導(dǎo)讀  

傳統(tǒng)研究認(rèn)為，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的核心癥狀是由遺傳突變影響了大腦的發(fā)育及功能而引起的。但是，腸道微生物群作為另一個(gè)重要的變量，也會(huì)影響特定行為的發(fā)生。因此，明白宿主遺傳突變、腸道微生物群及其二者間互作在個(gè)體復(fù)雜行為中的作用至關(guān)重要。我們的研究意外的發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)發(fā)育障礙模型小鼠（Cntnap2 -/-小鼠）的遺傳突變和腸道微生物群調(diào)節(jié)了不同的社會(huì)適應(yīng)不良行為。Cntnap2 -/-小鼠的多動(dòng)癥表型由宿主遺傳突變引起，而社交行為表型是由腸道微生物群介導(dǎo)的。有趣的是，特定的微生物干預(yù)通過(guò)上調(diào)四氫生物蝶呤合成途徑中的代謝物選擇性地改善了Cntnap2 -/-小鼠的社交缺陷。我們的研究表明導(dǎo)致Cntnap2 -/-小鼠行為異常的原因可能不盡相同（如遺傳因素與微生物因素），因此本研究可能會(huì)改變我們對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究及治療方法的看法。

論文ID

原名：Dissecting the contribution of host genetics and the microbiome in complex behaviors

譯名：深入剖析遺傳因素和微生物因素在宿主復(fù)雜行為中的作用

期刊：Cell

IF：38.637

發(fā)表時(shí)間：2021.3.10

通訊作者：Mauro Costa-Mattioli

通訊作者單位：美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)系

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

圖文摘要

為了探究遺傳因素和微生物因素在宿主復(fù)雜性為中的作用，MauroCosta-Mattioli等人選擇Cntnap2 -/-小鼠、其野生型和無(wú)菌野生型小鼠作為主要研究對(duì)象。Cntnap2 -/-小鼠，是經(jīng)典的Cntnap2基因（接觸蛋白相關(guān)蛋白2基因，又稱(chēng)自閉癥基因）敲除所致的神經(jīng)發(fā)育障礙模型，表現(xiàn)出類(lèi)似自閉癥譜系疾?。ˋSD）的社交能力受損以及多動(dòng)癥行為。為了明確Cntnap2敲除對(duì)小鼠行為的影響，作者通過(guò)以下7個(gè)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行層層遞進(jìn)的分析研究：  1）比較孤立繁殖體系所得的Cntnap2 -/-（KO-I）和 Cntnap2+/+（WT-I）小鼠差異，檢測(cè)其社交行為及自發(fā)活動(dòng)，并對(duì)其菌群進(jìn)行測(cè)序分析；  2）為了驗(yàn)證社交行為表型是由腸道菌群導(dǎo)致而自發(fā)活動(dòng)表型是由遺傳因素（即Cntnap2敲除）所導(dǎo)致的，研究者進(jìn)行了下面三個(gè)實(shí)驗(yàn)。  ①KO-I小鼠和WT-I小鼠同籠飼養(yǎng)；  ②通過(guò)Cntnap2 -/+雜交小鼠繁育所得的同窩出生的Cntnap2 -/-（KO-L）和 Cntnap2+/+（WT-L）小鼠分籠飼養(yǎng)；  ③將上述①和②四組小鼠（KO-I，KO-L，WT-I，WT-L）的腸道微生物通過(guò)糞菌移植（FMT）的方法移植給無(wú)菌小鼠（GF）；  3）為了證實(shí)羅伊氏乳桿菌（Lactobacillusreuteri，L. reuteri）干預(yù)是否可以改善Cntnap2 -/-小鼠社交障礙，通過(guò)qPCR方法檢測(cè)了KO-I組小鼠糞便菌群中羅伊氏乳桿菌的豐度，并且通過(guò)給年幼的KO-I小鼠補(bǔ)充羅伊氏乳桿菌，檢測(cè)其社交行為及自發(fā)活動(dòng)；  4）為了證明羅伊氏乳桿菌改善不同ASD小鼠模型的突觸缺陷是否通過(guò)催乳素依賴(lài)的方式。研究者比較了KO-I和WT-I組小鼠VTA神經(jīng)元的電生理學(xué)改變；  5）為了評(píng)估羅伊氏乳桿菌是否影響與社會(huì)行為有關(guān)的其他大腦區(qū)域的突觸傳遞，研究者檢測(cè)了KO-I和WT-I小鼠的內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（mPFC）中的微型興奮性突觸后電流（mEPSCs）；  6）為了研究羅伊氏乳桿菌改善KO-I小鼠社會(huì)缺陷的機(jī)制，研究者通過(guò)非特異性腸道代謝組學(xué)分析了KO-I和WT-I小鼠的糞便代謝產(chǎn)物；  7）為了驗(yàn)證單獨(dú)用BH4干預(yù)是否可以選擇性地逆轉(zhuǎn)KO-I小鼠的社交缺陷研究者比較了KO-I小鼠經(jīng)口灌胃給予BH4或溶劑后其社交行為及自發(fā)活動(dòng)；  8）為了探索了羅氏乳酸菌對(duì)社會(huì)行為的影響是否依賴(lài)于生物蝶呤途徑，研究者改變了羅伊氏乳桿菌治療后的Cntnap2 -/-（KO-I）小鼠的BH4生物合成途徑，并檢測(cè)其社交行為及自發(fā)活動(dòng)變化。     主要實(shí)驗(yàn)方法包括：   糞菌移植實(shí)驗(yàn)；行為學(xué)實(shí)驗(yàn)；動(dòng)物三箱社交自由探索實(shí)驗(yàn)；社交互動(dòng)實(shí)驗(yàn)；16S rRNA基因測(cè)序；微生物基因功能預(yù)測(cè)；定量PCR（qPCR）細(xì)菌定量；羅伊氏乳桿菌的培養(yǎng)及處理；電生理記錄；免疫熒光；催產(chǎn)素給藥實(shí)驗(yàn)；代謝組學(xué)分析；四氫生物蝶呤（BH4）給藥實(shí)驗(yàn)；催產(chǎn)素受體拮抗劑給藥實(shí)驗(yàn)；SPRi3給藥實(shí)驗(yàn)。  

結(jié)果

1 在神經(jīng)發(fā)育遺傳缺陷的小鼠中，不同繁育方式影響其行為及腸道菌群通過(guò)動(dòng)物三箱社交自由探索實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)孤立繁殖體系所得的Cntnap2 -/-（KO-I）和 Cntnap2+/+（WT-I）小鼠其社交能力及社交新奇偏好，如前人所報(bào)道，KO-I小鼠表現(xiàn)出明顯的社交能力缺陷（圖1C）及社交新奇偏好降低（圖1D）。KO-I小鼠不愿與陌生小鼠交流并且也不會(huì)對(duì)新來(lái)的小鼠感到好奇。因此，在社交互動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，KO-I小鼠之間的相互交流也較WT-I小鼠更少（圖1E）。通過(guò)尋找埋藏食物實(shí)驗(yàn)我們可以發(fā)現(xiàn)，KO-I小鼠嗅覺(jué)并無(wú)異常（Mann-Whitney U =66, P = 0.7444)，這證實(shí)該小鼠的社交缺陷并非嗅覺(jué)異常所致。此外，KO-I小鼠在自發(fā)活動(dòng)中表現(xiàn)出多動(dòng)癥樣的行為（圖1F-G），這與其他研究是一致的。因此，我們證明孤立繁殖體系所得的Cntnap2 -/-小鼠存在顯著的社交能力缺陷及多動(dòng)癥行為。有研究報(bào)道自閉癥病人存在腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變。因此我們通過(guò)16S rRNA測(cè)序分析了本組實(shí)驗(yàn)中小鼠的腸道菌群。PCA分析、PCoA分析（分別用Bray–Curtis差異矩陣和未加權(quán)UniFrac距離）分析都證實(shí)上述兩組小鼠腸道菌群β多樣性存在顯著差異（圖1H、圖S1B及圖S1C）。分析Shannon指數(shù)來(lái)評(píng)估其菌群的α多樣性發(fā)現(xiàn)，KO-I小鼠腸道菌群豐度較WT-I小鼠更高（圖S1D-E）。此外，33個(gè)擴(kuò)增子序列變異（ASVs）及33個(gè)通過(guò)PICRUSt2預(yù)測(cè)的微生物代謝途徑在兩組見(jiàn)存在顯著差異（圖1I和圖S1F-H）。因此，孤立繁殖體系所得的Cntnap2 -/-小鼠的腸道菌群與Cntnap2+/+的存在顯著差異。 

圖1 孤立繁殖體系所得的Cntnap2 -/-小鼠與其野生型相比存在社交能力缺陷、多動(dòng)癥及不同的腸道菌群結(jié)構(gòu)。（A）孤立繁育體系（Cntnap2 -/-：KO-I；Cntnap2+/+：WT-I）。（B）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。（C-D）動(dòng)物三箱社交自由探索實(shí)驗(yàn)（每組n = 17; C, 社交能力: WT-I: t = 7.508, P< 0.0001; KO-I:t = 1.01, P = 0.6322; 兩因素方差分析: F1,64= 21.11, P < 0.0001; D, 社交新奇偏好: WT-I: t = 6.386,P < 0.0001; KO-I: t = 0.2782, P > 0.9999; 兩因素方差分析, F1,64= 18.65, P < 0.0001）。（E）社交互動(dòng)實(shí)驗(yàn)（每組n = 15–16, Mann-Whitney U = 52.50, P = 0.0065）。（F-G）動(dòng)物三箱社交自由探索實(shí)驗(yàn)的習(xí)慣階段檢測(cè)的自發(fā)活動(dòng)程度（每組n = 17; (F), 總距離: WT-I vs. KO-I: Mann-Whitney U = 42, P = 0.0002; (G), 平均速度: WT-I vs. KO-I: Mann-Whitney U = 42.5, P = 0.0002）。（H）PCA分析腸道菌群β多樣性（PERMANOVA: R2 = 0.35732, P = 0.0002）。（I）ASVs系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（內(nèi)圈代表組間差異ASVs，綠色：KO中增加；白色：無(wú)差異；紫色：WT中增加。外圈代表Benjamini-Hochberg FDR校正后結(jié)果，白色：P ≥ 0.05；黑色：P < 0.05），直方圖為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。
 有學(xué)者認(rèn)為只有使用同窩對(duì)照時(shí)所得的遺傳突變表型差異證據(jù)才更為確鑿，因此，我們通過(guò)Cntnap2 -/+雜交小鼠繁育所得的同窩出生的Cntnap2 -/-（KO-L）和 Cntnap2+/+（WT-L）小鼠重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。不出意外，KO-L小鼠依然存在顯著的多動(dòng)癥表現(xiàn)（圖2F-G）。但是令人驚訝的是，KO-L小鼠的社交行為是正常的（圖2C-E）。不論是α多樣性還是β多樣性，抑或是ASVs 或菌群代謝通路，KO-L小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與WT-L小鼠沒(méi)有顯著差異（圖2H-I）。因此，同窩出生的Cntnap2 -/-小鼠與 Cntnap2+/+小鼠比較存在多動(dòng)癥表型，但是其社交能力及腸道菌群無(wú)顯著差異。 

圖2 同窩繁殖體系所得的Cntnap2 -/-小鼠與其野生型相比社交能力正常、腸道菌群結(jié)構(gòu)相似，但仍然存在多動(dòng)癥表現(xiàn)。（A）同窩繁育體系（Cntnap2 -/-：KO-L；Cntnap2+/+：WT-L）。（B）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。（C-D）動(dòng)物三箱社交自由探索實(shí)驗(yàn)（每組n = 14; C, 社交能力: WT-L: t = 5.856, P < 0.0001; KO-L: t = 7.849,P < 0.0001; 兩因素方差分析: F1,52= 1.938, P < 0.1650; D, 社交新奇偏好: WT-L: t = 2.415,P = 0.0386; KO-L: t = 3.145, P = 0.0055; 兩因素方差分析, F1,52= 0.266, P = 0.6082）。（E）社交互動(dòng)實(shí)驗(yàn)（每組n = 16, Mann-Whitney U = 124, P = 0.897）。（F-G）動(dòng)物三箱社交自由探索實(shí)驗(yàn)的習(xí)慣階段檢測(cè)的自發(fā)活動(dòng)程度（每組n = 14; (F), 總距離: WTL vs. KO-L: Mann-Whitney U = 42, P = 0.0091; (G), 平均速度: WT-L vs. KO-L: Mann-Whitney U = 42.5, P = 0.0095）。（H）PCA分析腸道菌群β多樣性（PERMANOVA:R2 =0.04440, P = 0.26975）。（I）ASVs系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（內(nèi)圈代表組間差異ASVs，綠色：KO中增加；白色：無(wú)差異；紫色：WT中增加。外圈代表Benjamini-Hochberg FDR校正后結(jié)果，白色：P ≥ 0.05；黑色：P < 0.05），直方圖為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。
 2 在神經(jīng)發(fā)育遺傳缺陷的小鼠中，腸道菌群選擇性改變社交行為而非自發(fā)活動(dòng)使用同窩對(duì)照時(shí)所得的遺傳突變表型差異可以說(shuō)是研究遺傳易感性表型的金標(biāo)準(zhǔn)，但是對(duì)于腸道菌群而言，同窩飼養(yǎng)本身就可能導(dǎo)致菌群改變從而掩蓋了菌群對(duì)行為的影響。通過(guò)上述研究我們假設(shè)， 社交行為表型是由腸道菌群導(dǎo)致而自發(fā)活動(dòng)表型是由遺傳因素（即 Cntnap2敲除）所導(dǎo)致的。為了驗(yàn)證該假設(shè)，我們進(jìn)行了下面三個(gè)實(shí)驗(yàn)。1）將KO-I小鼠和WT-I小鼠同籠飼養(yǎng)；2）將原來(lái)同籠飼養(yǎng)的WT-L和KO-L小鼠分籠飼養(yǎng)；3）將上述四組小鼠（KO-I，KO-L，WT-I，WT-L）的腸道微生物通過(guò)糞菌移植（FMT）的方法移植給無(wú)菌小鼠（GF）。對(duì)于同籠飼養(yǎng)的KO-I小鼠和WT-I小鼠（圖3A-B），他們的腸道菌群可以相互影響最終趨于一致。我們發(fā)現(xiàn)同籠飼養(yǎng)的KO-I小鼠和WT-I小鼠菌群結(jié)構(gòu)相似，不存在顯著不同的ASVs 或菌群代謝通路（圖3I），組間α多樣性（菌群豐度）和β多樣性（PCA分析）差異（PERMANOVA R2= 0.11, P = 0.044）較孤立繁育的KO-I小鼠和WT-I小鼠組間的差異小（PERMANOVA R2= 0.36, P = 0.0002）。重要的是，同籠飼養(yǎng)的KO-I小鼠社交行為恢復(fù)正常（圖3C-E）但是仍然存在多動(dòng)癥行為（圖3F-G）。將原來(lái)同籠飼養(yǎng)的WT-L和KO-L小鼠分籠飼養(yǎng)并繁育得到的下一代（WT-T和KO-T，圖4A-B），我們發(fā)現(xiàn)KO-T小鼠雖然社交能力正常，但是社交新奇偏好顯著降低（圖4C-D），該指標(biāo)與ASDs癥狀密切相關(guān)，因此我們認(rèn)為KO-T 小鼠存在社交缺陷。此外，KO-T 小鼠較WT-T小鼠多動(dòng)癥行為更明顯（圖 4F -G）。KO-T小鼠腸道菌群與WT-T存在顯著差異（圖4H-I），表現(xiàn)在他們間有73個(gè)差異ASVs和44個(gè)微生物代謝通路不同。因此，該實(shí)驗(yàn)證明分籠飼養(yǎng)負(fù)向調(diào)節(jié)了KO小鼠的社交行為并且改變其菌群結(jié)構(gòu)，但是對(duì)于多動(dòng)癥行為沒(méi)有顯著影響。最后，為了排除親代飼養(yǎng)及其他變量對(duì)行為的影響，并且分析菌群改變對(duì)Cntnap2 -/-小鼠行為影響的因果關(guān)系，我們將WT-I、KO-I、WT-L、KO-I組小鼠的腸道菌群通過(guò)糞菌移植的方法移植給無(wú)菌（GF）小鼠（圖5A）。同其他無(wú)菌動(dòng)物糞菌移植試驗(yàn)一樣，糞菌移植后各組的菌群很大程度上保持了所移植的菌群特征（圖S3）。與其他研究一致，GF小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)為社交能力缺陷和較高社交新奇偏好的特點(diǎn)。不同組糞菌移植后的GF小鼠與其所移植糞便來(lái)源的小鼠表現(xiàn)出幾乎相同的行為。移植WT小鼠來(lái)源的糞便后（GF：WT-I，GF：WT-L），GF小鼠的社交能力缺陷均有所改善（圖5B-C）。對(duì)于移植了KO小鼠來(lái)源糞便的GF，僅KO-L組糞菌移植的GF小鼠（GF：KO-L）社交障礙得到了改善，KO-I組糞菌移植GF小鼠（GF：KO-I）社交障礙依然存在（圖5B-C）。因此，這些數(shù)據(jù)證實(shí)KO-I組小鼠可能缺少一些對(duì)于社交行為至關(guān)重要的一種或幾種腸道細(xì)菌。因?yàn)镕MT并沒(méi)有改變移植后GF小鼠的多動(dòng)癥（圖5D-E），所以本研究結(jié)果證明Cntnap2 -/-小鼠的社會(huì)缺陷是由微生物組的改變導(dǎo)致的。 

圖3 同籠飼養(yǎng)逆轉(zhuǎn)了KO-I組小鼠的社交缺陷并且導(dǎo)致了相似的腸道菌群結(jié)構(gòu)，但是并沒(méi)有逆轉(zhuǎn)多動(dòng)癥表現(xiàn)。（A-B）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。（C-D）通過(guò)動(dòng)物三箱社交自由探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)同籠飼養(yǎng)的WI-I和KO-I小鼠的社交行為（每組n = 31-32; C, 社交能力: 同籠飼養(yǎng)的WT-I: t = 9.442, P < 0.0001; 同籠飼養(yǎng)的KO-I: t = 9.284, P < 0.0001; 兩因素方差分析: F1,122 = 0.04696, P =0.8288; D, 社交新奇偏好: 同籠飼養(yǎng)的WT-I: t = 3.666, P = 0.0007;同籠飼養(yǎng)的 KO-I: t = 3.066, P = 0.0053; 兩因素方差分析, F1,122= 0.2135, P = 0.6448）。（E）通過(guò)社交互動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)同籠飼養(yǎng)的WI-I和同籠飼養(yǎng)的KO-I小鼠的社交行為（每組n = 22, 同籠飼養(yǎng)的WI-I vs.同籠飼養(yǎng)的KO-I, Mann-WhitneyU = 192, P = 0.2456）。（F-G）動(dòng)物三箱社交自由探索實(shí)驗(yàn)的習(xí)慣階段檢測(cè)籠飼養(yǎng)的WI-I和同籠飼養(yǎng)的KO-I小鼠的自發(fā)活動(dòng)程度（每組n = 31-32; (F) 總距離: 同籠飼養(yǎng)的WI-I vs.同籠飼養(yǎng)的KO-I: Mann-WhitneyU = 307, P = 0.0089; (G) 平均速度: 同籠飼養(yǎng)的WI-I vs.同籠飼養(yǎng)的KO-I: Mann-WhitneyU = 303, P = 0.0074）。（H）PCA分析腸道菌群β多樣性（PERMANOVA:R2=0.11351, P = 0.04459）。（I）ASVs系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（內(nèi)圈代表組間差異ASVs，綠色：KO中增加；白色：無(wú)差異；紫色：WT中增加。外圈代表Benjamini-Hochberg FDR校正后結(jié)果，白色：P ≥ 0.05；黑色：P < 0.05），直方圖為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。也可參見(jiàn)圖S2，表S1-2。
 

圖4 同籠飼養(yǎng)逆轉(zhuǎn)了KO-I組小鼠的社交缺陷并且導(dǎo)致了相似的腸道菌群結(jié)構(gòu)，但是并沒(méi)有逆轉(zhuǎn)多動(dòng)癥表現(xiàn)。（A-B）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。（C-D）通過(guò)動(dòng)物三箱社交自由探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)同籠飼養(yǎng)的WI-I和KO-I小鼠的社交行為（每組n = 31-32; C, 社交能力: 同籠飼養(yǎng)的WT-I: t = 9.442, P < 0.0001; 同籠飼養(yǎng)的KO-I: t = 9.284, P < 0.0001; 兩因素方差分析: F1,122 = 0.04696, P =0.8288; D, 社交新奇偏好: 同籠飼養(yǎng)的WT-I: t = 3.666, P = 0.0007;同籠飼養(yǎng)的 KO-I: t = 3.066, P = 0.0053; 兩因素方差分析, F1,122= 0.2135, P = 0.6448）。（E）通過(guò)社交互動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)同籠飼養(yǎng)的WI-I和同籠飼養(yǎng)的KO-I小鼠的社交行為（每組n = 22, 同籠飼養(yǎng)的WI-I vs.同籠飼養(yǎng)的KO-I, Mann-WhitneyU = 192, P = 0.2456）。（F-G）動(dòng)物三箱社交自由探索實(shí)驗(yàn)的習(xí)慣階段檢測(cè)籠飼養(yǎng)的WI-I和同籠飼養(yǎng)的KO-I小鼠的自發(fā)活動(dòng)程度（每組n = 31-32; (F), 總距離: 同籠飼養(yǎng)的WI-I vs.同籠飼養(yǎng)的KO-I: Mann-WhitneyU = 307, P = 0.0089; (G), 平均速度: 同籠飼養(yǎng)的WI-I vs.同籠飼養(yǎng)的KO-I: Mann-WhitneyU = 303, P = 0.0074）。（H）PCA分析腸道菌群β多樣性（PERMANOVA:R2=0.11351, P = 0.04459）。（I）ASVs系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（內(nèi)圈代表組間差異ASVs，綠色：KO中增加；白色：無(wú)差異；紫色：WT中增加。外圈代表Benjamini-Hochberg FDR校正后結(jié)果，白色：P ≥ 0.05；黑色：P < 0.05），直方圖為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。也可參見(jiàn)圖S2，表S1-2。

圖5 糞菌移植實(shí)驗(yàn)（FMT）可以將供者的社會(huì)行為表型賦予受者而不是自發(fā)活動(dòng)表型。（A）FMT實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。（B-C）通過(guò)動(dòng)物三箱社交自由探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FMT后GF小鼠的社會(huì)行為（每組n=9-21；B，社交能力：正常菌對(duì)照：t = 8.51，P < 0.0001；GF: t = 0.572，P > 0.9999；GF:WT-I FMT: t = 6.557，P < 0.0001；GF: KO-I FMT: t = 0.05714，P > 0.9999；GF: WT-L FMT: t = 5.673，P < 0.0001; GF: KO-LFMT: t = 6.485, P <0.0001；GF: KO-L FMT: t = 6.485，P < 0.0001；兩因素方差分析: F5, 144=16.61，P < 0.0001；C，社交新奇偏好：正常菌對(duì)照t = 3.82，P = 0.0012；GF: t = 0.1557，P > 0.9999；GF: WT-I FMT: t = 4.564，P < 0.0001；GF: KO-I FMT: t = 0.1194，P > 0.9999；GF: WT-L FMT: t = 4.006，P = 0.0006；GF: KO-L FMT: t = 5.73，P <0.0001；兩因素方差分析: F5, 144 =7.100，P < 0.0001）。（D-E）動(dòng)物三箱社交自由探索實(shí)驗(yàn)的習(xí)慣階段檢測(cè)FMT后各組GF小鼠的自發(fā)活動(dòng)程度（每組n=10–22；D，總距離: 正常菌定植與無(wú)菌定植GF: t=2.494，P = 0.2230；GF: WT-I vs. GF: KO-I: t = 2.173，P = 0.4942； GF: WT-L vs. GF: KO-L: t = 0.3335，P > 0.9999；單因素方差分析：F5,74 =2.529，P = 0.0361；平均速度：正常菌定植與無(wú)菌定植GF: t = 2.501，P = 0.2190；GF: WT-I vs.GF: KO-I: t = 2.218，P = 0.4448; GF: WT-Lvs. GF: KO-L: t = 0.3367，P > 0.9999；單因素方差分析：F5,74 =2.559，P = 0.0343）。直方圖為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。也可參見(jiàn)圖S3和表S1和S2。 3 選擇性微生物干預(yù)可以改善神經(jīng)發(fā)育遺傳缺陷小鼠的社交能力缺陷，但是對(duì)多動(dòng)癥無(wú)效雖然我們提供了Cntnap2 -/-小鼠的微生物組的特征，但我們的前期研究主要集中在其特定的腦回路上，尤其是催產(chǎn)素能系統(tǒng)。已知在已有的Cntnap2 -/-小鼠相關(guān)報(bào)道中，催產(chǎn)素系統(tǒng)調(diào)節(jié)社會(huì)行為的許多方面，并且與自閉癥相關(guān)。下丘腦室旁核（PVN）是腦內(nèi)主要合成催產(chǎn)素的區(qū)域，Cntnap2 -/-小鼠的室旁核催產(chǎn)素相關(guān)神經(jīng)元較少，并且催產(chǎn)素治療何以改善小鼠的社交缺陷。相應(yīng)的我們的研究也發(fā)現(xiàn)催產(chǎn)素治療可以逆轉(zhuǎn)Cntnap2 -/-（KO-I）小鼠社交障礙而并未逆轉(zhuǎn)多動(dòng)癥行為（圖S4A-F）。我們以及一些其他研究都發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri，L. reuteri）干預(yù)可以使血漿和PVN催產(chǎn)素水平升高，并且逆轉(zhuǎn)一些ASDs模型小鼠的社交障礙。然而，同樣的操作在缺乏催產(chǎn)素受體的小鼠上卻無(wú)效。因此我們進(jìn)一步猜測(cè)羅伊氏乳桿菌治療可以改善Cntnap2 -/-小鼠社交障礙。首先，我們檢測(cè)了羅伊氏乳桿菌在KO-I小鼠中是否改變，我們通過(guò)qPCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌豐度在KO-I組中豐度降低（圖S5A）。其次，我們發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌治療可以逆轉(zhuǎn)KO-I小鼠催產(chǎn)素神經(jīng)元的缺陷（圖S4G-J）。第三點(diǎn)并且是最重要的是，我們發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌治療逆轉(zhuǎn)了KO-I組幼年以及成年小鼠的社交缺陷（圖6A-C，6G，圖S5B-D）。第四點(diǎn)，相同的微生物干預(yù)并不影響KO-I組小鼠的多動(dòng)癥表現(xiàn)（圖6D-E）。因此，對(duì)KO-I組小鼠進(jìn)行早期或晚期的精確微生物干預(yù)可以選擇性的逆轉(zhuǎn)社交障礙，而非多動(dòng)癥表現(xiàn)。這一結(jié)論支持決定社交行為和自發(fā)活動(dòng)的因素是不同的。 4 選擇性微生物干預(yù)通過(guò)影響中腦腹側(cè)被蓋區(qū)的社交相關(guān)突出傳遞進(jìn)而改善神經(jīng)發(fā)育遺傳缺陷小鼠的社交能力缺陷包括中腦腹側(cè)背蓋區(qū)（VTA）的腦區(qū)是大腦內(nèi)的獎(jiǎng)勵(lì)刺激應(yīng)答區(qū)，亦是在社交行為調(diào)控中起重要作用的腦區(qū)。準(zhǔn)確的說(shuō)，PVN中表達(dá)催產(chǎn)素的神經(jīng)元投射至VTA的多巴胺（DA）神經(jīng)元，被催產(chǎn)素激活的DA神經(jīng)元在社交活動(dòng)中是至關(guān)重要的。通過(guò)檢測(cè)α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（AMPRA）和N-甲基-d-天冬氨酸受體（NMDRA）的比值，我們和其他研究發(fā)現(xiàn)社交活動(dòng)激活了鳥(niǎo)類(lèi)和小鼠VTA的DA神經(jīng)元，這一點(diǎn)與“社交活動(dòng)是一種特殊的獎(jiǎng)勵(lì)機(jī)制”的觀點(diǎn)吻合。有趣的是，這種潛在的社交細(xì)胞相關(guān)性，即VTA-DA神經(jīng)元中社交活動(dòng)誘發(fā)的突觸傳遞，在存在社交缺陷的ASD模型中也是受損的。羅伊氏乳桿菌治療以催乳素依賴(lài)的方式逆轉(zhuǎn)逆轉(zhuǎn)不同ASD小鼠模型的突觸缺陷。我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組小鼠相比，社交活動(dòng)未能誘導(dǎo)KO-I組小鼠 VTA神經(jīng)元AMPAR/NMDAR比值升高（圖6F-H）。與之相反，可卡因給藥導(dǎo)致VTA DA神經(jīng)元的AMPAR/NMDAR比率增加，表明DA神經(jīng)元功能正常并且對(duì)獎(jiǎng)賞刺激存在反應(yīng)，但對(duì)社會(huì)獎(jiǎng)賞刺激沒(méi)有反應(yīng)（圖6H），羅伊氏乳桿菌治療改善了Cntnap2 -/-（KO-I）小鼠VTA DA神經(jīng)元中社交互動(dòng)誘導(dǎo)的突觸可塑性缺陷（圖6H），再次確定羅伊氏乳桿菌增強(qiáng)了社交刺激的有效性及獎(jiǎng)勵(lì)機(jī)制。為了評(píng)估羅伊氏乳桿菌是否影響與社會(huì)行為有關(guān)的其他大腦區(qū)域的突觸傳遞，我們檢測(cè)了KO-I和WT-I小鼠的內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（mPFC）中的微型興奮性突觸后電流（mEPSCs）。與前人的結(jié)果一致，與WT-I小鼠相比，KO-I小鼠mPFC錐體細(xì)胞中mEPSCs的振幅和頻率降低（圖6I–6K）。羅伊氏乳桿菌治療未能逆轉(zhuǎn)KO-I小鼠中mEPSCs的變化（圖6I–6K）。這些數(shù)據(jù)表明，羅伊氏乳桿菌在VTA中選擇性地調(diào)節(jié)突觸傳遞的變化，而在mPFC中沒(méi)有。綜上所述，使用羅伊氏乳桿菌干預(yù)可挽救KO-I小鼠的社會(huì)行為以及與社會(huì)行為相關(guān)的可塑性缺陷，但不能挽救多動(dòng)癥表型。 

圖6 羅伊氏乳桿菌干預(yù)不改變Cntnap2 -/-小鼠自發(fā)活動(dòng)水平，卻能改善其社交缺陷和突觸傳遞相關(guān)變化（A）羅伊氏乳桿菌治療的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。（B-C）在動(dòng)物三箱社交自由探索實(shí)驗(yàn)中評(píng)估的羅伊氏乳桿菌治療小鼠的社會(huì)行為（每組n=19-22；B，社交能力：WT-I +無(wú)菌基質(zhì)： t = 5.329，P < 0.0001；KO-I +無(wú)菌基質(zhì)：t = 0.2167，P > 0.9999；KO-I + 羅伊氏乳桿菌：t = 12.75，P < 0.0001；兩因素方差分析：F2,116 =36.34，P < 0.0001；C，社交新奇偏好：WT-I +無(wú)菌基質(zhì)：t = 6.228，P < 0.0001；KO-I +無(wú)菌基質(zhì)：t = 1.241，P = 0.6516；KO-I + 羅伊氏乳桿菌：t = 6.934，P < 0.0001；兩因素方差分析，F(xiàn)2,116 =20.02，P < 0.0001）。（D-E）動(dòng)物三箱社交自由探索實(shí)驗(yàn)的習(xí)慣階段評(píng)估的羅伊氏乳桿菌治療小鼠的自發(fā)活動(dòng)水平（每組n=19–22；D，總距離：WT-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I +無(wú)菌基質(zhì)：t = 4.143，P = 0.0003；WT-I +無(wú)菌基質(zhì)vs. KO-I + 羅伊氏乳桿菌: t = 3.935，P = 0.0007；KO-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I +羅伊氏乳桿菌: t = 0.3565，P > 0.9999；單因素方差分析，F(xiàn)2,58 =10.86，P < 0.0001；E，平均速度：WT +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I +無(wú)菌基質(zhì)：t = 3.646，P = 0.0017；WT +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I + 羅伊氏乳桿菌: t = 3.072，P = 0.0097；KO-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I + 羅伊氏乳桿菌: t = 0.6995，P > 0.9999；單因素方差分析，F(xiàn)2,58 =7.663，P = 0.0011）。（F）電生理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。（G）社交互動(dòng)試驗(yàn)中評(píng)估了羅伊氏乳桿菌治療小鼠的社會(huì)行為（每組n=16–28對(duì)，WT-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I +無(wú)菌基質(zhì)：t = 6.490，P < 0.0001；WT-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I + 羅伊氏乳桿菌：t = 1.079，P = 0.8552；KO-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I + 羅伊氏乳桿菌：t = 7.707，P < 0.0001；單因素方差分析，F(xiàn)2,57 =37.53，P < 0.0001）。（H）在基線(xiàn)水平和社交互動(dòng)后24小時(shí)記錄的VTA的DA神經(jīng)元的AMPAR和NMDAR電流（上圖）和AMPAR/NMDAR比值（下圖）（每組n=6-14；WT-I+無(wú)菌基質(zhì)組基線(xiàn)水平vs. 社交活動(dòng)后：t = 3.462，P = 0.0203；KO-I+無(wú)菌基質(zhì)的基線(xiàn)水vs. 社交活動(dòng)后：t = 0.4072，P > 0.9999；基線(xiàn)水平的WT-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I + 羅伊氏乳桿菌：t = 0.1927，P > 0.9999；KO-I +無(wú)菌基質(zhì)基線(xiàn)水平vs. KO-I +無(wú)菌基質(zhì)+可卡因：t = 3.773，P = 0.0075；KO-I + 羅伊氏乳桿的菌基線(xiàn)水平vs. 社交活動(dòng)后：t = 3.467，P = 0.0201；單因素方差分析，F(xiàn)6,63 =7.119，P < 0.0001）。（I）微小興奮性突觸后電流（mEPSCs）的代表性痕跡。（J） mEPSCs波幅（每組n=7-9；WT-I+無(wú)菌基質(zhì)vs. KO-I+無(wú)菌基質(zhì)：t = 3.884，P = 0.0026；KO-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I + 羅伊氏乳桿菌: t = 1.295，P = 0.6278；WT-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I + 羅伊氏乳桿菌: t = 2.385，P = 0.0797；單因素方差分析：F2,21 =7.680，P = 0.0031）在用羅伊氏乳桿菌治療的WT-I、KO-I和KO-I組中。（K） mEPSCs頻率（每組n=7-9；WT-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I +無(wú)菌基質(zhì)：t = 3.802，P = 0.0031；KO-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I + 羅伊氏乳桿菌: t = 0.9573，P > 0.9999；WT-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I + 羅伊氏乳桿菌: t = 2.637，P = 0.0462；單因素方差分析：F2,21 =7.597，P = 0.0033）在用羅伊氏乳桿菌治療的WT-I、KO-I和KO-I組中。直方圖為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。也可參見(jiàn)圖S4和S5。
 5 微生物產(chǎn)生的特定代謝物能逆轉(zhuǎn)神經(jīng)發(fā)育遺傳缺陷小鼠社交能力和突觸的缺陷，但是無(wú)法逆轉(zhuǎn)多動(dòng)癥行為腸道微生物產(chǎn)生的或誘導(dǎo)產(chǎn)生的代謝物可在胃腸道以外傳遞信號(hào)，并通過(guò)腦腸軸調(diào)節(jié)大腦功能。為了研究羅伊氏乳桿菌改善KO-I小鼠社會(huì)缺陷的機(jī)制，我們進(jìn)行了非特異性腸道代謝組學(xué)分析。無(wú)監(jiān)督層次聚類(lèi)分析顯示，KO-I小鼠的代謝譜與WT-I小鼠的代謝譜明顯不同（圖7A），并且羅伊氏乳桿菌治療不會(huì)將KO-I小鼠的整體代謝譜移回到WT-I的狀態(tài)（圖7A）。鑒于此，我們接下來(lái)想知道是否有特異性代謝物的變化可以幫助區(qū)分社交正常（WT-I，KO-I+羅伊氏乳桿菌）和社交缺陷小鼠（KO-I）。隨機(jī)森林分析顯示，在社交正常和缺陷小鼠之間，最具差異性的兩種代謝物是生物喋呤和二氫生物喋呤（BH2），這是四氫生物喋呤（BH4）代謝途徑中的兩種代謝物（圖7B）。更重要的是，與WT-I相比，KO-I小鼠中這些代謝物的水平顯著降低，并通過(guò)羅伊氏乳桿菌治療得到完全改善（圖7C和7D）。BH4是一種具有生物活性的生物蝶呤分子，是許多重要酶的輔酶，這些酶產(chǎn)生多巴胺、血清素和一氧化氮等神經(jīng)活性分子。羅伊氏乳桿菌上調(diào)BH4途徑中代謝物的水平（圖7C和7D）并改善KO-I小鼠的社交缺陷，但不能改善其多動(dòng)癥表型（圖6B–6E和6G），與此同時(shí)，因?yàn)镵O-I小鼠的社交缺陷由微生物組介導(dǎo)（圖1、2、3、4和5；圖S1、2和3），所以我們想知道單獨(dú)用BH4干預(yù)是否可以選擇性地逆轉(zhuǎn)KO-I小鼠的社交缺陷。為了回答這個(gè)問(wèn)題，KO-I小鼠經(jīng)口灌胃給予BH4（或溶劑）治療（圖7E）。結(jié)果值得我們關(guān)注，與羅伊氏乳桿菌治療一樣，單獨(dú)使用BH4治療可改善VTA腦區(qū)DA神經(jīng)元導(dǎo)致的社交缺陷（圖7F、G和I）和受損的社交獎(jiǎng)賞相關(guān)突觸可塑性（圖7H和7J）。相反，BH4治療未能改善KO-I小鼠的多動(dòng)癥表型（圖7K - L）。上述結(jié)論進(jìn)一步證實(shí)了社交缺陷由微生物組的變化介導(dǎo)，而多動(dòng)癥表型由宿主基因調(diào)節(jié)的觀點(diǎn)。因此，羅伊氏乳桿菌通過(guò)調(diào)節(jié)宿主腸道內(nèi)內(nèi)源性四氫生物蝶呤水平，至少部分逆轉(zhuǎn)了社交能力和突觸可塑性缺陷。為了檢驗(yàn)BH4是否直接影響社交行為，或通過(guò)改變微生物組對(duì)社交行為產(chǎn)生影響，我們接下來(lái)檢驗(yàn)了BH4是否能夠改善GF小鼠的社會(huì)缺陷（圖S6A）。與先前的研究結(jié)果一致，我們也發(fā)現(xiàn)定植羅伊氏乳桿菌改善GF小鼠的社交缺陷，此外，我們還發(fā)現(xiàn)BH4也能逆轉(zhuǎn)GF小鼠的社交缺陷（圖S6B和S6C）。正如我們所料，BH4對(duì)GF小鼠的自發(fā)活動(dòng)水平?jīng)]有影響（圖S6D和S6E）。這些發(fā)現(xiàn)提供了另一個(gè)證據(jù)，即Cntnap2 -/-小鼠的社會(huì)行為表型是由腸道微生物組介導(dǎo)的，而多動(dòng)癥表型是由宿主遺傳決定的。在證明了BH4對(duì)于社會(huì)行為是由足夠影響之后，我們接下來(lái)探索了羅氏乳酸菌對(duì)社會(huì)行為的影響是否依賴(lài)于生物蝶呤途徑。為了回答這個(gè)問(wèn)題，用羅伊氏乳桿菌治療的Cntnap2 -/-（KO-I）小鼠被注射SPRi3（圖S7A），SPRi3是一種有效且選擇性的烏賊蛋白還原酶抑制劑，是BH4合成途徑中最后一個(gè)關(guān)鍵酶。有趣的是，當(dāng)BH4合成在藥理學(xué)上被阻斷時(shí)，羅伊氏乳桿菌未能改善KO-I小鼠的社交缺陷（圖S7B–S7D），這表明羅伊氏乳桿菌通過(guò)調(diào)節(jié)宿主的BH4系統(tǒng)來(lái)改善社交缺陷。值得注意的是，SPRi3不影響經(jīng)羅伊氏乳桿菌治療的KO-I小鼠的自發(fā)活動(dòng)能力（圖S7E和S7F），這進(jìn)一步證實(shí)了社交缺陷和多動(dòng)癥表型有不同起源的觀點(diǎn)。最后，我們檢查了BH4是否是WT小鼠正常社會(huì)行為所必需的（圖S7G）。我們發(fā)現(xiàn)SPRi3對(duì)BH4合成的藥理學(xué)抑制會(huì)損害WT小鼠的社會(huì)行為（圖S7H–S7J），但不會(huì)顯著改變運(yùn)動(dòng)活動(dòng)（圖S7K和S7L）。因此，BH4系統(tǒng)是有選擇地需要正常的社會(huì)行為。 

圖7 羅伊氏乳桿菌選擇性地上調(diào)來(lái)自四氫生物蝶呤（BH4）合成途徑的代謝物，BH4改善Cntnap2 -/-小鼠的社會(huì)缺陷，而不是自發(fā)活動(dòng)水平（A）WT-I+無(wú)菌基質(zhì)、KO-I+無(wú)菌基質(zhì)和KO-I+羅伊氏乳桿菌組的小鼠糞便代謝物的層次聚類(lèi)分析熱圖（每組5-6只）。選擇推理值（SI）（藍(lán)色）表示樹(shù)中每個(gè)邊（灰色）的穩(wěn)定性。（B）通過(guò)隨機(jī)森林分類(lèi)法分析WT-I+無(wú)菌基質(zhì)和KO-I+羅伊氏乳桿菌與KO-I+無(wú)菌基質(zhì)（每組n=5-6）之間差異最顯著的30種糞便代謝物。（C-D）BH4合成途徑中的代謝物水平（每組n=5–6；（C）生物蝶呤：WT-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I +無(wú)菌基質(zhì)： t = 7.159，P < 0.0001；WT-I + 無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I + 羅伊氏乳桿菌: t = 0.6152，P > 0.9999；KO-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I + 羅伊氏乳桿菌: t = 6.211，P < 0.0001；單因素方差分析，F(xiàn)2,14 =30.69，P < 0.0001；D，二氫生物蝶呤：WT-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I +無(wú)菌基質(zhì)：t = 10.34，P < 0.0001；WT-I + 無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I +羅伊氏乳桿菌: t = 1.006，P = 0.9944；KO-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I +羅伊氏乳桿菌: t = 8.852，P < 0.0001；單因素方差分析，F(xiàn)2,14 =63.40，P < 0.0001）。（E） BH4處理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。（F-G）在動(dòng)物三箱社交自由探索實(shí)驗(yàn)中評(píng)估的BH4處理的小鼠社會(huì)行為（每組n=13–14；F，社交能力：WT-I +無(wú)菌基質(zhì)： t = 6.488，P < 0.0001；KO-I +無(wú)菌基質(zhì)：t = 1.968，P = 0.1581；KO-I + BH4: t = 5.514，P < 0.0001；兩因素方差分析： F2,76 = 5.205，P = 0.0076；G，社交新奇偏好：WT-I +無(wú)菌基質(zhì)：t = 6.395，P < 0.0001；KO-I +無(wú)菌基質(zhì)：t = 1.930，P = 0.1722；KO-I + BH4: t = 6.611，P < 0.0001；兩因素方差分析，F(xiàn)2,76 =6.434，P = 0.0026）。（H）電生理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。（I）社交互動(dòng)試驗(yàn)檢測(cè)BH4處理小鼠的社會(huì)行為（每組n = 9–10對(duì)， KO-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I + BH4: Mann-Whitney U = 9，P = 0.0021）。（J）在基線(xiàn)水平和社交互動(dòng)后24小時(shí)記錄的VTA 的DA神經(jīng)元AMPAR和NMDAR電流（上圖）和AMPAR/NMDAR比值（下圖）（每組n=6–8；KO-I +無(wú)菌基質(zhì)基線(xiàn)水平 vs. 社交互動(dòng)后：t = 0.9717，P > 0.9999；基線(xiàn)水平下KO-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I+BH4：t = 0.2975，P > 0.9999；KO-I +無(wú)菌基質(zhì)社交互動(dòng)后 vs. KO-I + BH4基線(xiàn)水平：t = 0.7109， P> 0.9999； KO-I + BH4基線(xiàn)水平 vs. KO-I + BH4社交互動(dòng)后：t = 4.322，P = 0.0015；單因素方差分析，F(xiàn)3,23 =9.125，P = 0.0004）。（K-L）在動(dòng)物三箱社交自由探索實(shí)驗(yàn)的習(xí)慣化階段評(píng)估的BH4處理小鼠的自發(fā)活動(dòng)水平（每組n=13–14；K，總距離：WT-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I +無(wú)菌基質(zhì)：t = 4.763，P < 0.0001；WT-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I + BH4：t = 6.833，P < 0.0001；KO-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I + BH4：t = 1.943，P = 0.1784；單因素方差分析，F(xiàn)2,38 =24.66，P < 0.0001；L，平均速度：WT +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I +無(wú)菌基質(zhì): t = 4.827，P < 0.0001；WT +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I + BH4: t =6.853，P < 0.0001；KO-I +無(wú)菌基質(zhì) vs. KO-I + BH4: t = 1.898，P = 0.1961；單因素方差分析，F(xiàn)2,38 =24.90，P < 0.0001）。直方圖為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。也可參見(jiàn)圖S6和S7。
 

討論

 我們知道個(gè)體生理學(xué)和行為學(xué)的許多方面都會(huì)受到宿主基因組和微生物組的極大影響。迄今為止，人們都單獨(dú)的關(guān)注宿主基因或微生物基因?qū)π∈笮袨楸硇偷挠绊?。鑒于我們不僅受自身基因影響，而且受微生物及其相互作用的影響，因此了解特定神經(jīng)系統(tǒng)疾病的癥狀是由宿主基因變異對(duì)腦功能的直接影響引起的，還是由宿主腦-腸-菌軸的改變引起的，這一點(diǎn)至關(guān)重要。我們發(fā)現(xiàn)不同的適應(yīng)不良行為有著不同的病因。具體地說(shuō)，使用7種獨(dú)立的方法（同籠飼養(yǎng)法、分離實(shí)驗(yàn)、糞菌移植到GF小鼠、選擇性羅伊氏乳桿菌干預(yù)、選擇性BH4治療、催產(chǎn)素治療和SPRi3治療）以及微生物組基因和擴(kuò)增子測(cè)序分析，我們提供了支持同樣結(jié)論的證據(jù)，即在神經(jīng)發(fā)育障礙基因的小鼠模型中，社會(huì)行為表型由腸道微生物組決定，而動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)水平則由宿主等位基因直接調(diào)節(jié)。我們還發(fā)現(xiàn)，羅伊氏乳桿菌干預(yù)不同發(fā)育階段的Cntnap2 -/-小鼠都能夠選擇性地改善其社交缺陷，這表明微生物恢復(fù)社會(huì)行為的時(shí)間窗很寬。此外，利用非特異性代謝組學(xué)分析，我們還證明羅伊氏乳桿菌能促進(jìn)宿主內(nèi)源性BH4合成途徑，并且證明了在不進(jìn)行任何微生物干預(yù)下，將BH4直接給藥到動(dòng)物腸道后也能改善小鼠社會(huì)行為和突觸功能的缺陷，但是對(duì)自發(fā)活動(dòng)水平?jīng)]有任何影響。在今后的實(shí)驗(yàn)中，確定其他產(chǎn)生或誘導(dǎo)BH4產(chǎn)生的細(xì)菌種類(lèi)并檢驗(yàn)它們是否能夠促進(jìn)社會(huì)行為將是一件有趣的事情。此前，我們已經(jīng)證明，羅伊氏乳桿菌通過(guò)迷走神經(jīng)和催產(chǎn)素系統(tǒng)向大腦發(fā)送信號(hào)并調(diào)節(jié)社會(huì)行為。更具體地說(shuō)，手術(shù)切斷迷走神經(jīng)或抑制DA神經(jīng)元中的催產(chǎn)素受體，都會(huì)阻止羅伊氏乳桿菌介導(dǎo)的親社會(huì)效應(yīng)。有趣的是，BH4 已被證明能增加大鼠體內(nèi)的催產(chǎn)素釋放，而我們發(fā)現(xiàn)與無(wú)菌基質(zhì)處理的KO-I小鼠相比，BH4不能改善用選擇性催產(chǎn)素受體拮抗劑處理的KO-I小鼠的社交缺陷（圖S6F和6G）。今后的實(shí)驗(yàn)將檢驗(yàn)BH4的特異性作用以及其作用是否由迷走神經(jīng)介導(dǎo)。最后我們認(rèn)為，BH4的發(fā)現(xiàn)特別有趣：因?yàn)樵趯?duì)人類(lèi)的研究中表明，BH4治療可以改善自閉癥患者的一些臨床癥狀，包括社會(huì)行為相關(guān)癥狀。此外，我們的發(fā)現(xiàn)也表明，在行為神經(jīng)科學(xué)中對(duì)行為的研究時(shí)考慮到微生物的作用是極其重要的。毫無(wú)疑問(wèn)，控制基因組和微生物變量的一致應(yīng)該匹配對(duì)照的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，正如我們?cè)谘芯緾ntnap2 -/-小鼠的社會(huì)行為中發(fā)現(xiàn)的那樣：如果微生物群是一個(gè)作用因素，一些表型可以由于共同居住條件而被掩蓋。事實(shí)上，這些發(fā)現(xiàn)提出了一種有趣的可能性，即在疾病的其他遺傳模型（如糖尿病、癌癥、免疫、病毒感染、神經(jīng)系統(tǒng)疾?。┲锌吹降谋硇涂梢杂伤拗骰颉⑽⑸锝M的變化和/或它們的相互作用導(dǎo)致。因此，在未來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，有必要考慮到全基因組的復(fù)雜性，以便充分了解不同行為的病因。考慮到以前未考慮的變量，如腸道微生物組成、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育方案和宿主微生物群的相互作用，今后的研究不僅應(yīng)提高結(jié)果的可重復(fù)性，還應(yīng)提高該研究的價(jià)值及其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病不同動(dòng)物模型治療中的潛力。最后，鑒于目前遺傳神經(jīng)疾病發(fā)病以大腦為中心的研究觀點(diǎn)，我們相信我們的研究結(jié)果拓寬了我們對(duì)基因突變?nèi)绾螌?dǎo)致行為異常的理解。此外，這些證據(jù)也證明，靶向針對(duì)與大腦和腸道微生物進(jìn)行干預(yù)，可充分有效地逆轉(zhuǎn)與某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的核心癥狀。

局限性

我們的研究表明遺傳性腦疾病的特定癥狀（或行為異常）可能是通過(guò)宿主基因和微生物群的共同作用而產(chǎn)生的。為了充分了解這一現(xiàn)象背后的機(jī)制，還需要開(kāi)展更多的工作。這些研究包括：（1）研究Cntnap2 -/-的丟失如何導(dǎo)致腸道微生物群組成的改變；（2）BH4產(chǎn)生和向大腦發(fā)送信號(hào)的確切機(jī)制。明確我們的發(fā)現(xiàn)是否具有普遍性以及是否可以擴(kuò)展到其他復(fù)雜行為和/或疾病也將是一個(gè)有趣的問(wèn)題。例如，其他基因突變是否通過(guò)宿主基因和微生物組相互作用來(lái)調(diào)節(jié)行為和大腦功能？其他疾病，如肥胖癥、癌癥、代謝紊亂和免疫力是否也受宿主基因和腸道微生物群的控制？如果是這樣的話(huà)，我們能利用這些知識(shí)開(kāi)發(fā)基于新的微生物療法的針對(duì)特定遺傳疾病的精確藥物嗎？

評(píng)論

自菌-腸-腦軸的不斷深入研究，許多研究者發(fā)現(xiàn)很多過(guò)去認(rèn)為主要由遺傳因素引起的疾病中，腸道微生物也起著重要的作用。腸道微生物可以參與調(diào)控宿主炎癥水平、行為等多方面。但是腸道微生物和宿主遺傳易感性在對(duì)宿主調(diào)控中分別起了什么樣的作用，以及他們二者間是否存在潛在的復(fù)雜相互作用，這都是尚不明晰的。美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)系的MauroCosta-Mattioli團(tuán)隊(duì)發(fā)表的這篇研究利用Cntnap2敲除小鼠這一典型的遺傳突變所致社交行為學(xué)異常的模型，通過(guò)研究其腸道微生物組改變，層層遞進(jìn)的揭示了遺傳易感性決定Cntnap2敲除小鼠多動(dòng)癥表型，而腸道微生物通過(guò)羅伊氏乳桿菌街道BH4代謝通路以及催產(chǎn)素依賴(lài)的調(diào)節(jié)了Cntnap2敲除小鼠的社交行為。該研究可以說(shuō)是研究遺傳因素與腸道微生物因素在宿主行為調(diào)節(jié)機(jī)制中具有里程碑意義的發(fā)現(xiàn)。

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