作者：劉超、崔琳琳、陳子江
山東大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究中心，濟(jì)南250001
通信作者：崔琳琳，Email：fdclear3@126.com
選自：中華婦產(chǎn)科雜志2019 年9月第54 卷第9期
【摘要】近年來臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，成年期心血管和代謝性疾病、過敏性疾病、神經(jīng)功能損害等遠(yuǎn)期慢性疾病的發(fā)生可追溯到生命起源時(shí)期。從配子生成至胚胎著床前的時(shí)期，是生命早期發(fā)育的重要階段。在這一時(shí)期，環(huán)境因素的改變可對(duì)生殖細(xì)胞、受精卵和胚胎的形態(tài)改變、基因重組、表觀遺傳學(xué)修飾及代謝等過程造成影響，并可進(jìn)一步對(duì)子代的遠(yuǎn)期健康產(chǎn)生影響。本文從生殖細(xì)胞發(fā)生和胚胎早期發(fā)育兩個(gè)階段，綜述環(huán)境因素對(duì)子代健康的遠(yuǎn)期影響及其潛在機(jī)制。
從生殖細(xì)胞發(fā)生至胚胎著床的整個(gè)階段，包括卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟、精子發(fā)生（spermatogenesis）、受精、卵裂、囊胚形成、胚胎孵化及著床，是生命早期發(fā)育的重要階段。
在這一階段，生殖細(xì)胞、受精卵和胚胎均會(huì)發(fā)生形態(tài)、基因、表觀遺傳和代謝的變化。胚胎的早期發(fā)育階段細(xì)胞數(shù)量少，具備全能性或多能性，環(huán)境因素對(duì)基因重組、表觀遺傳學(xué)修飾、能量代謝等過程的干擾可隨著卵裂的進(jìn)行而進(jìn)入之后的分裂周期，最終不可逆地改變發(fā)育程序。這段時(shí)期具有一定的可塑性，既可使胚胎在適應(yīng)環(huán)境的過程中受益，也可能產(chǎn)生對(duì)子代不利的遠(yuǎn)期影響。因此，健康和疾病的發(fā)育起源（DOHaD）學(xué)說提出，成年期的慢性疾病（包括心血管和代謝性疾病，如高血壓、肥胖、2型糖尿病等）、過敏性疾病、神經(jīng)功能損害等的起源均可追溯至發(fā)育早期。目前，DOHaD學(xué)說已被越來越多的流行病學(xué)及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究證實(shí)。本文從生殖細(xì)胞發(fā)生及胚胎早期發(fā)育兩個(gè)階段，綜述環(huán)境因素的改變對(duì)子代遠(yuǎn)期健康的影響及其可能的機(jī)制。
一、生殖細(xì)胞發(fā)生階段
（一）卵母細(xì)胞成熟
卵母細(xì)胞成熟（oocyte maturation）是指其減數(shù)分裂的過程。第1次減數(shù)分裂始于胎兒3個(gè)月時(shí)，初級(jí)卵母細(xì)胞在卵巢組織中經(jīng)過漫長(zhǎng)的過程，轉(zhuǎn)變?yōu)榇渭?jí)卵母細(xì)胞；第2次減數(shù)分裂時(shí)間則較短，次級(jí)卵母細(xì)胞迅速度過分裂前期而停滯在分裂中期，經(jīng)排卵后等待受精，最終在受精過程中完成第2次減數(shù)分裂。在卵母細(xì)胞成熟的最后階段，母親的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)及其年齡等因素會(huì)損傷卵母細(xì)胞的質(zhì)量，進(jìn)而可能改變胚胎發(fā)育。這種改變可持續(xù)整個(gè)妊娠期，甚至影響子代的遠(yuǎn)期健康。
1. 營(yíng)養(yǎng)過剩：研究提示，超重和肥胖女性的卵母細(xì)胞較小，發(fā)育潛能較低；所形成的胚胎發(fā)育快，囊胚期滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞數(shù)量少，葡萄糖攝取少［1］。子代則表現(xiàn)為一系列疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高，包括肥胖及2型糖尿病等代謝性疾病、冠心病及卒中等心血管疾病、腦癱等神經(jīng)發(fā)育障礙，以及哮喘等過敏性疾病。其原因一方面可能是對(duì)卵母細(xì)胞的直接影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飲食誘導(dǎo)的營(yíng)養(yǎng)過剩小鼠卵母細(xì)胞線粒體DNA合成增加，活性氧增多，谷胱甘肽耗盡，氧化還原狀態(tài)平衡被打破，產(chǎn)生氧化應(yīng)激［2］，而活性氧的積累會(huì)通過線粒體和死亡受體通路引起卵巢組織中卵泡凋亡增加［3］。另有研究表明，高脂飲食可能與卵母細(xì)胞非整倍體性減數(shù)分裂有關(guān)［4］。另一方面原因則可能是卵泡液成分的改變，影響卵母細(xì)胞發(fā)育的微環(huán)境。肥胖女性的卵泡液中胰島素、瘦素、C反應(yīng)蛋白、乳酸、三酰甘油含量增加，性激素結(jié)合球蛋白水平降低［5?6］，而高脂卵泡液可使卵母細(xì)胞脂質(zhì)含量增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激標(biāo)志物增加，卵母細(xì)胞核成熟受損［7］。
2. 營(yíng)養(yǎng)不足：大型隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，圍受孕期母親如遭遇饑荒，子代成年期高血壓等心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加［8］。給予雌性大鼠低蛋白飲食（low protein diet），子代會(huì)出現(xiàn)出生體重低和收縮壓升高［9］，并可造成子代雌性小鼠卵巢中原始卵泡的數(shù)量減少，影響子代的遠(yuǎn)期生育力［10］。即使縮短低蛋白飲食時(shí)間，僅在交配前（3.5 d）給予雌性小鼠低蛋白飲食，子代也會(huì)出現(xiàn)焦慮行為增加、收縮壓升高［11］。機(jī)制研究提示，營(yíng)養(yǎng)不足的綿羊卵母細(xì)胞體外受精后發(fā)育成桑葚胚和囊胚的數(shù)量減少，推測(cè)營(yíng)養(yǎng)不足可造成卵母細(xì)胞質(zhì)量下降［12］。表觀遺傳學(xué)修飾的變化可能發(fā)揮一定的作用，但具體機(jī)制目前并不明確。
3. 高齡：雖然目前也有極少數(shù)研究認(rèn)為女性高齡與其子代遠(yuǎn)期的疾病發(fā)病率無顯著相關(guān)性，但一般認(rèn)為，高齡女性卵巢功能及生育力下降，自然流產(chǎn)率增加，輔助生殖技術(shù)治療成功率較低，子代患先天性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加［13?14］，子代可出現(xiàn)出生體重偏低。而出生體重與遠(yuǎn)期心血管疾病及代謝障礙相關(guān)。另有數(shù)據(jù)表明，高齡母親的子代發(fā)生肥胖及自閉癥的風(fēng)險(xiǎn)均增加。有研究發(fā)現(xiàn)，高齡女性卵母細(xì)胞在第1次減數(shù)分裂時(shí)姊妹染色單體會(huì)過早分離，異常減數(shù)分裂的概率增加；聯(lián)會(huì)染色體的穩(wěn)定性及紡錘體組裝檢查點(diǎn)的形成和穩(wěn)定性也可能受到影響［15］，因而高齡可降低卵母細(xì)胞質(zhì)量，增加子代的患病風(fēng)險(xiǎn)。但目前關(guān)于高齡造成子代心血管或代謝等方面的遠(yuǎn)期影響的具體機(jī)制并不清楚。
（二）精子發(fā)生
精子發(fā)生是指從精原細(xì)胞形成高度分化精子的過程，包括有絲分裂、減數(shù)分裂和精子形成3個(gè)階段。生精小管中，A型精原細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的B型精原細(xì)胞分化為初級(jí)精母細(xì)胞；再經(jīng)過減數(shù)分裂形成單倍體的圓形精子細(xì)胞；最后通過復(fù)雜的形態(tài)學(xué)變化以及核蛋白轉(zhuǎn)型和修飾，形成成熟精子。精子發(fā)生的過程同樣易受營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和年齡影響，并可傳遞給子代［16］。
1. 營(yíng)養(yǎng)過剩：肥胖男性的伴侶臨床妊娠率低、囊胚發(fā)育差、活產(chǎn)率低。而在子代遠(yuǎn)期健康方面，動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，雌性子代出現(xiàn)胰島β細(xì)胞功能障礙、體重增加、糖耐量減低及胰島素敏感性下降［17］。更嚴(yán)重的是，父親肥胖還可跨代影響其孫代的代謝表型。其機(jī)制可能在于肥胖對(duì)精子質(zhì)量的潛在影響。
前期研究結(jié)果提示，不同體質(zhì)指數(shù)（BMI）男性中前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)有顯著差異，高糖高脂飲食男性的精子運(yùn)動(dòng)力降低。精子DNA研究發(fā)現(xiàn)，男性BMI與精子DNA碎片指數(shù)呈正相關(guān)［18］，而精子DNA斷裂程度又與囊胚發(fā)育呈負(fù)相關(guān)［19］。此外，Bakos等［20］還發(fā)現(xiàn)，高脂飲食的雄性小鼠精子內(nèi)活性氧水平升高，DNA損傷增加，精子活力下降，與卵母細(xì)胞的結(jié)合減少，推測(cè)DNA損傷的原因可能是氧化應(yīng)激。
但Tunc等［21］發(fā)現(xiàn)，精子內(nèi)活性氧水平增加的幅度很小，且精子DNA完整性和精子活力并未隨著活性氧的增加而降低。因此，這一機(jī)制尚存爭(zhēng)議。另外，精子中包含多種RNA，高脂飲食小鼠雄性子代的精子中多種類型的小分子RNA豐度有改變。這些小分子RNA可隨受精過程進(jìn)入受精卵，對(duì)子代表型造成影響。將高脂飲食雄性小鼠精子中的小分子RNA注射入正常受精卵，早期胚胎出現(xiàn)代謝相關(guān)基因的表達(dá)改變，子代出現(xiàn)胰島素分泌減少和糖耐量減低［22］。
2. 營(yíng)養(yǎng)不足：研究表明，受精前父親營(yíng)養(yǎng)不良會(huì)影響子代的發(fā)育及代謝。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，交配前7周給予雄性小鼠低蛋白飲食，子代可表現(xiàn)為血管功能障礙、糖耐量受損、膽固醇和脂質(zhì)代謝改變［23?24］；而減少雄性小鼠葉酸的攝入，其子代顱面部及肌肉骨骼畸形等出生缺陷增加［25］。這種影響最可能通過改變精子的遺傳信息而傳遞給子代。van der Heijden等［26］發(fā)現(xiàn)，精子DNA中組蛋白甲基化后盤繞形成的核小體可隨受精過程進(jìn)入受精卵，并推測(cè)這些甲基化信息可被復(fù)制。而對(duì)葉酸攝入不足的雄性小鼠精子行DNA甲基化分析，發(fā)現(xiàn)了與發(fā)育、腫瘤、糖尿病、自閉癥和精神分裂癥等慢性疾病相關(guān)基因的甲基化差異［25］。這表明，父親攝入的葉酸減少可通過改變精子DNA的甲基化，而對(duì)子代的遠(yuǎn)期健康產(chǎn)生影響。
3. 高齡：與女性相同，男性生育力、睪丸功能、精子數(shù)量和質(zhì)量也隨年齡增長(zhǎng)而下降。關(guān)于父親年齡與子代不良圍產(chǎn)結(jié)局間的相關(guān)性，包括小于胎齡兒、死產(chǎn)、早產(chǎn)、低出生體重等有較多報(bào)道。高齡父親的子代患肌肉骨骼綜合征、腭裂、急性淋巴細(xì)胞性白血病、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、自閉癥和精神分裂癥等疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加［27］。另外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雄性小鼠高齡與其雄性子代的生殖健康相關(guān)。父親高齡對(duì)子代結(jié)局的影響可能由抗氧化機(jī)制減弱、精子基因突變的累積等所致［28］。
二、胚胎早期發(fā)育階段
精卵相遇后形成受精卵并開始卵裂，經(jīng)過4細(xì)胞、8細(xì)胞及桑葚胚階段，細(xì)胞數(shù)量逐步增多并呈有序排列。細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量后小的腔隙融合，形成囊胚。此時(shí)胚胎細(xì)胞分化出滋養(yǎng)層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。囊胚繼續(xù)增長(zhǎng)、變大，從透明帶中脫出，并植入母體蛻膜，稱為著床。這段時(shí)期暴露于環(huán)境的變化或刺激因素，可能會(huì)影響胚胎的發(fā)育軌跡，進(jìn)而導(dǎo)致子代新生兒期、兒童期乃至成年期的表型變化。
1. 母親營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的變化：母體環(huán)境與早期胚胎相互影響，相互關(guān)聯(lián)。有研究認(rèn)為，囊胚著床前，可通過哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）信號(hào)通路感知母體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，即游離支鏈氨基酸和胰島素的水平，激活代償機(jī)制，永久性地改變囊胚各胚層的發(fā)育模式，包括刺激滋養(yǎng)細(xì)胞增殖，使著床時(shí)侵襲子宮內(nèi)膜更深［29］；增強(qiáng)卵黃囊胎盤對(duì)母體蛋白的胞吞作用以加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)［30］；以及改變胚胎的表觀遺傳學(xué)機(jī)制［31］；并在隨后的妊娠階段加強(qiáng)從母體的營(yíng)養(yǎng)獲取。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，僅在胚胎著床前（交配后0~4.25 d）給予雌性小鼠低蛋白飲食，其血液中葡萄糖水平升高，胰島素及游離支鏈氨基酸的水平降低，宮腔液中游離支鏈氨基酸水平也降低，子代表現(xiàn)為低出生體重及高血壓［32］。
受孕前后母親的營(yíng)養(yǎng)過剩也可影響新鮮胚胎的基因表達(dá)，加重玻璃化冷凍對(duì)胚胎的損害，并改變子代的心血管、代謝及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。
2. 母體的炎癥反應(yīng)：Williams等［33］通過腹腔注射脂多糖建立炎癥小鼠模型并使其交配，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受孕后胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)量減少；出生的雄性子代活動(dòng)減少，BMI增加；雌性子代先天性免疫受抑制，且抑制程度與母體脂多糖的濃度有關(guān)。因此推測(cè)，著床前胚胎對(duì)母體的炎癥反應(yīng)敏感，出生后的遠(yuǎn)期行為、代謝和先天性免疫反應(yīng)也會(huì)受到影響。
3. 體外培養(yǎng)環(huán)境對(duì)胚胎早期發(fā)育的影響：胚胎體外培養(yǎng)是輔助生殖技術(shù)的重要環(huán)節(jié)，有研究認(rèn)為，這一過程中的多種因素，包括體外培養(yǎng)基成分、體外培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)及胚胎凍融，均可能會(huì)對(duì)子代造成遠(yuǎn)期影響。
Sj?blom等［34］發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)環(huán)境缺乏粒細(xì)胞?巨噬細(xì)胞集落刺激因子時(shí)，胚胎生長(zhǎng)受限，子代成年期體重和脂肪含量增加；而添加該因子，可移植胚胎數(shù)、活產(chǎn)率及胎盤滋養(yǎng)層表面積增加，成年期肥胖有所改善。Rexhaj等［35］的研究表明，在培養(yǎng)基中加入褪黑素可預(yù)防子代小鼠的血管功能障礙和動(dòng)脈高壓。
對(duì)于移植時(shí)期的選擇，目前并無統(tǒng)一定論，一般選擇8細(xì)胞卵裂球期胚胎或囊胚期胚胎。囊胚移植相比于卵裂球移植，暴露于體外培養(yǎng)環(huán)境的時(shí)間延長(zhǎng)，也可能因此影響子代的遠(yuǎn)期健康。研究發(fā)現(xiàn)，囊胚移植時(shí)出現(xiàn)大于胎齡兒、早產(chǎn)（孕周<37周）、極早產(chǎn)（孕周<32周）及出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)較高，且子代出生體重增加。而出生體重又與成年期代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，提示其遠(yuǎn)期代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)可能增加。
胚胎冷凍是輔助生殖技術(shù)的核心環(huán)節(jié)之一，可減少取卵手術(shù)次數(shù)，降低卵巢過度刺激的風(fēng)險(xiǎn)，保存生育力。冷凍方法有傳統(tǒng)慢速冷凍法和玻璃化冷凍法兩種，后者因胚胎完整性及復(fù)蘇率高，且成本低、易操作，得到了廣泛應(yīng)用。但有研究發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍技術(shù)仍會(huì)降低胚胎的生存能力及發(fā)育潛力［36?37］，增加大于胎齡兒及高出生體重兒的風(fēng)險(xiǎn)［38］，并可影響兒童期身高及血液代謝指標(biāo)等表型［39］。目前，凍胚對(duì)子代遠(yuǎn)期健康的影響尚存爭(zhēng)議。
綜上所述，現(xiàn)有的證據(jù)表明，環(huán)境因素會(huì)在生殖細(xì)胞發(fā)生和胚胎早期發(fā)育的整個(gè)過程中對(duì)子代的遠(yuǎn)期健康造成影響，但機(jī)制尚不完全明確。未來應(yīng)通過基礎(chǔ)研究深入探索這一時(shí)期的影響因素和作用機(jī)制，并結(jié)合大樣本量長(zhǎng)隨訪時(shí)限的隊(duì)列研究驗(yàn)證其遠(yuǎn)期影響，以充分認(rèn)識(shí)并預(yù)防胎源性疾病的發(fā)生。
參考文獻(xiàn)：略
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