疫抑制的回路。本研究表明，腸道菌群可重塑肝臟炎癥微環(huán)境，為癌癥預防和治療開辟了新途徑。  

論文ID

原名：Imbalanced gut microbiota fuels hepatocellular carcinoma development by shaping the hepatic inflammatory microenvironment

譯名：不平衡的腸道菌群通過塑造肝臟炎癥微環(huán)境促進肝細胞癌的發(fā)展

期刊：Nature Communication

IF：17.694

發(fā)表時間：2022.7

通訊作者：Christian Trautwein

通訊作者單位：德國亞琛工業(yè)大學

DOI號：10.1038/s41467-022-31312-5

實驗設計

結果

1 NLRP6缺失促進NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝病進展

NLRP6炎性小體是腸道中維持宿主-微生物穩(wěn)態(tài)的重要調節(jié)因子，為了研究Nlrp6-/-介導的腸道生態(tài)失調對脂肪性肝炎進展的影響，我們將NEMOΔhepa與Nlrp6-/-小鼠交配得到NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠。與NEMOΔhepa小鼠相比，52周齡的NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠顯示出更高的腫瘤負荷，而且肝臟/體重比也明顯增加(圖1a-b)。與NEMOΔhepa小鼠相比，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠血清中丙氨酸轉氨酶(ALT)、谷氨酸脫氫酶(GLDH)、堿性磷酸酶(AP)和膽紅素水平升高，肝損傷增加(圖1c)。肝切片H&E和CD45免疫組織化學染色顯示，NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠顯示出明顯的免疫細胞浸潤(圖1d)。天狼星紅(SR)染色以及促纖維化基因Tgfβ和Collagen1a1的mRNA表達水平證實肝纖維化(圖1d-e)。肝切片染色顯示NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠均表現(xiàn)出明顯的免疫細胞浸潤(圖1d)。然而，與NEMOΔhepa小鼠相比，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟中CD11b+細胞數(shù)量顯著增加(圖1f)。相反，當NLRP6缺失時，CD8+ T細胞減少(圖1f)。值得注意的是，WT小鼠中NLRP6的缺失不足以導致肝損傷、炎癥或纖維化(圖1)。

如前所述，在NEMO缺失的情況下，經(jīng)典NF-kB通路的激活所導致的肝細胞死亡是由于抗凋亡基因表達缺失。因此，本研究聚焦肝臟炎癥如何影響小鼠的細胞死亡和代償性增殖。雖然腫瘤組織中促炎細胞因子Tnfa、Il6、Il1β以及炎性小體成分Caspase-1和Nlrp3的mRNA表達水平保持不變，但在沒有腫瘤的整個肝組織中，髓系CD11b+細胞浸潤與促炎細胞因子Tnfa、Tlr4、Il1β、Nlrp3和Ccl5的高表達密切相關(圖1g)。先前的研究表明，NLRP6的缺失會導致NLRP327的過度激活。雖然Nlrp3 mRNA表達水平增加，但我們無法在蛋白質水平上證實這一點(補充圖1e, f)。此外，Nlrp3基因表達在早期13周時間點沒有變化，表明在NLRP6缺失的情況下，Nlrp3炎性小體過表達并不會介導觀察到的表型(補充圖1g)。52周齡NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的炎癥表型與pJNKd的顯著激活相關(圖1h)，這與裂解Caspase3染色和代償性增殖顯示的凋亡性肝細胞死亡增加相關(圖1i-j)。綜上，這些結果表明NLRP6缺失重塑NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腫瘤微環(huán)境的炎癥反應，并推動肝臟疾病向纖維化和癌癥發(fā)展。

圖1. NLRP6缺失促進NEMOΔhepa小鼠肝病進展。a. 52周齡NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟的外觀圖。b. 對NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟中直徑大于1cm的腫瘤進行量化。c. 52周齡NEMOΔhepa (n=12)、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-(n=8)小鼠與相應對照組WT(n=6)、Nlrp6-/-(n=6)小鼠血清中ALT和GLDH水平。d. 52周齡WT、Nlrp6-/-、NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝切片H&E染色、CD45免疫組織化學(IHC)染色和天狼星紅染色代表圖片。e. RT-qPCR分析NEMOΔhepa、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠與相應對照組WT、Nlrp6-/-小鼠肝臟中促纖維因子(TGFβ、Col1al)mRNA表達水平。f.NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠與相應對照組WT、Nlrp6-/-小鼠肝臟CD11b和CD8免疫熒光染色圖，DAPI用于染細胞核。g. RT-qPCR分析NEMOΔhepa，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠與相應對照組WT，Nlrp6-/-小鼠肝臟中炎性因子(TNFα、IL-1β、Tlr4) mRNA表達水平。h.以JNK、p-JNK和GAPDH為對照的52周齡的各基因型小鼠肝蛋白提取物的免疫印跡分析。i. 每個視野中裂解Caspase 3陽性細胞的組織學定量。j. KI67的IF染色代表性圖片。比例尺：100 μm。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤差(SEM)表示。

2 Nlrp6缺失與NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腸道菌群失調和屏障受損相關

來自雜合Nlrp6+/-親代的WT和Nlrp6-/-同窩仔，在斷奶后分別在無特定病原體(SPF)條件下至少繁殖3代，以促進Nlrp6-/-小鼠中失調菌群的發(fā)展。后續(xù)利用這些雄性小鼠研究腸道菌群失調對脂肪性肝炎進展的影響。采用16S rRNA基因擴增子測序分析13周齡和52周齡NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠以及對照組WT和Nlrp6-/-小鼠的盲腸微生物群組成。首先，基于Bray-Curtis差異比較了13周齡和52周齡小鼠之間的β多樣性，即小鼠之間腸道菌群組成的差異。為評估基因型(WT、Nlrp6-/-、NEMOΔhepa、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-)、飼養(yǎng)籠、NEMO基因型(WT，Nlrp6-/- vs NEMOΔhepa，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-)以及小鼠品系(Nlrp6-/-，NEMOΔhepa/Nlrp6-/- vs WT，NEMOΔhepa)對組間微生物組成差異的相對貢獻，我們進行了置換多變量方差分析(ADONIS)?；蛐汀曫B(yǎng)籠、NEMOΔhepa基因型和小鼠品系解釋了13周齡小鼠中微生物群總變異的很大比例(圖2a)。這些分析結果也表明了顯著的飼養(yǎng)籠效應。將基因型和飼養(yǎng)籠納入ADONIS分析，基因型仍然可以解釋微生物群總變異的很大一部分(R=0.296，p =0.003)。NEMOΔhepa和NEMOfl/fl，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-和NEMOfl/fl/Nlrp6-/-同窩小鼠同籠飼養(yǎng)，NEMO條件性缺失以及所導致的脂肪性肝炎對腸道微生物群組成仍有可重復的影響。β多樣性分析證實了Nlrp6-/-品系中獨特的微生物群，這解釋了微生物群總變異的16%(圖2a)。

基于DESeq2和LEfSe進行差異豐度分析，結果顯示NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中Muribaculum豐度相對增加，而Verrucomicrobiaceae和Lachnospiraceae中幾種菌顯著減少(圖2b-c)。所有組進行成對比較顯示，與WT小鼠相比，Nlrp6-/-小鼠中Roseburia和Lachnospiraceae減少。與WT同窩小鼠相比，NEMOΔhepa中Akkermansia增加，而此菌在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中完全消失。這些細菌在13周齡和52周齡NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中均不存在，可在LEfSe分析中區(qū)分NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠(圖3c)。接下來，分析了不同基因型小鼠的腸組織切片，以探索菌群變化對腸道功能的影響。A. muciniphila可降解粘蛋白，與粘液層的增厚和腸道屏障的改善有關。因此，我們分析了結腸粘液層，結果顯示NLRP6的缺失與結腸粘液層變薄相關，且在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中最為明顯。通過對腸道不同部位的緊密連接蛋白ZO-1進行免疫熒光染色，探究腸道屏障功能。與WT小鼠相比，52周齡NEMOΔhepa小鼠的十二指腸、空腸、回腸和結腸中ZO-1的表達降低(圖2d)。NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中ZO-1進一步減少，在回腸和結腸最為明顯。與NEMOΔhepa小鼠相比，52周齡NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的回腸和結腸組織裂解物中閉鎖蛋白表達降低(圖2e，f)。然而，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠顯示出ZO-1進一步減少，這在回腸和結腸中最為明顯。與NEMOΔhepa小鼠相比，52周齡NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的回腸和結腸組織裂解物中occludin蛋白表達降低(圖2e, f)。有趣的是，TJ屏障的破壞與炎癥基因(如Il1β、Il18、Mcp1和Ccl5)的mRNA表達增加以及回腸組織中CD11b+細胞浸潤增加有關(圖2g)。總之，這些結果顯示NLRP6表達缺失所引起的腸道生態(tài)失調促使腸道TJ屏障破壞，炎癥基因表達增加。

圖2. NLRP6缺失導致腸道生態(tài)失調和與脂肪性肝炎活性和腫瘤負荷相關的腸道屏障受損。a.16S rRNA基因擴增子測序分析13周齡WT、Nlrp6-/-、NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠盲腸菌群組成。b. DESq分析13周齡NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的差異菌群。c. LEFSe分析NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腸道菌群。d. NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-和相應的對照組WT和Nlrp6-/-小鼠回腸和結腸ZO-1 IF染色的代表性圖片。e,f. 免疫印跡分析52周齡小鼠回腸和結腸組織蛋白提取物中Occludin的表達，β-actin作為內參。g. RT-qPCR分析NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠回腸中炎性因子(IL-1β、Il-18、TNFα、Mcp1、Ccl5)的mRNA表達水平。h. 灌胃FITC-葡聚糖評估NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腸道通透性。i. FITC-葡聚糖通透性與腸道屏障功能強相關，紅點代NEMOΔhepa/Nlrp6-/-，藍點代表NEMOΔhepa小鼠。

3 腸道通透性與脂肪性肝炎和增加的腫瘤負荷相關

接下來，我們研究了NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腸道生態(tài)失調和腸道屏障損傷對腸道功能的影響。與NEMOΔhepa對照相比，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腸通透性明顯增加(圖2h)。值得注意的是，ALT水平和腫瘤數(shù)量與腸道通透性密切相關(圖2i)，表明腸道屏障受損加劇NEMOΔhepa小鼠的肝臟疾病。

4 NLRP6缺失重塑肝臟免疫微環(huán)境

13周齡NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝組織中白細胞浸潤增加，SR染色顯示肝纖維化加重，Ki67免疫組織化學(IHC)染色表明肝細胞增殖增加(圖3a-b)。與NEMOΔhepa小鼠相比，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的ALT、AST和GLDH水平顯著增加，表明肝損傷更為嚴重(圖3c)；且NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肝臟/體重比顯著增加。星狀細胞可觸發(fā)HCC發(fā)展過程中的上皮-間質轉化。與NEMOΔhepa小鼠相比，aSMA染色顯示13周齡NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠星狀細胞活化增加。然而，沒有證據(jù)表明NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟中hedgehog信號激活增加(補充圖3f)。腸道生態(tài)失調和屏障受損促進MAMPs通過門靜脈進入肝臟，從而激活由病原體識別受體(PRR)介導的先天免疫反應。與NEMOΔhepa小鼠相比，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟中CD45+白細胞浸潤顯著增加(圖3d-e)。與NEMOΔhepa相比，流式細胞術分析(FACS)顯示髓系抑制性細胞(CD45+CD11b+Ly6G-Gr1hi)以及CD11b+Ly6G+細胞浸潤顯著增加(圖3f)。值得一提的是，mMDSC豐度與ALT水平密切相關，表明它們介導NEMOΔhepa小鼠肝損傷(圖3g)。mMDSC在腫瘤發(fā)展中對T細胞具有明顯抑制效應，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中細胞毒性CD8+ T細胞(CD45+CD3+CD8+)和CD4+ T細胞(CD45+CD3+CD4+)明顯減少(圖3h)。mMDSC豐度與細胞毒性T細胞呈負相關(圖3i)。其他免疫細胞亞群，如Kupffer細胞、NK/NKT細胞和B細胞保持不變。此外，在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中觀察到M2標志物Arg1表達增加，而M1標志物Nos2表達降低，表明這些小鼠中存在促腫瘤微環(huán)境。

5 NEMOΔhepa/Nlrp6-/-mMDSCs在體外抑制T細胞增殖

根據(jù)細胞表面標志物表達不能充分定義MDSCs。因此，我們進行了額外的染色和功能分析，以進一步確定細胞表型。CD11b+ mMDSCs和CD8+ T細胞非常接近，在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肝臟中最為明顯(補充圖5a)。接下來，我們分離并進一步表征了這些細胞，并通過體外實驗檢測它們對T細胞的抑制能力。從WT和Nlrp6-/-小鼠脾臟中分離T細胞，用CFSE標記，CD3/CD28刺激后，與NEMOΔhepa或NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟中分離的粒細胞MDSC(CD45+Ly6G+Gr1hi)或mMDSC(CD45+Ly6G-Gr1hi)共培養(yǎng)，結果顯示mMDSCs明顯抑制CD8+ T細胞增殖，且在與NEMOΔhepa/Nlrp6-/- mMDSCs共培養(yǎng)時抑制效應最明顯(圖3i)。這些結果說明，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腸道生態(tài)失調與mMDSCs擴增密切相關，同時與NEMOΔhepa mMDSCs相比，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-mMDSCs具有更強的抑制效應。

圖3. mMDSCs促進NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠脂肪性肝炎進展。a. 13周齡WT、Nlrp6-/-、NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝切片KI67免疫組織化學染色和HE染色代表性圖片。比例尺:100 μm。b. 每個視野中Ki67+細胞的組織學定量。c. 13周齡NEMOΔhepa、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-和相應的對照組WT、Nlrp6-/-小鼠血清中ALT和GLDH水平。d,e. 13周齡小鼠CD45肝切片免疫組化代表性圖片(d)及定量分析(e)。f. 流式細胞術分析各基因型13周齡小鼠(NEMOΔhepa、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-和對照WT、Nlrp6-/-)肝臟中單核細胞骨髓源性抑制細胞(mMDSC)。g. NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中，CD45+活細胞中mMDSCs的比例與ALT水平密切相關。h.流式細胞術分析各基因型13周齡小鼠(NEMOΔhepa、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-和對照WT、Nlrp6-/-)肝臟中CD3+CD8+細胞毒性T細胞的比例。i. CD45+活細胞和CD8+細胞毒性T細胞的mMDSCs百分比呈負相關。j. 體外T細胞增殖實驗。T細胞與粒細胞MDSCs或單核MDSCs共培養(yǎng)。

6 微生物減少重塑肝臟炎癥微環(huán)境并改善脂肪性肝炎

為探究腸道微生物群是否影響NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟中炎癥反應，我們利用廣譜抗生素(ABx)組合處理8周齡小鼠直至第13周?？股靥幚韺е履c道菌群幾乎完全清除。值得注意的是，ABx處理后NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肝轉氨酶水平與NEMOΔhepa小鼠相似，并且與未處理小鼠相比顯著降低(圖4a)。重要的是，ABx處理導致mMDSC顯著降低，F(xiàn)ACS證明了這一點，同時也反映在IF染色中CD11b+細胞的數(shù)量減少(圖4b，c)。相反，ABx處理導致CD8+ T細胞和CD4+ T細胞擴增，幾乎達到NEMOΔhepa小鼠肝臟中的水平(圖4b)。

7 NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的免疫表型可通過FMT傳遞到NEMOΔhepa小鼠并涉及TLR4信號

在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中，ABx清除腸道菌群可改善肝損傷、抑制mMDSC浸潤并恢復細胞毒性T細胞豐度(圖4b)。為了進一步探究Nlrp6-/-小鼠腸道菌群的致病性，我們將NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠糞便菌群移植(FMT)到NEMOΔhepa小鼠。微生物群轉移導致NEMOΔhepa腸道菌群沿NMDS軸1移動。DESeq2和LEfSe分析比較了進行/不進行FMT的NEMOΔhepa小鼠菌群組成，表明這種轉變主要由A. muciniphila的差異豐度導致(圖4d)。值得注意的是，在FMT中，所有受體NEMOΔhepa小鼠均缺乏A. muciniphila，在比較NEMOΔhepa FMT-受體與NEMOΔhepa/Nlrp6-/- FMT-供體的LEfSe分析中，只觀察到一個差異OTU (OTU23_ambiguous_taxa)，進一步支持了成功的微生物轉移。FMT導致NEMOΔhepa小鼠的肝轉氨酶AST和ALT顯著增加(圖4e)。NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠微生物的FMT導致受體NEMOΔhepa小鼠肝臟中CD45+白細胞的絕對數(shù)量增加，mMDSC顯著擴增，并有效抑制細胞毒性T細胞(圖4f-h)。

由于NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的腸道生態(tài)失調會損害腸道屏障功能，從而促進PRRs的激活，我們測試了TLR4是否參與FMT介導的mMDSCs增殖。利用NEMOΔhepa/Tlr4-/-作為受體小鼠，將NNEMOΔhepa或NEMOΔhepa/Nlrp6-/-腸道菌群轉移到同窩受體小鼠中。與移植NEMOΔhepa腸道菌群相比，移植NEMOΔhepa/Nlrp6-/-腸道菌群的NEMOΔhepa/Tlr4-/-小鼠，其肝損傷并未增加，血清AST和ALT水平以及mMDSC豐度保持不變(圖4i-j)。與TLR4參與mMDSC擴增一致，8周齡和52周齡的NEMOΔhepa/Tlr4-/-小鼠mMDSC豐度降低。這一觀察結果也與肝轉氨酶水平降低、細胞死亡和增殖減少以及52周齡小鼠的腫瘤負荷降低相關。此外，mMDSC豐度降低與CD3+CD4+ T細胞增加有關。為了確定這種免疫表型是由造血細胞還是實質細胞介導，我們進行了骨髓移植實驗。與接受WT骨髓的NEMOΔhepa小鼠相比，接受Tlr4-/-供體骨髓的嵌合小鼠顯示出mMDSC豐度顯著降低了6倍以上，表明造血細胞中TLR4參與上述免疫表型調控?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的免疫表型可經(jīng)FMT傳遞給NEMOΔhepa小鼠。確切地說，造血細胞中的TLR4信號增強了mMDSC浸潤并促進脂肪性肝炎向HCC發(fā)展。

圖4. 腸道菌群重塑NEMOΔhepa小鼠肝臟免疫微環(huán)境。a.從第8周起至第13周，用抗生素處理NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠，分析小鼠血清AST和ALT水平。b. 流式細胞術分析 經(jīng)/未經(jīng)ABX處理NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟中mMDSC細胞與CD3+CD8+ T細胞。c. 經(jīng)/未經(jīng)ABX處理的NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠CD11b免疫熒光染色代表性圖片。d. DESeq分析13周齡NEMOΔhepa和NEMOΔhepa-FMT小鼠微生物群差異豐度。e. NEMOΔhepa小鼠(有/沒有移植NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腸道菌群)血清中AST水平。f. 有/沒有FMT的NEMOΔhepa小鼠中CD11b的免疫熒光染色。g.h. 流式細胞術分析有/沒有FMT的NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟中mMDSC細胞和CD3+CD8+細胞毒性T細胞。i-j. 流式細胞術分析NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腸道菌群的NEMOΔhepa/Tlr4-/-小鼠血清中ALT和AST水平(i)和肝臟中mMDSC細胞(j)。

8 NEMOΔhepa小鼠腸道菌群的特定改變與肝病表型相關

13周齡和52周齡NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的腸道微生物群與NEMOΔhepa小鼠明顯不同。腸道菌群可重塑肝臟炎癥微環(huán)境。因此，我們探究哪些微生物群的特定變化可能影響NEMOΔhepa小鼠的肝病。LEfSe分析顯示，與NEMOΔhepa小鼠相比，A. muciniphila在13周和52周齡的NEMOΔhepa/Nlrp6-/-以及接受FMT的NEMOΔhepa小鼠中顯著減少(圖2b)。此外，在NEMOΔhepa小鼠中，A. muciniphila的相對豐度與肝臟mMDSC豐度以及血清ALT和GLDH水平呈負相關，表明這些細菌在介導表型中的相關性(圖5a)。因此，我們在NEMOΔhepa小鼠中驗證A. muciniphila移植是否可以改善肝臟疾病。用2×108CFU的A. muciniphila或厭氧PBS對8周的NEMOΔhepa同窩小鼠進行口服灌胃，每周3次，持續(xù)5周(圖5b)。通過對灌胃5周前后的糞便樣本進行RT-qPCR和16S rRNA基因擴增子測序，證實了成功的微生物群移植(圖5c)。PCA分析顯示，AKK處理不僅增加了這種特定細菌的豐度，而且導致微生物群組成發(fā)生顯著變化(圖5c)。A. muciniphila處理解釋了在這些小鼠中觀察到的微生物群總變異的很大比例。LEfSe分析顯示擬桿菌門減少，Akkermansia增加(圖5d)。DESeq2分析顯示，補充Akkermansia還導致Lachospiraceae和Blautia豐度增加，這與微生物群整體豐度的增加有關。與PBS處理的對照小鼠相比，經(jīng)A. muciniphila灌胃的NEMOΔhepa小鼠的結腸粘液層明顯增厚且ZO-1表達增加。結腸組織裂解物的蛋白質印跡分析顯示，A. muciniphila灌胃后，Occludin蛋白水平顯著增加(圖5g)。與PBS對照相比，經(jīng)A. muciniphila灌胃的NEMOΔhepa小鼠中，肝損傷標志物(即ALT、AST、LDH和GLDH)的血清水平明顯降低(圖5h)。CD45和CD11b染色顯示，A. muciniphila處理導致肝纖維化和白細胞浸潤顯著減少(圖5i)。與此一致，A. muciniphila灌胃的NEMOΔhepa小鼠中纖維炎癥基因的mRNA表達顯著降低(圖5j)。最后，我們探究在Nlrp6-/-生態(tài)失調模型中是否可以改善肝臟疾病的進展。與PBS處理的NEMOΔhepa小鼠相比，A. muciniphila處理可降低NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肝損傷，這與骨髓CD11b+細胞浸潤顯著減少和SR染色證明的肝纖維化降低有關。這些數(shù)據(jù)共同表明，即使存在促進生態(tài)失調的宿主因素(如NLRP6缺失)，持續(xù)補充A. muciniphila也可以減少肝損傷、炎癥和纖維化。

圖5. 補充A. muciniphila可改善NEMOΔhepa小鼠的肝臟疾病。a. NEMOΔhepa小鼠盲腸A. muciniphila的相對豐度與mMDSCs的相關性分析。b. 實驗流程，8周齡的NEMOΔhepa小鼠連續(xù)5周灌胃2.1×108 CFU AKK或厭氧PBS。c.d. PCoA分析(c)和LEFSe分析(d) NEMOΔhepa小鼠AKK處理前后的微生物群。e.f. AKK或PBS處理NEMOΔhepa小鼠結腸MUC2免疫熒光染色(e)和回腸、結腸ZO-1免疫熒光染色(f)的代表性圖片。免疫印跡分析NEMOΔhepa小鼠灌胃AKK菌或PBS 5周后結腸蛋白提取物中occludin蛋白表達，β-actin作為內參。h. NEMOΔhepa小鼠灌胃AKK菌或PBS 5周后血清中ALT和AST水平，非配對t檢驗。i. NNEMOΔhepa小鼠灌胃AKK菌或PBS后H＆E染色的肝切片和CD11b免疫熒光染色的代表性圖片。j. RT-qPCR分析NNEMOΔhepa小鼠灌胃AKK菌或PBS 5周后肝臟組織中炎癥因子和促纖維化因子(TGFβ、Col1a1、Mcp-1、Tlr4)的mRNA表達水平。

9 肝硬化患者的細菌易位較高，影響肝臟轉錄譜

接下來，我們探究在小鼠中觀察到的結果是否也適用于人類。因此，我們從接受肝移植的晚期混合病因肝硬化患者(n=43)和接受其他腹部手術的對照組患者(n=12)中收集速凍肝組織。利用16S rRNA基因擴增子測序分析肝臟細菌DNA豐度。同時通過mRNA測序研究宿主基因表達，以評估細菌易位如何影響肝臟轉錄譜。RT-qPCR檢測顯示，與對照組相比，肝硬化患者每納克總DNA中具有更高的16S rRNA基因拷貝(圖6b)。肝硬化患者表現(xiàn)出更高的α多樣性(Shannon指數(shù))。NMDS排序顯示肝硬化患者與對照組之間存在中度聚類(補充圖9b)(R2= 0.038, p = 0.01, ADONIS)，并且在LEfSe分析中，Stenotrophomonas、Roseburia、Sphingobiom以及Psychrobacter將肝硬化患者與對照區(qū)分開。乳桿菌目與患者的MELD評分和膽紅素水平呈負相關(補充表3)。轉錄組數(shù)據(jù)的PCA分析顯示肝硬化患者和對照的明顯聚類?；赑ROGENy的通路分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，肝硬化患者中纖維炎癥通路TGFβ、NFκB、TNFα和缺氧以及與肝損傷修復、再生和惡性轉化相關的通路(如EGFR、MAPK、P53、PI3K和WNT)顯著上調(圖6c)。MAPK和TGFβ信號通路的激活與肝臟中16S rDNA豐度相關(圖6c)。此外，梭菌屬豐度與MAPK、EGFR、TNFa和NFκB通路激活相關?；贒oRothEA推測的幾種致癌轉錄因子(如FOS、ETS2、RELB、SOX10、ERG、WT1和JUND)以及干性轉錄因子(如PBPJ和ARID3A)在肝硬化患者中上調并與細菌易位相關。此外，癌癥相關基因也與16S rRNA基因豐度相關。

10 細菌易位塑造炎癥微環(huán)境并促進肝硬化中T細胞耗竭標志物的表達

基于小鼠數(shù)據(jù)，我們下一步專門研究了細菌易位對人類肝硬化肝臟炎癥環(huán)境的影響。為此，利用xCell對肝細胞基因表達譜分析，肝硬化表現(xiàn)出整體免疫細胞和基質細胞的富集，而肝細胞評分相對降低(圖6d)。有趣的是，16Sr RNA基因豐度升高與CD8+ T細胞、NKT細胞、CD4+中央記憶性T細胞和調節(jié)性T細胞增加有關，后者與腫瘤免疫抑制相關(圖6d)。包括編碼PD-1的PDCD1和細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA4)在內的幾個免疫檢查點基因顯示出與16S rRNA豐度的強相關性(圖6e，f)。與這些研究結果一致，胸腺細胞選擇相關基因TOX、IRF4以及REL和BACH2(指導人類癌癥中的T細胞耗竭和免疫抑制)與16S rRNA 基因豐度高度相關(圖6g)。相反，與T細胞活化狀態(tài)相關的TOX3轉錄因子表達和活性是與16S rDNA豐度負相關最強的5個轉錄因子之一。暴露于MAMPs和PAMPs時，先天免疫反應的激活依賴于通過PRRs感知。幾種PRRs(如NOD1、NLRP3和TLR2)的表達均與細菌易位相關。MDSCs是MAMPs和PAMP的重要傳感器，可能抑制T細胞功能。MDSC標記集落刺激因子受體2a(CSFR2A)和白細胞介素1受體2(IL1R2)的表達水平均與16S rRNA基因豐度密切相關。總之，這些數(shù)據(jù)表明，肝硬化患者的細菌易位與纖維炎癥通路以及與免疫抑制和T細胞耗竭相關的轉錄因子激活密切相關。

圖6. 肝硬化患者細菌16S rDNA增加并改變肝臟轉錄譜。a.研究流程：速凍手術肝組織標本取自44名接受肝移植的肝硬化患者或11名健康對照者。從同一組織標本和組織區(qū)域分離DNA和mRNA，并進行16S rRNA基因擴增子測序或mRNA測序。b. RT-qPCR分析對照(n = 12)和肝硬化患者(n = 43)患者每納克DNA中16S rRNA基因拷貝數(shù)。c.基于mRNA測序數(shù)據(jù)和PROGENy推測健康對照和肝硬化患者的信號通路分析。d.健康對照和肝硬化患者中細胞類型富集，以及與16S rRNA基因相對豐度的相關性分析。e.16S rRNA基因豐度與免疫檢查點基因的表達密切相關。f-g. 每納克基因組DNA中rRNA基因拷貝與CTLA4和T細胞耗竭相關轉錄因子(TOX,IRF4)表達的相關性。

討論

腸-肝軸和腸道菌群是慢性肝病研究的熱點，也是進行慢性肝病發(fā)病機制探究的基石。本研究認為腸道屏障損傷和細菌易位是重塑肝臟炎癥微環(huán)境和促進肝臟疾病向肝硬化和HCC發(fā)展的關鍵機制。慢性疾病、與現(xiàn)代西方生活方式相關的環(huán)境和飲食因素以及藥物治療已被發(fā)現(xiàn)有助于腸道生態(tài)失調。這些因素改變腸道菌群構成，并直接影響機體炎癥狀態(tài)。由于肝臟通過門靜脈不斷地暴露于來自腸道的大量微生物衍生物，腸道穩(wěn)態(tài)的變化影響肝臟的生理機能。

小鼠模型是進行腸-肝軸機制研究的有效工具。NLRP6炎性小體是腸道中維持宿主-微生物穩(wěn)態(tài)的重要調節(jié)因子，而NEMOΔhepa小鼠是自發(fā)性脂肪性肝炎、肝纖維化小鼠模型，最終可發(fā)展為肝細胞癌。因此，本研究利用NLRP6缺失的NEMOΔhepa小鼠(即NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠)進行慢性肝病的機制探索。有趣的是，NEMOΔhepa小鼠的微生物群不同于WT小鼠，并且NEMOΔhepa小鼠腸屏障受損。肝臟中NEMO缺失損害腸道屏障的機制值得未來進一步探究，這可能受膽汁酸成分的變化或系統(tǒng)性炎癥失調的影響。NLRP6 NEMO其他IKK組分的缺失在人類HCC中尚未被報道，本研究所利用的小鼠模型很好地反映了人類肝臟疾病進展的基本機制，為探究NLRP6缺失所引起的腸道生態(tài)失調對肝臟疾病進展的影響提供有力的工具。本研究顯示NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的腸道菌群變化可轉化為與脂肪性肝炎活動性標志物以及腫瘤負荷密切相關的腸道屏障功能受損。NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的微生物群與NEMOΔhepa小鼠存在顯著差異。NLRP6缺失與致病菌Muribaculum豐度增加相關，而A. muciniphila缺失。幾項人類和小鼠研究表明，A. muciniphila通過改善腸屏障功能有益宿主健康。有趣的是，有研究指出在早期HCC患者中發(fā)現(xiàn)A. muciniphila缺失。

為了探究觀察到的表型變化是否是由改變的腸道菌群介導，我們進行了腸道菌群調節(jié)實驗。有趣的是，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的表型可通過糞便移植(FMT)傳播，并在Abx治療時可逆。NEMOΔhepa小鼠NLRP6缺失或者將NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的腸道菌群移植到NEMOΔhepa小鼠中引發(fā)了明顯的肝髓系細胞浸潤(定義為CD11b+Ly6G+Gr1hi)。根據(jù)表面標志物的表達并在體外證實其對T細胞增殖的抑制效應后，將這些細胞稱為mMDSCs。這些動態(tài)變化與T細胞豐度減少有關，表明與腸道菌群相關的肝臟炎癥微環(huán)境具有高度的細胞可塑性。既往研究報道了CD8+ T細胞在HCC中的抗腫瘤活性，但這取決于它們的表型和組織微環(huán)境。它們還可能促進肝損傷并向HCC發(fā)展。未來CD8+ T細胞耗竭實驗可能有助于在該模型中建立因果關系。既往報道認為肝癌發(fā)展過程中Kupffer細胞和巨噬細胞會發(fā)生表型變化并形成促腫瘤微環(huán)境。本研究沒有觀察到Kupffer細胞豐度的變化，肝臟基因表達分析顯示存在促進M2型巨噬細胞極化的微環(huán)境。調節(jié)性T細胞可以在腸道中進行重編程，并可能在肝臟中發(fā)揮其免疫抑制功能。雖然這不是本研究的重點，但未來對該機制的研究可加深對HCC發(fā)展過程中腸道介導的免疫調控的理解。我們假設PRR信號尤其是TLR4可能是這種應答的重要協(xié)調者，本研究發(fā)現(xiàn)52周齡NEMOΔhepa/Tlr4-/-小鼠的MDSCs明顯降低，CD4+T細胞增加，這與腫瘤負荷的降低密切相關。此外，將NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的失調腸道菌群移植到NEMOΔhepa/Tlr4-/-小鼠中并未能促進mMDSCs擴增。這與之前的研究一致，即TLR4介導的PRR信號參與MDSC增殖。但我們不能排除其他PRRs或者菌群依賴的方式所形成的信號回路對肝硬化中炎癥反應的調控。幾乎所有HCC病例都發(fā)生在肝硬化的背景下，由先天和適應性免疫反應介導的慢性炎癥驅動疾病進展。T細胞和B細胞的免疫監(jiān)視也可以限制肝癌的發(fā)生。因此，T細胞和MDSCs之間的相互作用至關重要，因為MDSCs積累可導致T細胞衰竭，從而促進HCC的進展?？傊庖哒{控在肝病惡性轉化的過程中至關重要，探索其中的分子機制可為疾病治療提供新的途徑。腸道菌群可以通過MAMPs、微生物代謝物、膽汁酸以及短鏈脂肪酸等多種方式調控肝臟免疫反應。

在患者中，評估腸道屏障功能、細菌易位及其對肝臟的影響具有挑戰(zhàn)性，因為缺乏良好的非侵入性血清標志物來檢測屏障功能受損和肝臟炎癥。雖然一系列研究已將腸道菌群的變化和宏基因組分析與臨床和組織病理學肝硬化表型聯(lián)系起來，但尚不清楚這些變化是否直接影響肝臟炎癥反應或肝臟轉錄組?；诒狙芯康男∈竽Ｐ?，我們假設細菌易位可能影響晚期肝硬化患者的肝臟炎癥微環(huán)境。因此，本研究通過對肝組織16S rRNA分析評估細菌易位，量化總細菌DNA含量，進行16S rRNA基因擴增子測序并將這些數(shù)據(jù)與來自同一組織樣本的轉錄組數(shù)據(jù)相關聯(lián)。根據(jù)本研究的小鼠數(shù)據(jù)，細菌易位與人類肝硬化中的纖維-炎癥轉錄通路密切相關，表明細菌易位是肝病進展的驅動因素。本研究NEMOΔhepa小鼠的數(shù)據(jù)與一項臨床研究一致，與健康對照組相比，肝硬化患者腸道炎癥(鈣衛(wèi)蛋白)以及通透性(ZO-1和LPS)的血清標志物增加。有趣的是，與對照組相比，NAFLD肝硬化患者屏障功能受損與Akkermansia豐度降低以及循環(huán)mMDSCs降低相關。此外，我們發(fā)現(xiàn)短期調節(jié)NEMOΔhepa小鼠的腸道菌群，可引起mMDSC和T細胞豐度的顯著變化。補充單一細菌Akkermansia muciniphila可改善腸道屏障功能，減少MDSCs的浸潤并抑制脂肪性肝炎活動。總之，這些數(shù)據(jù)需要進一步研究以評估在HCC患者中補充Akkermansia的治療效果。理想的研究將涉及肝臟活檢和菌群樣本的收集，這將建立起腸道菌群與肝臟16S rRNA基因豐度和肝臟轉錄譜的相關性。

最近的一項臨床試驗顯示，連續(xù)3個月每天補充A. muciniphila具有良好的耐受性，改善了肥胖性胰島素抵抗受試者的胰島素敏感性和血脂狀況。與本研究的小鼠數(shù)據(jù)類似，調節(jié)腸道菌群有可能重塑HCC患者的肝臟炎癥環(huán)境，這一假設也受到一系列強調腸道菌群在免疫檢查點治療中的作用的研究的啟發(fā)。最近的研究將Akkermansia的豐度與良好的治療效果聯(lián)系起來，但在治療前攝入廣譜抗生素會導致腸道生態(tài)失調，從而損害治療反應。盡管研究的肝硬化組織可能無法具體反映HCC微環(huán)境，但觀察到的肝臟16S rRNA豐度與纖維-炎癥通路的表達、癌癥免疫抑制基因以及MDSCs、T細胞耗竭和PRR信號通路等與HCC疾病進展密切相關。推測肝臟16S rRNA基因豐度可作為腸道屏障受損和生態(tài)失調的生物標志物，有助于預測對免疫療法的治療反應，并識別可能受益于菌群調節(jié)治療的患者。基于PCR的檢測可以在標準的臨床活檢工作流程中輕松實施。本研究的局限性是功能微生物群調節(jié)研究僅在小鼠中進行，還需要在臨床上進行大規(guī)模研究。基于本研究的腸道菌群分析以及其他關于A. muciniphila和腸道穩(wěn)態(tài)的研究，我們將功能實驗集中在這種共生菌上。本研究發(fā)現(xiàn)NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中Blautia的豐度也有所降低。既往研究認為Blautia可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，進而發(fā)揮抗炎效應。Blautia或其他共生菌株也可能具有保護作用。未來的研究可以探索Blautia在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用。最后，使用無菌小鼠進行的菌群調節(jié)實驗將提高實驗的準確性，以此來探究Nlrp6-/-小鼠腸道菌群的轉移是否導致HCC發(fā)展將會很有趣。本研究中RNA測序數(shù)據(jù)將細菌易位與纖維-炎癥通路以及參與T細胞衰竭的TF表達聯(lián)系起來。但未來研究需要涉及蛋白質和組織學數(shù)據(jù)以進一步證實這些發(fā)現(xiàn)。

結論

綜上，本研究基于小鼠模型和人類臨床研究數(shù)據(jù)，表明腸道菌群直接影響肝臟炎癥微環(huán)境。NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的失調不良菌群可傳播至NEMOΔhepa小鼠，通過促進mMDSCs和抑制CD8+ T細胞加劇肝臟疾病進展。重要的是，通過調控腸道菌群重塑炎癥微環(huán)境，為微生物群靶向治療提供了合理的依據(jù)。肝硬化患者的肝組織微生物群與肝轉錄組特征的關聯(lián)仍需要大規(guī)模的研究來評估其診斷應用。

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