健康的腸道微生物組(即腸道菌群)是一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)，很多科學(xué)家都稱(chēng)其為人體的“第二大腦”。但抗生素、感染、飲食或生活方式的重大改變，比如間歇性禁食，都可能導(dǎo)致這一生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生短暫或持久的變化。

　　近年來(lái)，禁食已成了科學(xué)界的新寵。越來(lái)越多的研究表明，禁食有很多的健康益處，包括改善代謝健康，預(yù)防或延緩年齡相關(guān)的疾病，甚至可以減緩腫瘤的生長(zhǎng)。

　　那么，禁食會(huì)對(duì)腸道菌群有什么樣的影響呢?

　　近日，來(lái)自深圳和哥本哈根的科學(xué)家們?cè)贜ature出版集團(tuán)旗下刊物《NPJ Biofilms Microbiomes》發(fā)表了題為“Intermittent fasting modulates the intestinal microbiota and improves obesity and host energy metabolism”的研究論文，明確了間歇性禁食(IF)干預(yù)后參與者的體重減輕，肥胖相關(guān)參數(shù)得到顯著改善。接著，研究者采用鳥(niǎo)槍法宏基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了腸道益生菌和碳水化合物降解菌顯著富集，即IF干預(yù)增加了碳水化合物活性酶的豐富性和多樣性。

　　一、研究背景

　　隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和飲食生活方式的傳播，肥胖已成為一個(gè)世界性問(wèn)題。作為一種禁食策略，IF有望成為對(duì)抗肥胖的一種選擇。與傳統(tǒng)禁食計(jì)劃相比，采用IF的方案后的平均體重和胰島素抵抗減輕更多。

　　腸道菌群在肥胖和相關(guān)疾病中起著重要作用，通過(guò)刺激營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和調(diào)節(jié)宿主代謝來(lái)預(yù)防或促進(jìn)肥胖。食物攝入的類(lèi)型和時(shí)間，會(huì)改變腸道菌群的晝夜節(jié)律。

　　已有研究證實(shí)，IF可根據(jù)16SrRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序調(diào)節(jié)腸道菌群。但I(xiàn)F引起的人類(lèi)腸道菌群變化尚未得到很好的表征，而且這種變化如何促進(jìn)體重減輕的細(xì)節(jié)仍不清楚。

　　二、研究方法

　　1、參與者招募

　　共計(jì)81人符合標(biāo)準(zhǔn)并參與了整個(gè)試驗(yàn)，72名參與者捐贈(zèng)了所需樣本。

　　納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)18-55歲;(2)18kg/m2?

　　排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)在過(guò)去4周內(nèi)接受過(guò)抗生素治療;(2)高血壓、糖尿病或其他代謝疾病病史;(3)懷孕、腸胃手術(shù)史或全身性疾病;(4)使用皮質(zhì)類(lèi)固醇藥物、β-受體阻滯劑或其他可能影響結(jié)果的藥物。

　　2、信息收集和生化檢測(cè)

　　IF干預(yù)為期三周，能量攝入設(shè)定在500-600kCal，均由代餐粉和蛋白棒提供。參與者被要求留在療養(yǎng)院，在禁食期間無(wú)法獲得額外的食物。每周五天安排代餐粉作為晚餐主食，其余時(shí)間提供正常飲食，參與者可隨意進(jìn)食。在干預(yù)開(kāi)始前一天和干預(yù)的最后一天進(jìn)行血液生化分析和糞便樣本采集。

　　3、糞便DNA提取和鳥(niǎo)槍法宏基因組測(cè)序

　　在IF干預(yù)前后共收集了175個(gè)參與者的糞便樣本。提取DNA在中國(guó)國(guó)家基因庫(kù)(CNGB)中進(jìn)行定量檢測(cè)，每個(gè)樣品的200ng DNA剪切成長(zhǎng)度約為300 bp的片段進(jìn)行下游反應(yīng)，接著在CNGB的DIPSEQ-T1(華大基因研究院)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。175個(gè)糞便樣本中獲得的宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)用于從頭組裝和分箱。

　　4、組裝和重疊群分箱

　　使用MEGAHIT(宏基因組組裝工具)單獨(dú)組裝樣本的清晰讀數(shù)，使用VAMB(變體自動(dòng)編碼器)進(jìn)行宏基因組分箱。dRep程序?qū)昊蚪M的箱進(jìn)行去復(fù)制，以獲得非冗余MAG(宏基因組組裝基因組)目錄。使用metaWRAP(宏基因組數(shù)據(jù)分析軟件包)進(jìn)行分析，以計(jì)算每個(gè)樣本中MAG的豐度。

　　5、MAG的分類(lèi)注釋

　　使用基因組分類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)工具包(GTDB-TkRelease95)分類(lèi)注釋。與已知種屬的任何基因組相比，平均核苷酸同一性(ANI)< 95%的分箱被認(rèn)為是未知種屬基因組分箱(uSGB)。

　　6、MAG的系統(tǒng)發(fā)育分析

　　MAG的基因預(yù)測(cè)和基因組注釋分別使用Prokka(原核生物的基因組自動(dòng)注釋工具)和metaWRAP的bins注釋模塊進(jìn)行。2934個(gè)代表性MAG的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)由PhyloPhlAn(分析菌群之間進(jìn)化關(guān)系軟件)進(jìn)一步構(gòu)建，以實(shí)現(xiàn)可視化。

　　7、菌群組成變化分析統(tǒng)計(jì)

　　來(lái)自72名參與者的144份糞便樣本數(shù)據(jù)被納入分析。使用vegan包執(zhí)行置換多元方差分析(PERMANOVA)。統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證體檢結(jié)果、血液生化參數(shù)和MAG相對(duì)豐度的變化。

　　8、菌群潛能分析比較

　　糞便宏基因組測(cè)序讀數(shù)被映射到IGC(腸型樣本)，并使用cOMG工具包計(jì)算樣本中基因的相對(duì)豐度。IGC的原始KO注釋用于注釋配置文件。調(diào)整分析KO相對(duì)豐度的變化并計(jì)算每個(gè)KEGG通路以評(píng)估功能通路的整體變化。

　　9、全基因組關(guān)聯(lián)研究

　　分析腸道菌群與臨床參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)。身體檢查和血液生化參數(shù)的數(shù)值結(jié)果用作響應(yīng)變量，而干預(yù)前后富集的MAG或KO的log10轉(zhuǎn)換相對(duì)豐度用作預(yù)測(cè)變量矩陣。使用ILAMM包執(zhí)行回歸。

　　三、研究結(jié)果

　　1、IF干預(yù)后體重減輕和臨床改善

　　72名成年中國(guó)志愿者在為期三周的干預(yù)研究后，結(jié)果顯示：

　　肥胖相關(guān)參數(shù)的顯著改善，包括BMI、體重和AI(動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù))——BMI平均下降1.32，體重平均下降3.67kg，而AI平均下降1.53。

　　不同BMI水平的參與者?在干預(yù)后體重平均減輕2.82公斤(正常)、3.84公斤(超重)和4.82公斤(肥胖)，以及AI也分別下降了1.23、1.50和2.10。

　　2、IF干預(yù)導(dǎo)致腸道菌群分類(lèi)組成發(fā)生顯著變化

　　72對(duì)匹配的樣本進(jìn)行鳥(niǎo)槍法宏基因組測(cè)序。通過(guò)從頭組裝和裝箱，總共回收了2934個(gè)MAG，包括241個(gè)已知屬和538個(gè)已知種。比較干預(yù)前后采集的樣本，共發(fā)現(xiàn)201個(gè)MAG的豐度不同，對(duì)能量代謝和肥胖發(fā)展產(chǎn)生有益影響的種屬菌群豐度增加。

　　3、IF干預(yù)后富集的菌群種屬含有豐富的碳水化合物活性酶(CAZymes)

　　通過(guò)在種屬水平上進(jìn)行分類(lèi)注釋?zhuān)骄?47個(gè)MAG中碳水化合物活性酶的多樣性和干預(yù)前后采集的樣本之間存在豐度差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在IF干預(yù)后表現(xiàn)出更高豐度的MAG中有更多類(lèi)型和更高拷貝數(shù)的碳水化合物活性酶編碼基因。這些基因中的大多數(shù)被注釋為糖苷水解酶(GHs)和糖基轉(zhuǎn)移酶(GTs)，表明腸道菌群利用多種碳源的能力得到了增強(qiáng)。

　　4、IF誘導(dǎo)的腸道菌群變化與宿主代謝和肥胖的臨床參數(shù)相關(guān)

　　共計(jì)發(fā)現(xiàn)136個(gè)MAG與至少一個(gè)臨床參數(shù)顯著相關(guān)，包括B.thetaiotaomicron(多形擬桿菌)的8個(gè)MAGs和P.distasonis(狄氏副擬桿菌)的17個(gè)MAGs，與AI呈負(fù)相關(guān)，其中84個(gè)與血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)也呈負(fù)相關(guān)。與AI負(fù)相關(guān)的86個(gè)MAG中的67個(gè)在IF干預(yù)后得到了豐富，確定了MAG的相對(duì)豐度與宿主臨床測(cè)量值之間的相關(guān)性。

　　5、IF干預(yù)增加了腸道菌群合成琥珀酸的潛能

　　待分析數(shù)據(jù)被映射到已發(fā)布的腸道菌群基因目錄以計(jì)算功能注釋基因的豐度。使用調(diào)整后的閾值?，發(fā)現(xiàn)25個(gè)KEGG直系同源物(KO)在IF干預(yù)后顯著富集，而16個(gè)KO的相對(duì)豐度下降。進(jìn)一步計(jì)算分析功能通路的富集，發(fā)現(xiàn)碳代謝、檸檬酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑在干預(yù)后顯著增強(qiáng)，這可能會(huì)導(dǎo)致更高的碳水化合物轉(zhuǎn)化和腸道菌群產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(SCFA)增加。

　　共計(jì)確定了220個(gè)KO與至少一個(gè)臨床參數(shù)相關(guān)。三種KO的相對(duì)豐度，即K00844(己糖激酶)、K06859(葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶)和K15037(生物素羧基載體蛋白)在琥珀酸的合成中發(fā)揮作用;K03146(半胱氨酸依賴(lài)性二磷酸腺苷噻唑合酶)，與硫胺素合成有關(guān)，以及與膽汁分泌有關(guān)的K05681干預(yù)后顯著升高，但與高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)密切相關(guān)的5個(gè)參數(shù)呈負(fù)相關(guān)。

　　四、總結(jié)

　　72名BMI范圍廣泛的中國(guó)志愿者參加了為期三周的IF計(jì)劃，在此期間，無(wú)論初始人體測(cè)量和腸道菌群狀態(tài)如何，平均體重減輕3.67公斤，且臨床參數(shù)得到改善。在干預(yù)前后收集糞便樣本并進(jìn)行鳥(niǎo)槍法宏基因組測(cè)序，從頭組裝產(chǎn)生了2934 MAG。結(jié)果分析顯示，干預(yù)后腸道益生菌和碳水化合物降解菌顯著富集，它們的相對(duì)豐度與肥胖和ASCVD相關(guān)參數(shù)呈負(fù)相關(guān)。干預(yù)后富集的MAG顯示，碳水化合物活性酶的高度豐富性和多樣性以及琥珀酸合成相關(guān)基因的相對(duì)豐度增加。

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