液體活檢的目標與方法

腫瘤的液體活檢主要包括循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）、游離腫瘤細胞（CTC）及外泌體（exosome）。眾多研究表明三者與腫瘤的早診、治療、預后等均存在相關性。目前在臨床應用最多的當屬ctDNA檢測。

正常人的體液內亦存在來自于機體正常細胞的游離DNA，簡稱循環(huán)游離DNA或cfDNA；在腫瘤患者體內，循環(huán)游離DNA不僅僅來自于正常細胞，還有一部分來自于腫瘤細胞，即ctDNA，也是循環(huán)游離DNA的一部分，因此我們可以通過檢測ctDNA相關變異狀態(tài)作為來自腫瘤細胞的標志物。目前臨床腫瘤ctDNA檢測最常見的應用領域為治療方案選擇及耐藥監(jiān)測。

由于ctDNA具有片段化程度高、豐度低等特點，其主流檢測方法包括Cobas法、Super-ARMS法、高通量二代測序（NGS）及數(shù)字PCR。

液體活檢的運用與優(yōu)勢

液體活檢最大的優(yōu)勢在于微創(chuàng)、快捷，易于動態(tài)監(jiān)測；一定程度上全面反映腫瘤整體變異狀態(tài)，不受腫瘤異質性影響；適用人群更廣泛，對于難以取得活檢腫瘤組織或取得腫瘤組織不夠基因檢測的患者，液體活檢提供了一個了解腫瘤基因變異狀態(tài)的有效途徑。

1. 早期診斷

腫瘤的早期診斷最大難點是由于腫瘤負荷很低，可能影像學上沒有明確的病灶，此時血液中ctDNA的含量亦極低，普通針對ctDNA突變的檢測難以滿足早診的要求。

但DNA甲基化改變是貫穿整個惡性轉化的表觀遺傳學改變。即使在腫瘤發(fā)展的最早期，DNA甲基化模式也已經與正常細胞存在顯著差異；其次，甲基化水平的改變是具有組織特異性的，即對甲基化進行檢測及比對，能夠進行器官溯源，發(fā)現(xiàn)到底是哪里可能會發(fā)生或已經發(fā)生了腫瘤。

因此，對ctDNA的甲基化水平進行檢測，是一種有效的腫瘤早期篩查輔助手段。比如SEPT9基因甲基化檢測試劑盒對結直腸癌診斷的敏感度及特異性可達74.8%及97.5%[1]，現(xiàn)在已經可以作為一種結腸鏡前的初篩手段。

2. 指導靶向治療

腫瘤的靶向治療是目前臨床最常見的ctDNA檢測應用。根據《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》，如果有腫瘤組織，推薦使用腫瘤組織進行驅動基因檢測；若無腫瘤組織樣本或腫瘤組織樣本不足的情況下，液體活檢可作為很多患者基因檢測的首選。

無論何種檢測方式，應注意的是若組織活檢或者液體活檢有任何一個是陽性，患者應當考慮使用靶向藥物；當液體活檢先行的時候，若液體活檢為陰性，應提示患者可能存在假陰性，必要時再取活檢，以避免錯失可能的靶向治療機會。

3. 耐藥監(jiān)測

靶向治療終歸面臨耐藥的問題，而液體活檢由于微創(chuàng)快捷的優(yōu)勢，是理想的耐藥監(jiān)測材料。對于EGFR一代或者二代TKI用藥人群，約半數(shù)以上的患者出現(xiàn)EGFR 20號外顯子T790M而耐藥，因此對于此類患者的耐藥監(jiān)測可使用敏感度高且成本低的數(shù)字PCR法對T790M單點進行監(jiān)測。如果患者已經出現(xiàn)了耐藥，亟需探索其耐藥機制以更換治療方案，此時推薦使用NGS對基因變異的整體狀態(tài)進行檢測，以便全面尋找耐藥原因。

4. 預后評估

在預后評估方面，微小殘留病變（MRD）是目前研究的熱點。MRD指的是治療后傳統(tǒng)影像學和實驗室方法無法發(fā)現(xiàn)，但通過分子診斷可以發(fā)現(xiàn)的腫瘤來源的分子異常。多種腫瘤的相關研究表明，ctDNA突變狀態(tài)可提示接受根治性治療的患者的預后復發(fā)，并且已經在部分臨床實驗中得到應用。

液體活檢的樣本采集要求

血液的規(guī)范化處理是保證液體活檢結果準確的基本前提。在血液樣本的送檢方面應注意：

1.采血管的選擇

ctDNA檢測的血液需使用EDTA抗凝管或者cfDNA專用采血管。若使用EDTA抗凝管，血液離體后應盡量保存于4℃，2小時內需盡快進行血漿分離；若使用cfDNA專用采血管，血液可在常溫保存3-5天。切記嚴禁使用肝素抗凝管，因為肝素在后續(xù)DNA提取過程中難以去除，并且會抑制PCR反應，導致后續(xù)ctDNA檢測失敗。

2.采血量及采血注意事項

一般而言，ctDNA檢測需要采集8-10ml的全血。采血后嚴禁劇烈震蕩血液，或者使用注射器針頭對血液進行轉移，因為這樣的操作均會導致血液中細胞破裂，從而造成基因組DNA的污染，增加ctDNA檢測的假陰性。采血后應輕柔將采血管顛倒8-10次進行混勻。

3. 患者采血時間的選擇

一般建議患者空腹進行抽血，特別是血脂較高的患者。這是由于低密度脂蛋白對熒光有屏蔽和吸收的作用，會干擾后續(xù)ctDNA的相關檢測；三酰甘油會降低ctDNA的提取率；若使用微滴式數(shù)字PCR檢測技術，血液中的脂質會影響后續(xù)微滴的生成。此外，對于正在進行化療的患者，一般建議患者化療結束后進行抽血。

參考資料：

[1] Jin P, Kang Q, Wang X, Yang L, Yu Y, Li N, et al. Performance of a second-generation methylated SEPT9 test in detecting colorectal neoplasm. Journal of gastroenterology and hepatology. 2015 May;30(5):830-3. PubMed PMID: 25471329.

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網址: 一文讀懂液體活檢 http://www.u1s5d6.cn/newsview896636.html