遺傳病的基因治療(Gene Therapy)是指應(yīng)用基因工程技術(shù)將正?；蛞牖颊呒?xì)胞內(nèi)，以糾正缺陷基因而根治疾病。糾正的途徑既可以是原位修復(fù)有缺陷的基因，也可以是用有功能的正?；蜣D(zhuǎn)入細(xì)胞基因組的某一部位，以替代缺陷基因來發(fā)揮作用?；蚴菙y帶生物遺傳 信息的基本功能單位，是位于染色體上的一段特定序列。將外源的基因?qū)肷锛?xì)胞內(nèi)必須借助一定的技術(shù)方法或載體，基因轉(zhuǎn)移的方法分為生物學(xué)方法、物理方法和化學(xué)方法。腺病毒載體是基因治療最為常用的病毒載體之一。基因治療主要是治療那些對(duì)人類健康威脅嚴(yán)重的疾病，包括：遺傳?。ㄈ缪巡?、囊性纖維病、家庭性高膽固醇血癥等）、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾?。ㄈ绨滩　㈩愶L(fēng)濕等）?；蛑委熓菍⑷说恼；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)?；蛑委熍c常規(guī)治療方法不同：一般意義上疾病的治療針對(duì)的是因基因異常而導(dǎo)致的各種癥狀，而基因治療針對(duì)的是疾病的根源--異常的基因本身?；蛑委熡卸N形式：一是體細(xì)胞基因治療，正在廣泛使用；二是生殖細(xì)胞基因治療，因能引起遺傳改變而受到限制。

基因治療的靶細(xì)胞主要分為兩大類：體細(xì)胞和生殖細(xì)胞，如今開展的基因治療只限于體細(xì)胞。生殖細(xì)胞的基因治療是將正常基因直接引入生殖細(xì)胞，以糾正缺陷基因。這樣，不僅可使遺傳疾病在當(dāng)代得到治療，而且還能將新基因傳給患者后代，使遺傳病得到根治。但生殖細(xì)胞的基因治療涉及問題較多，技術(shù)也較復(fù)雜，因此，如今更多地是采用體細(xì)胞基因治療。體細(xì)胞應(yīng)該是在體內(nèi)能保持相當(dāng)長的壽命或者具有分裂能力的細(xì)胞，這樣才能使被轉(zhuǎn)入的基因能有效地、長期地發(fā)揮“治療”作用。因此干細(xì)胞、前體細(xì)胞都是理想的轉(zhuǎn)基因治療靶細(xì)胞。以如今的觀點(diǎn)看，骨髓胞是唯一滿足以上標(biāo)準(zhǔn)的靶細(xì)胞，而骨髓的抽取，體外培養(yǎng)、再植入等所涉及的技術(shù)都已成熟；另一方面，骨髓細(xì)胞還構(gòu)成了許多組織細(xì)胞(如單核巨噬細(xì)胞)的前體。因此，不僅一些涉及血液系統(tǒng)的疾病如ADA缺乏癥、珠蛋白生成障礙性貧血、鐮狀細(xì)胞貧血、CGD等以骨髓細(xì)胞作為靶細(xì)胞，而且一些非血液系統(tǒng)疾病如苯丙酮尿癥、溶酶體儲(chǔ)積病等也都以此作為靶細(xì)胞。除了骨髓以外，肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞也可作為靶細(xì)胞來研究或?qū)嵤┺D(zhuǎn)基因治療。

(1)生殖細(xì)胞基因治療：生殖細(xì)胞基因治療(germ cell gene therapy)是將正?；蜣D(zhuǎn)移到患者的生殖細(xì)胞（精細(xì)胞、卵細(xì)胞中早期胚胎）使其發(fā)育成正常個(gè)體，顯然，這是理想的方法。實(shí)際上，這種靶細(xì)胞的遺傳修飾尚無實(shí)質(zhì)性進(jìn)展?；虻倪@種轉(zhuǎn)移一般只能用顯微注射，然而效率不高，并且只適用排卵周期短而次數(shù)多的動(dòng)物，這難適用于人類。而在人類實(shí)行基因轉(zhuǎn)移到生殖細(xì)胞，并世代遺傳，又涉及倫理學(xué)問題。因此，就人類而言，多不考慮生殖細(xì)胞的基因治療途徑。

(2)體細(xì)胞基因治療：體細(xì)胞基因治療(somatic cell gene therapy)是指將正?；蜣D(zhuǎn)移到體細(xì)胞，使之表達(dá)基因產(chǎn)物，以達(dá)到治療目的。這種方法的理想措施是將外源正常基因?qū)氚畜w細(xì)胞內(nèi)染色體特定基因座位，用健康的基因確切地替換異常的基因，使其發(fā)揮治療作用，同時(shí)還須減少隨機(jī)插入引起新的基因突變的可能性。對(duì)特定座位基因轉(zhuǎn)移，還有很大困難。

體細(xì)胞基因治療采用將基因轉(zhuǎn)移到基因組上非特定座位，即隨機(jī)整合。只要該基因能有效地表達(dá)出其產(chǎn)物，便可達(dá)到治療的目的。這不是修復(fù)基因結(jié)構(gòu)異常而是補(bǔ)償異?；虻墓δ苋毕荩@種策略易于獲得成功?；蛑委熤凶鳛槭荏w細(xì)胞的體細(xì)胞，多采取離體的體細(xì)胞，先在體外接受導(dǎo)入的外源基因，在有效表達(dá)后，再輸回到體內(nèi)，這也就是間接基因治療法。

體細(xì)胞基因治療不必矯正所有的體細(xì)胞，因?yàn)槊總€(gè)體細(xì)胞都具有相同的染色體。有些基因只在一種類型的體細(xì)胞中表達(dá)，因此，治療只需集中到這類細(xì)胞上。其次，某些疾病，只需少量基因產(chǎn)物即可改善癥狀，不需全部有關(guān)體細(xì)胞都充分表達(dá)。

狹義概念

指用具有正常功能的基因置換或增補(bǔ)患者體內(nèi)有缺陷的基因，因而達(dá)到治療疾病的目的。

廣義概念

基因治療

指把某些遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)，最終達(dá)到治療某種疾病的方法。

按基因操作

基因治療

一類為基因修正（gene correction）和基因置換（gene replacement），即將缺陷基因的異常序列進(jìn)行矯正，對(duì)缺陷基因精確地原位修復(fù)，不涉及基因組的其他任何改變。通過同源重組（homologous recombination）即基因打靶（gene targetting）技術(shù)將外源正常的基因在特定的部位進(jìn)行重組，從而使缺陷基因在原位特異性修復(fù)。另一類為基因增強(qiáng)（gene augmentation）和基因失活（gene inactivation），是不去除異常基因，而通過導(dǎo)入外源基因使其表達(dá)正常產(chǎn)物，從而補(bǔ)償缺陷基因等的功能；或特異封閉某些基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄，以達(dá)到抑制某些異常基因表達(dá)。

按靶細(xì)胞

又可分為生殖細(xì)胞（germ-line cell）基因治療和體細(xì)胞（somatic cell）基因治療。廣義的生殖細(xì)胞基因治療以精子，卵子和早期胚胎細(xì)胞作為治療對(duì)象。由于當(dāng)前基因治療技術(shù)還不成熟，以及涉及一系列倫理學(xué)問題，生殖細(xì)胞基因治療仍屬禁區(qū)。在現(xiàn)有的條件下，基因治療僅限于體細(xì)胞。

給藥途徑

①ex vivo 途徑：這是指將含外源基因的載體在體外導(dǎo)入人體自身或異體細(xì)胞（或異種細(xì)胞），經(jīng)體外細(xì)胞擴(kuò)增后，輸回人體。ex vivo基因轉(zhuǎn)移途徑比較經(jīng)典、安全，而且效果較易控制，但是步驟多、技術(shù)復(fù)雜、難度大，不容易推廣；

②in vivo 途徑：這是將外源基因裝配于特定的真核細(xì)胞表達(dá)載體，直接導(dǎo)入體內(nèi)。這種載體可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA。in vivo基因轉(zhuǎn)移途徑操作簡便，容易推廣，但尚未成熟，存在療效持續(xù)時(shí)間短，免疫排斥及安全性等一系列問題。

基因矯正

基因置換

指用正?；蛲ㄟ^同源重組技術(shù)，原位替換致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的DNA 完全恢復(fù)正常狀態(tài)。

基因增補(bǔ)

把正?；?qū)塍w細(xì)胞，通過基因的非定點(diǎn)整合使其表達(dá)，以補(bǔ)償缺陷基因的功能，或使原有基因的功能得到增強(qiáng)，但致病基因本身并未除去

基因失活

將特定的反義核酸（反義RNA、反義DNA)和核酶導(dǎo)入細(xì)胞，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平阻斷某些基因的異常表達(dá)，而實(shí)現(xiàn)治療的目的。

自殺基因

在某些病毒或細(xì)菌中的某基因可產(chǎn)生一種酶，它可將原無細(xì)胞毒或低毒藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒物質(zhì)，將細(xì)胞本身殺死，此種基因稱為“自殺基因”。

免疫治療

免疫基因治療是把產(chǎn)生抗病毒或腫瘤免疫力的對(duì)應(yīng)與抗原決定簇基因?qū)霗C(jī)體細(xì)胞，以達(dá)到治療目的。如細(xì)胞因子(cytokine)基因的導(dǎo)入和表達(dá)等。

耐藥治療

耐藥基因治療是在腫瘤治療時(shí)，為提高機(jī)體耐受化療藥物的能力，把產(chǎn)生抗藥物毒性的基因?qū)肴梭w細(xì)胞，以使機(jī)體耐受更大劑量的化療。如向骨髓干細(xì)胞導(dǎo)入多藥抗性基因中的mdr-1。

1．基因轉(zhuǎn)移方法

（1）特異正常基因的分離與克?。簯?yīng)用重組DNA和分子克隆技術(shù)結(jié)合基因定位研究成果，已有不少基因并將會(huì)有更多人類基因被分離和克隆，這是基因治療的前提，在當(dāng)代分子生物技術(shù)條件下，一般來說，只要有基因探針和準(zhǔn)確的基因定位，任何基因都可被克隆。除此，如今既可人工合成DNA探針，還可用DNA合成儀在體外人工合成基因，這些都是在基因治療前，分離克隆特異基因的有利條件。

（2）外源基因的轉(zhuǎn)移：基因轉(zhuǎn)移（gene transfer）是將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，其轉(zhuǎn)移方法較多，常用的要有下列幾類：

1）化學(xué)法：將正?；駾NA（及其拷貝）與帶電荷物質(zhì)和磷酸鈣、DEAE－葡萄糖或與若干脂類混合，形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒，直接傾入培養(yǎng)基中與細(xì)胞接觸，由于鈣離子有促進(jìn)DNA透過細(xì)胞有作用，某些化合物可擾亂細(xì)胞膜，故可將DNA輸入細(xì)胞內(nèi)，并整合于受體細(xì)胞的基因組中，在適當(dāng)?shù)臈l件下，整合基因得以表達(dá)，細(xì)胞亦可傳代。這種方法簡單，但效率極低，一般1000－100000個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)細(xì)胞可結(jié)合導(dǎo)入的外源基因。要達(dá)到治療目的，就需要從病人獲得大量所需的受體細(xì)胞。當(dāng)然，可以通過選擇培養(yǎng)的方法來提高轉(zhuǎn)化率。

①電穿孔法：電穿孔法（electroporotion）是將細(xì)胞置于高壓脈沖電場(chǎng)中，通過電擊使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔，周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞，但有時(shí)也會(huì)使細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷。

②顯微注射法：顯微注射（microinjection）是在顯微鏡直視下，向細(xì)胞核內(nèi)直接注射外源基因，這種方法應(yīng)是有效的。但一次只能注射一個(gè)細(xì)胞，工作耗力費(fèi)時(shí)。此法用于生殖細(xì)胞時(shí)，有效率可達(dá)10%。直接用于體細(xì)胞卻很困難。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用這種方法將目的基因注入生殖細(xì)胞，使之表達(dá)而傳代，這樣的動(dòng)物就稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如今成功使用得較多的是轉(zhuǎn)基因小鼠（transgenic mice），它可作為繁殖大量后代的疾病動(dòng)物模型。

③脂質(zhì)體法：脂質(zhì)體（liposome）法是應(yīng)用人工脂質(zhì)體包裝外源基因，再與靶細(xì)胞融合，或直接注入病灶組織，使之表達(dá)。

3）同源重組法：同源重組（homologous recombination）是將外源基因定位導(dǎo)入受體細(xì)胞的染色體上，在該座位因有同源序列，通過單一或雙交換，新基因片段替換有缺陷的片段，達(dá)到修正缺陷基因的目的。如在新基因片段旁組裝一Neo基因，則在同源重組后，因有Neo基因，可在含有新霉素（neomycin）的培養(yǎng)基中生長，從而使未插入新基因片段的細(xì)胞死亡。對(duì)于體細(xì)胞基因治療，體外培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間不能過長，篩選量大，故在臨床上應(yīng)用也受限制難以進(jìn)行。今后如能改進(jìn)技術(shù)，提高重組率，這種定點(diǎn)修正基因的方法仍是有前景的。

4）病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移：前述的化學(xué)和物理方法都是通過傳染方式基因轉(zhuǎn)移。病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移（viral mediatedgene transfer）是通過轉(zhuǎn)換方式完成基因轉(zhuǎn)移，即以病毒為載體（vector），將外源目的基因通過基因重組技術(shù)，將其組裝于病毒上，讓這種重組病毒去感染受體宿主細(xì)胞，這種病毒稱為病毒運(yùn)載體（viral vector）。如今應(yīng)用的有兩種病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法。

①反轉(zhuǎn)錄病毒載體：反轉(zhuǎn)錄病毒雖是RNA病毒，但有反轉(zhuǎn)錄酶，可使RNA轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細(xì)胞基因組。反轉(zhuǎn)錄病毒載體有以下的優(yōu)點(diǎn)首先是具有穿透細(xì)胞的能力，可使近100%的受體細(xì)胞被感染，轉(zhuǎn)化細(xì)胞效率高；其次，它能感染廣譜動(dòng)物物種和細(xì)胞類型而無嚴(yán)格的組織特異性；再者隨機(jī)整俁的病毒可長期存留，一般無害于細(xì)胞，但也存在缺點(diǎn)：這種載體只能把其DNA整合到能旺盛分裂細(xì)胞的染色體，而不適合于那些不能正常分裂的細(xì)胞，如神經(jīng)元。最嚴(yán)重的問題是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主細(xì)胞感染病毒和致癌的危險(xiǎn)性。因此，人們有目的地將病毒基因及其癌基因除去，僅留它們的外殼蛋白，以保留其穿透細(xì)胞的功能，試圖避免上述缺點(diǎn)。這種改造后的病毒稱為缺陷型病毒（defective virus）。這樣的病毒中的反轉(zhuǎn)錄酶可將RNA轉(zhuǎn)化為DNA，有助于該DNA順利進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組，而該病毒則死亡。由于病毒整合基因組是隨機(jī)的，所以還是可能激活細(xì)胞的原癌基因，以及因隨機(jī)插入發(fā)生插入突變。

在反轉(zhuǎn)錄病毒載體中，最常用于人類的是莫洛尼（Mooney）鼠白血病病毒（murine leukemia virus;Mo-MLV），其人工構(gòu)建的結(jié)構(gòu)。

②DNA病毒介導(dǎo)載體（DNA viral mekiated vector）：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒、皰疹病毒等，一般認(rèn)為這類病毒難于改造成缺陷型病毒。

牛乳頭瘤病毒重組后，可不插入宿主染色體中引起插入突變，又可在宿主染色體外獨(dú)立復(fù)制，并表達(dá)出基因產(chǎn)物。有人發(fā)現(xiàn)，因缺少E1區(qū)而致復(fù)制缺陷的腺病毒，可在表達(dá)E1基因的細(xì)胞中繁殖。后來證明，載有外源DNA的復(fù)制缺陷腺病毒呈現(xiàn)相同繁殖的特點(diǎn)。1993年美法等國成功采用腺病毒載體進(jìn)行心、腦、肺、肝內(nèi)膽管和肌肉組織的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。它代表了基因治療的新方向。

美國設(shè)計(jì)了一個(gè)新的腺病毒載體，它是用一個(gè)化學(xué)連接器即賴氨酸鏈（lysine chain）將DNA栓在病毒外殼上，這樣組成的運(yùn)輸器，通過一個(gè)表面抗體而進(jìn)入細(xì)胞核，使宿主基因與治療基因共同表達(dá)。這個(gè)新病毒載體稱為腺病毒多賴氨酸DNA復(fù)合體（adeno virus-polylysine DNA-complex）。

采用復(fù)制缺陷的腺病毒進(jìn)行基因治療有以下優(yōu)點(diǎn)：

①該病毒可感染分裂和非分裂的細(xì)胞，并能得到大量基因產(chǎn)物，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等基因缺陷的糾正有特殊意義；

②病毒顆粒相對(duì)穩(wěn)定，并易于純化和濃縮，且感染力不降低；

③可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)多種靶細(xì)胞后而少游離于細(xì)胞基因組外，并持續(xù)表達(dá)；

④已用于基因治療的Ad5屬腺病毒C亞群，無致癌性。

前述的新腺病毒載體還有一大優(yōu)點(diǎn)是可以成功地運(yùn)載48000bp的基因，而其它病毒只能運(yùn)輸70 00bp的基因。這些優(yōu)點(diǎn)顯示了腺病毒介導(dǎo)載體的廣闊應(yīng)用前景。

2．選擇靶細(xì)胞的原則

這里所指的靶細(xì)胞是指接受轉(zhuǎn)移基因的體細(xì)胞。

選擇靶細(xì)胞的原則是：

①必須較堅(jiān)固，足以耐受處理，并易于由人體分離又便于輸回體內(nèi)；

②具有增殖優(yōu)勢(shì)，生命周期長，能存活幾月至幾年，最后可延續(xù)至病人的整個(gè)生命期；

④在選用反轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，目的基因表達(dá)最好具有組織特異性的細(xì)胞。使用得較多的是骨髓干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肌細(xì)胞等。許多遺傳病與造血細(xì)胞有關(guān)，故可用于如β地貧、嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷病等的基因治療。皮膚成纖維細(xì)胞易于移植和從體內(nèi)分離，又可在培養(yǎng)中生長，并易存活，故有人用之于乙型血友病的基因治療。有不少遺傳病表現(xiàn)了肝細(xì)胞功能缺陷，因此，在家族性高膽固醇血癥的治療中，有將低密度脂蛋白（LDL）受體基因轉(zhuǎn)移至肝細(xì)胞的嘗試。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已證明：β－半乳糖苷酶基因、ADA基因、小肌營養(yǎng)不良蛋白（minidystrophin）基因都已證明能在肌細(xì)胞中表達(dá)。

基因治療

(一)治療性基因的獲得

(三)靶細(xì)胞的選擇

(四)基因轉(zhuǎn)移方法

(五)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的選擇鑒定

(六)回輸體內(nèi)

轉(zhuǎn)移

基因治療

在基因治療中迄今所應(yīng)用的目的基因轉(zhuǎn)移方法可分為兩大類：病毒方法和非病毒方法?；蜣D(zhuǎn)移的病毒方法中，RNA和DNA病毒都可用為基因轉(zhuǎn)移的載體。常用的有反轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體。轉(zhuǎn)移的基本過程是將目的基因重組到病毒基因組中，然后把重組病毒感染宿主細(xì)胞，以使目的基因能整合到宿主基因組內(nèi)。非病毒方法有磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、顯微注射法等。

表達(dá)

目的基因的表達(dá)是基因治療的關(guān)鍵之一。為此，可運(yùn)用連鎖基因擴(kuò)增等方法適當(dāng)提高外源基因在細(xì)胞中的拷貝數(shù)。在重組病毒上連接啟動(dòng)子或增強(qiáng)子等基因表達(dá)的控制信號(hào)，使整合在宿主基因組中的新基因高效表達(dá)，產(chǎn)生所需的某種蛋白質(zhì)。

安全措施

為避免基因治療的風(fēng)險(xiǎn)，在應(yīng)用于臨床之前，必須保證轉(zhuǎn)移-表達(dá)系統(tǒng)絕對(duì)安全，使新基因在宿主細(xì)胞表達(dá)后不危害細(xì)胞和人體自身，不引起癌基因的激活和抗癌基因的失活等，尤其是在將反轉(zhuǎn)錄載體用于基因轉(zhuǎn)移時(shí)，必須在應(yīng)用到人體前預(yù)先在人骨髓細(xì)胞、小鼠體內(nèi)和靈長類動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行類似的研究，以確保治療的安全性。

基因治療研究一般要符合下列要求

③靶細(xì)胞的親緣性和可操作性等；

④有明顯療效和無或低危害性等；

⑤表達(dá)水平穩(wěn)定時(shí)程長；

人類細(xì)胞基因治療的臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)開始。 進(jìn)行基因治療必須具備下列條件：

①選擇適當(dāng)?shù)募膊?，并?duì)其發(fā)病機(jī)理及相應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)功能了解清楚；

②糾正該病的基因已被克隆，并了解該基因表達(dá)與調(diào)控的機(jī)制與條件；

③該基因具有適宜的受體細(xì)胞并能在體外有效表達(dá)；

④具有安全有效的轉(zhuǎn)移載體和方法，以及可供利用的動(dòng)物模型。

已對(duì)若干人類單基因遺傳病和腫瘤開展了臨床的基因治療。

1991年美國批準(zhǔn)了人類第一個(gè)對(duì)遺傳病進(jìn)行體細(xì)胞基因治療的方案，即將腺苷脫氨酶（ADA）導(dǎo)入一個(gè)4歲患有嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷綜合征（SCID）的女孩。采用的是反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的間接法，即用含有正常人腺苷脫氨酶基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體培養(yǎng)患兒的白細(xì)胞，并用白細(xì)胞介素Ⅱ（IL－2）刺激其增殖，經(jīng)10天左右再經(jīng)靜泳輸入患兒。大約1－2月治療一次，8個(gè)月后，患兒體內(nèi)ADA水平達(dá)到正常值的25%，未見明顯副作用。此后又進(jìn)行第2例治療獲得類似的效果。

2．黑色素瘤的基因治療對(duì)腫瘤進(jìn)行基因治療

是人們?cè)缫哑谕氖?，在進(jìn)行了多方面探索的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumorinfiltrating lymphocyte-TIL，即能在腫瘤部位持續(xù)存在而無副作用的一種淋巴細(xì)胞）在腫瘤治療中的作用。于1992年實(shí)施了TNF/腫瘤細(xì)胞和IL－2/腫瘤細(xì)胞方案，即分別將IL－2基因腫瘤壞死因子（tumor necrosis ractor，TNF）基因?qū)肴∽曰颊咦陨聿⒔?jīng)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，再將這些培養(yǎng)后的腫瘤細(xì)胞注射至病人臀部，3周后切除注射部位與其引流的淋巴結(jié)，在適合條件下培養(yǎng)T細(xì)胞，將擴(kuò)增的T細(xì)胞與IL－2合并用于病人，結(jié)果5名黑色素瘤病人中1名腫瘤完全消退，2名90%的腫瘤消退，另2人在治療后9個(gè)月死亡。由于攜有TNF的TIL可積于腫瘤處，因而TIL的應(yīng)用提高了對(duì)腫瘤的殺傷作用。

3．其它遺傳病的基因治療其它遺傳病

諸如白種人中常見的囊性纖維化的進(jìn)展很快。對(duì)于DMD的基因治療，由于有小鼠動(dòng)物模型，也取得一定進(jìn)展。例如1993年法國將Ad-RSVmDys（腺病毒－羅斯病毒小肌營養(yǎng)不良蛋白基因重組體）注入小鼠肌內(nèi)成功。即用腺病毒為載體，與小肌營養(yǎng)不良蛋白（minidystrophin）基因的cDNA重組，在RSV啟動(dòng)子啟動(dòng)下，作肌肉注射，證明可在mdy小鼠肌肉表達(dá)，此外，對(duì)一些遺傳病如血友病，地中海貧血、高雪氏病等正在探索中。

浙江大學(xué)孔德華博士等單位對(duì)乙型血友病的基因治療也進(jìn)行了有意義的探索，他們?cè)谕媚Ｐ偷幕A(chǔ)上，將人第Ⅸ因子基因通過重組質(zhì)粒（pcmvix）或重組反轉(zhuǎn)錄病毒（N2CMVIX）導(dǎo)入自體皮膚成纖維細(xì)胞，獲得可喜的階段性成果，相信不久的將來，基因治療會(huì)在我國取得成功。

又稱反義寡核苷酸（antisenseoligodeoxynucleotides）技術(shù)，是指利用人工合成的反義RNA和反義DNA來阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，控制細(xì)胞生長在中間階段,使編碼蛋白質(zhì)的基因能轉(zhuǎn)錄為mRNA，因而不能翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，以達(dá)治療某一疾病的目的、用反義DNA已對(duì)某些癌癥進(jìn)行臨床試驗(yàn)。這類反義技術(shù)只能認(rèn)為是一種從基因水平進(jìn)行治療的技術(shù)，它們以不同方式，在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平發(fā)揮作用。由于它們的分子量低，故而有潛力進(jìn)入靶細(xì)胞，但其臨床穩(wěn)定性、毒性、細(xì)胞通透性等各方面都需要進(jìn)一步研究。

5．藥物靶向治療（drugstargeting）

此法機(jī)理可概括為病毒導(dǎo)向酶的藥物前體治療（virus directed enzyemeprodrug therapy，VDEPT），即用反轉(zhuǎn)錄病毒載體的外源基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。該基因編碼一種酶，此酶可將一種無害的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒素復(fù)合物。帶有這一基因的病毒載體只在特殊組織或腫瘤細(xì)胞中而不在正常細(xì)胞中表達(dá)。例如，胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase）可將無害的5－氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5-FC）轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒素5－氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5-FC）。此病毒可感染正常細(xì)胞和癌細(xì)胞，但將該酶基因連接到一種“分子開關(guān)”后，則只能在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。Sikora等設(shè)計(jì)一個(gè)“嵌合小基因（chimeric minigene）”，即將酶基因連接到erbB2基因啟動(dòng)子的下游，此啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，使erbB2在乳腺癌細(xì)胞中過度表達(dá)。此時(shí)，藥物5－FC注入細(xì)胞后即轉(zhuǎn)變?yōu)?－FU而致癌細(xì)胞死亡。而當(dāng)5－FC給予含有此嵌合基因卻無erbB2表達(dá)的細(xì)胞時(shí)，亦無藥物前體活性。這一基因治療的新策略，可有可能使人對(duì)腫瘤等不同疾病進(jìn)行基因治療。

已批準(zhǔn)治療的病例約120例，其中約110例為腫瘤，遺憾的是，除黑色素瘤有些苗頭外，全都未能成功。治療了10余例單基因病，除ADA缺乏癥和乙型血友病有一定療效外，其余都還在實(shí)驗(yàn)階段。但人們?cè)僖膊粦岩苫蛑委煵粌H可能辦到，而且指日可待。

1991年,我國科學(xué)家進(jìn)行了世界上首例血友病B的基因治療臨床試驗(yàn),目已有4名血友病患者接受了基因治療,治療后體內(nèi)IX因子濃度上升,出血癥狀減輕,取得了安全有效的治療效果。隨后,我國科學(xué)家利用胸腺激酶基因治療惡性腦膠質(zhì)瘤基因治療方案獲準(zhǔn)進(jìn)入1期臨床試驗(yàn),初步的觀察表明,生存期超過1年以上者占55%,其中 1例已超過三年半,仍未見腫瘤復(fù)發(fā)。此外,采用血管內(nèi)皮生長因子基因治療外周梗塞性下肢血管病基因治療方案也已獲準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。我國已有6個(gè)基因治療方案進(jìn)入或即將進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

總的來看,我國基因治療產(chǎn)業(yè)比美國落后了約4年,正處于成長階段,絕大部分還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段,僅有大約5個(gè)項(xiàng)目通過審批進(jìn)入特批臨床試驗(yàn)或I、Ⅱ期臨床試驗(yàn)。

1．導(dǎo)入基因的穩(wěn)定高效表達(dá)外源基因轉(zhuǎn)移入病人體內(nèi)細(xì)胞表達(dá)，

首先與轉(zhuǎn)移方法有關(guān)?；瘜W(xué)和物理方法所導(dǎo)入的基因效率低，自然表達(dá)也差。選擇適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，也是為了導(dǎo)入基因能穩(wěn)定高效的表達(dá)。骨髓作為受體細(xì)胞使用最多。反轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因，只能對(duì)分裂狀態(tài)時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行傳染，因此采取如5－FU處理，使細(xì)胞分裂增強(qiáng)，再用含有目的基因病毒顆粒傳染可獲較好效果。所以，對(duì)骨髓細(xì)胞培養(yǎng)、干細(xì)胞純化、培養(yǎng)時(shí)使用造血因子等方法，可增加基因穩(wěn)定高效表達(dá)。

2．導(dǎo)入基因的安全性基因治療的安全性應(yīng)確保不因?qū)胪庠茨康幕蚨a(chǎn)生新的有害遺傳變異，這是因?yàn)椴捎梅崔D(zhuǎn)錄病毒載體而引起的問題。因此，應(yīng)構(gòu)建相對(duì)安全的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。至于引起插入突變可能失活一個(gè)重要基因，或更嚴(yán)重的激活一個(gè)原癌基因，這個(gè)問題的危險(xiǎn)程度到底有多大仍不清楚，但實(shí)踐表明尚未見明顯嚴(yán)重問題。

為安全有效地進(jìn)行基因治療，任一方案的實(shí)施，都要根據(jù)嚴(yán)格的技術(shù)規(guī)程與標(biāo)準(zhǔn)，由有關(guān)的行政管理部門批準(zhǔn)實(shí)施。

與安全性相聯(lián)系的就是生殖細(xì)胞基因治療。雖然在人類尚未實(shí)施，但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲成功，這就是轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物出現(xiàn)。這一事實(shí)既給人類生殖細(xì)胞基因治療帶來了希望，同時(shí)也使人們耽心這種遺傳特征的變化世代相傳，將給人類帶來的是福還是禍。因此，許多科學(xué)家不僅對(duì)此持慎重態(tài)度，還有的持反對(duì)態(tài)度，也就是基因治療可能具有的潛在危險(xiǎn)性。

3．基因治療與社會(huì)倫理道德體細(xì)胞基因治療是符合倫理道德的，但試圖糾正生殖細(xì)胞遺傳缺陷或通過遺傳工程手段來改變正常人的遺傳特征則是引起爭議的領(lǐng)域。從歷史上看，科學(xué)的發(fā)明創(chuàng)造對(duì)人類生存發(fā)展的影響極其深刻，故遺傳學(xué)發(fā)展，可以進(jìn)行基因治療，應(yīng)該說是符合倫理道德的。重要的問題是取得社會(huì)的理解配合。首先是病人及其親屬的配合。因此，宣傳基因治療的科學(xué)性與安全性以及人類健康的重要性，以提高人們的認(rèn)識(shí)，同時(shí)建立并完善醫(yī)療法制與措施也是必要的。

為安全計(jì)，在臨床試驗(yàn)之前，必須在動(dòng)物研究中達(dá)到三項(xiàng)基本要求：①外源的基因能導(dǎo)入靶細(xì)胞并維持足夠長期有效；②該基因要以足夠的水平在細(xì)胞中表達(dá)；③該基因應(yīng)對(duì)細(xì)胞無害。

（1）1962年Szybalski等人類DNA去轉(zhuǎn)化人類細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Ca2﹢有刺激DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞的作用，為人工轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)邁出第一步。

（2）1967年Nirenberg提出遺傳工程空用于人類基因治療。

（3）1968年Burnett等用DEAE協(xié)同轉(zhuǎn)移的方法將病毒導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞。

（4）1972年Grahant等對(duì)磷酸鈣介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移過程進(jìn)行了詳細(xì)的研究，使這一技術(shù)得到普遍的接受和應(yīng)用。

（5）70年代初Graessman和Dicumak奠定了用顯微注射法轉(zhuǎn)移基因。

（6）1973年美國科學(xué)家和幾名醫(yī)生在德國進(jìn)行了首次基因治療實(shí)驗(yàn)。病人是一對(duì)體內(nèi)缺乏一種稀有酶的姐妹研究人員將一種攜帶有可使病人本身的酶分泌恢復(fù)正常的的病毒-肖普化乳頭瘤病毒注入患者體內(nèi)。實(shí)驗(yàn)無療效也無副作用。

（7）1980年美國醫(yī)生對(duì)兩名嚴(yán)重地中海貧血患者進(jìn)行基因治療，但也未能獲得成功。

（8）1988年美國國家衛(wèi)生研究院重組DNA咨詢委員會(huì)首次批準(zhǔn)將標(biāo)記基因?qū)肽[瘤浸潤淋巴細(xì)胞的實(shí)施方案。其結(jié)果對(duì)病人無害作用?；蛑委熤饾u解禁。

（9）1990年9月研究人員把線桿脫氫酶基因轉(zhuǎn)入患者體內(nèi)，其癥狀明顯緩解，治療獲得成功。

（10）在1991年中國復(fù)旦大學(xué)的研究人員進(jìn)行了“成纖維殘暴基因治療血友病B”項(xiàng)目，此外還開展了針對(duì)腫瘤和血液病的基因治療。

（11）2000年9月，一名18歲的男青年因基因治療而死于美國費(fèi)城。美國《科學(xué)》雜志曾連續(xù)刊登了美國食品和藥品管理局（FDA）宣布暫時(shí)禁止某大學(xué)進(jìn)行基因治療試驗(yàn)的報(bào)導(dǎo)。

（12）截至2005年7月，全世界已獲準(zhǔn)的基因治療臨床實(shí)驗(yàn)方案達(dá)1076項(xiàng)，其中，66%是針對(duì)癌癥的治療。

經(jīng)過十多年的發(fā)展，基因治療的研究已經(jīng)取得了不少進(jìn)展。但是，如今都還處于初期臨床試驗(yàn)階段，還不能保證穩(wěn)定的療效和安全性。盡管存在著許多障礙，但基因治療的發(fā)展趨勢(shì)仍是令人鼓舞的。或許正如基因治療的奠基者所欲言的那樣，基因治療這一新技術(shù)將會(huì)推動(dòng)21世紀(jì)的醫(yī)學(xué)革命。 [2-3]

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