在當(dāng)前的癌癥治療策略中，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是關(guān)鍵一環(huán)。腫瘤細(xì)胞通過(guò)抑制正常的凋亡機(jī)制，實(shí)現(xiàn)了不受控制的增殖?；蚓庉嫾夹g(shù)，尤其是CRISPR-Cas9系統(tǒng)，因其能夠精準(zhǔn)調(diào)控細(xì)胞功能而備受關(guān)注。然而，如何在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)該系統(tǒng)的精準(zhǔn)控制仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。結(jié)合磁熱療法，利用其高滲透性和低毒性，通過(guò)控制熱效應(yīng)與CRISPR-Cas9技術(shù)協(xié)同作用，可以開(kāi)發(fā)出一種新型的腫瘤治療方法。這種磁熱與基因編輯相結(jié)合的療法展現(xiàn)出顯著的治療潛力，為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供了新的策略。

近期，中國(guó)科學(xué)院上海硅酸鹽研究所在《Journal of Nanobiotechnology》（1區(qū)Top，影響因子：10.6）期刊上發(fā)表了一篇題為"Magnetothermal-activated gene editing strategy for enhanced tumor cell apoptosis"的研究論文。這項(xiàng)研究提出了一種全新的基因編輯策略--磁熱激活基因編輯技術(shù)，并開(kāi)發(fā)了一種創(chuàng)新的磁熱激活CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)。該系統(tǒng)精準(zhǔn)地靶向腫瘤細(xì)胞的HSP70和BCL2基因，顯著增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的凋亡，為癌癥治療提供了新的可能性。

磁熱療法以其高滲透性和低毒性成為理想的治療手段，但單獨(dú)使用難以完全誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。將磁熱療法與CRISPR-Cas9系統(tǒng)結(jié)合，能夠在中等溫度下提高腫瘤細(xì)胞凋亡率。研究開(kāi)發(fā)了一種磁熱納米粒子平臺(tái)，利用交變磁場(chǎng)控制的熱效應(yīng)與CRISPR-Cas9系統(tǒng)的協(xié)同作用，靶向HSP70和BCL2基因，從而增強(qiáng)治療效果，并減少對(duì)正常組織的損傷。這種磁熱-基因編輯療法顯示出在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用的良好潛力。

一、納米基因編輯系統(tǒng)MPDH的制備與特征

為了制備MPDH納米基因編輯系統(tǒng)，研究人員首先采用種子介導(dǎo)法合成了磁熱納米粒子MNPs（ZnCoFe2O4 @ ZnMnFe2O4）。這些納米顆粒的尺寸約為15.3nm，具有優(yōu)異的單分散性。通過(guò)使用C18-PEI對(duì)納米顆粒表面進(jìn)行修飾，研究人員提高了細(xì)胞攝取效率和質(zhì)粒DNA的負(fù)載能力，從而獲得了能夠在水和PBS中穩(wěn)定分散的MP納米顆粒。傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）和熱重分析（TGA）證實(shí)了表面改性的成功，為后續(xù)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。MPDH納米基因編輯系統(tǒng)通過(guò)靜電吸附質(zhì)粒，有效結(jié)合Cas9，并展現(xiàn)出穩(wěn)定的尺寸和分散性。

為了評(píng)估MPDH納米粒子的磁熱性能，研究人員在1.7 mT的安全磁場(chǎng)強(qiáng)度下進(jìn)行了測(cè)試。MPDH的飽和磁化強(qiáng)度為75.4 emu/g，顯著高于傳統(tǒng)的鐵或氧化鐵磁性納米顆粒。在1.35 kA·m的交變磁場(chǎng)下，MPDH的溫度在4 mg/mL濃度時(shí)可以從28°C迅速升高至42°C，適合用于輕度磁熱治療。紅外熱成像顯示了MPDH的溫度-時(shí)間分布，通過(guò)循環(huán)實(shí)驗(yàn)和長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)證明了其磁熱性能的穩(wěn)定性和重復(fù)性，溫度穩(wěn)定在42°C左右。這些結(jié)果表明，質(zhì)粒可以通過(guò)高效的pH響應(yīng)和熱響應(yīng)進(jìn)行釋放，為腫瘤靶向基因編輯和精準(zhǔn)醫(yī)療提供了理想的特性。

圖1納米基因編輯系統(tǒng)MPDH的制備與表征

二、體外溫和磁熱驅(qū)動(dòng)的抗凋亡基因組破壞

在體外治療研究中，研究人員首先使用Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 評(píng)估了MP/MPD/MPDH納米顆粒的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，這些納米顆粒在不同濃度下對(duì)4T1細(xì)胞幾乎沒(méi)有顯著毒性，表明其良好的生物相容性。特別是MPFD處理的4T1細(xì)胞在200-800 μg/mL濃度范圍內(nèi)顯示出更高的細(xì)胞活性，可能由于透明質(zhì)酸（HA）中和了聚乙烯亞胺（PEI）表面的過(guò)量正電荷。MPFD納米顆粒對(duì)正常C166小鼠內(nèi)皮細(xì)胞也表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MPDH納米顆粒在4T1細(xì)胞中的內(nèi)化效率高于C166細(xì)胞，表明HA修飾增強(qiáng)了MPDH的靶向性。共聚焦成像顯示，納米顆粒逐漸與溶酶體共定位，并且PEI的質(zhì)子海綿效應(yīng)有助于內(nèi)體逃逸，從而促進(jìn)質(zhì)粒釋放進(jìn)入細(xì)胞核。

在磁熱觸發(fā)基因編輯方面，使用HSP70啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EGFP質(zhì)粒評(píng)估轉(zhuǎn)染效率時(shí)，磁熱處理組的EGFP熒光顯著強(qiáng)于未經(jīng)磁熱誘導(dǎo)的組。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，輕度磁熱組的EGFP陽(yáng)性率為52.6%，磁熱處理20分鐘后，EGFP陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)到最高（61.4%）。這表明磁熱控制CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠精確調(diào)控基因編輯，減少非特異性編輯事件。

圖2 MP/MPD/MPDH 納米顆粒的細(xì)胞毒性的評(píng)估

三、溫和磁熱聯(lián)合基因編輯的治療潛力的探索

在4T1腫瘤細(xì)胞的基因編輯中，結(jié)合輕度磁熱的處理顯著增強(qiáng)了基因編輯效果，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。磁熱處理組（MH）和MPDH聯(lián)合磁熱處理組（MPDH+MH）的細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，其中MPDH+MH組的凋亡率達(dá)到95.8%。此外，CCK-8測(cè)定結(jié)果顯示MPDH+MH組顯著抑制了腫瘤細(xì)胞增殖，顯示了其良好的治療潛力。這些結(jié)果表明，靶向腫瘤凋亡相關(guān)基因的磁熱療法可以有效地上調(diào)腫瘤細(xì)胞凋亡并下調(diào)增殖。

研究人員通過(guò)Western blot分析了MPDH+MH在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用，發(fā)現(xiàn)MPDH+MH處理組中促凋亡蛋白Bax、caspase-3和細(xì)胞色素C表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2和HSP70表達(dá)下調(diào)。MPDH+MH組的促凋亡蛋白表達(dá)最高，抗凋亡蛋白表達(dá)最低。溫和磁熱和CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡中表現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應(yīng)，通過(guò)雙重調(diào)控HSP70和Bcl-2實(shí)現(xiàn)，磁熱激活了熱休克反應(yīng)通路，降低了HSP70和Bcl-2的表達(dá)，CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)一步降低了相關(guān)基因表達(dá)。這種機(jī)制促進(jìn)了細(xì)胞色素C的釋放和凋亡信號(hào)通路的激活。T7核酸內(nèi)切酶I（T7E1）測(cè)定法顯示MPDH+MH聯(lián)合處理組的HSP70和BCL2基因組突變頻率顯著高于單獨(dú)處理組，qRT-PCR結(jié)果也證實(shí)了MPDH+MH組HSP70和BCL2 mRNA表達(dá)顯著降低。這表明磁熱激活的納米基因編輯系統(tǒng)能夠高效、準(zhǔn)確地編輯腫瘤相關(guān)基因，為體外基因治療提供了一種潛在的新策略。

圖3 磁熱激活的納米基因編輯系統(tǒng)編輯腫瘤相關(guān)基因的潛力評(píng)估

四、磁熱介導(dǎo)的基因編輯在體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤凋亡

為了評(píng)估磁熱增強(qiáng)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的體內(nèi)腫瘤凋亡誘導(dǎo)和生長(zhǎng)抑制能力，研究人員利用4T1荷瘤小鼠模型評(píng)估。小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、MPDH治療組、磁熱治療（MH）組和MPDH聯(lián)合輕度磁熱療（MPDH+MH）組。經(jīng)過(guò)MPDH納米顆粒注射后，MH和MPDH+MH組的小鼠接受了為期三天的輕度磁熱治療。結(jié)果顯示，MPDH+MH組顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞死亡率高，腫瘤大小顯著減少，且在治療第35天生存率達(dá)到80%，而MH組僅為30%。所有治療組的體重變化無(wú)顯著差異，表明對(duì)小鼠整體健康影響較小。

圖4 磁熱介導(dǎo)的基因編輯的體內(nèi)抗腫瘤療效

為了驗(yàn)證治療效果，研究人員對(duì)腫瘤組織進(jìn)行了蘇木精和伊紅（H&E）染色和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）染色。正如H&E染色和TUNEL分析所揭示的那樣，與其他治療組相比，MPDH + MH組在腫瘤組織中的凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)量顯著增加。5Ki-67抗體染色也證實(shí)了MPDH+MH組對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖活性的顯著抑制，從而驗(yàn)證了MPDH+MH的顯著腫瘤抑制作用。

為了評(píng)估MPDH的體內(nèi)基因編輯效果，研究人員使用Western blot分析和深度測(cè)序法對(duì)腫瘤組織中的HSP70和BCL2表達(dá)進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果顯示，MPDH + MH治療組的HSP70和BCL2蛋白表達(dá)水平顯著降低，mRNA分析進(jìn)一步確認(rèn)了基因的有效敲低。此外，通過(guò)DNA測(cè)序，MPDH + MH組的HSP70和BCL2基因突變頻率分別為7.6%和27.8%。治療后，進(jìn)行了小鼠的全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清生化分析以及器官的組織病理學(xué)檢查，未發(fā)現(xiàn)明顯的器官損傷或炎癥，血液和肝腎功能指標(biāo)均正常。這些結(jié)果表明，MPDH結(jié)合磁熱的基因編輯治療系統(tǒng)在治療過(guò)程中具有良好的生物安全性。

圖5 磁熱聯(lián)合基因編輯治療系統(tǒng)的生物安全性評(píng)估

綜上所述，這項(xiàng)研究創(chuàng)造性地設(shè)計(jì)了一種熱響應(yīng)型納米系統(tǒng)，利用磁熱效應(yīng)在腫瘤細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的精確基因編輯。通過(guò)外部磁場(chǎng)誘導(dǎo)的溫和加熱，該系統(tǒng)能夠調(diào)控HSP70和BCL2等關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，從而對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行針對(duì)性的殺傷。這種方法在保護(hù)周圍健康組織的同時(shí)，顯著提高了腫瘤治療的效率和特異性。這一CRISPR-Cas9技術(shù)的進(jìn)展為腫瘤治療提供了一種新的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)策略，并為臨床應(yīng)用帶來(lái)了潛在的前景。

原文鏈接： https://doi.org/ 10.1186/s12951-024-02734-8

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