調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）因其免疫耐受作用，參與了腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，是癌癥靶向治療的主要靶點(diǎn)之一。免疫代謝（Immunometabolism）在調(diào)節(jié)細(xì)胞狀態(tài)和命運(yùn)的作用機(jī)制越來(lái)越得到關(guān)注，Treg是否也受到免疫代謝所產(chǎn)生的異質(zhì)性環(huán)境影響，而進(jìn)一步影響其靶向治療效果呢？2021年2月美國(guó)孟菲斯市圣猶大兒童研究醫(yī)院免疫學(xué)系，遲洪波教授團(tuán)隊(duì)于《Nature》上發(fā)表了一篇《Lipid signalling enforces functional specialization of T(reg) cells in tumours》，闡述了脂質(zhì)代謝重編程增強(qiáng)了腫瘤中Treg細(xì)胞的功能專一性。

1. 免疫代謝在調(diào)節(jié)細(xì)胞狀態(tài)和命運(yùn)中的基本作用已開(kāi)始被闡明，但特定環(huán)境決定的代謝作用尚未得到充分詮釋，特別是Treg細(xì)胞，其如何重新連接代謝程序以增強(qiáng)Treg細(xì)胞對(duì)腫瘤的功能適應(yīng)。為了探索Treg細(xì)胞在腫瘤中的功能適應(yīng)的分子機(jī)制，使用B16黑色素瘤接種WT小鼠后，對(duì)從腫瘤和瘤旁組織中分離出來(lái)的Treg細(xì)胞與外周淋巴結(jié)(PLNs)的作比較，進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。使用固化代謝途徑的基因組富集分析(GSEA)，提示：與PLNs相比，腫瘤中的Treg與脂質(zhì)代謝相關(guān)的途徑的富集度最高(Fig. 1a)。特別是固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)，作為促進(jìn)脂類重新合成的轉(zhuǎn)錄因子，在GSEA中顯示為高度富集的靶基因。遺傳通路分析還顯示，在瘤內(nèi)Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子中，SREBP1（由Srebf1編碼）和 SREBP2（由Srebf2編碼）為上游頂部富集區(qū)。該富集區(qū)在小鼠黑色素瘤模型的公共單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNAseq)數(shù)據(jù)集中得到了進(jìn)一步的證實(shí)，并在其他腫瘤細(xì)胞如乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中得到相似的結(jié)果。由此表明：在腫瘤微環(huán)境(TME)中的Treg細(xì)胞上調(diào)了SREBP基因。

2. 為了確定SREBP信號(hào)通路在Treg細(xì)胞中的重要功能，使用Cre/loxP重組酶系統(tǒng)，建立了MC38腺癌小鼠及B16黑色素瘤小鼠模型的SCAP基因敲除鼠。SCAP(SREBP裂解激活蛋白)基因作為SREBP激活的必要啟動(dòng)子，被敲除后，明顯抑制了小鼠黑色素瘤瘤內(nèi)Treg細(xì)胞中SREBP基因靶點(diǎn)的表達(dá)。且Foxp3Cre Scapfl/fl小鼠中，B16黑色素瘤的生長(zhǎng)顯著減少（Fig. 1c）。為了探索SCAP/SREBP信號(hào)通路是否可作為腫瘤治療的潛在標(biāo)靶，研究人員亦建立了腫瘤小鼠中Treg細(xì)胞Scap基因的急性敲除模型，在成瘤后予以他莫昔芬和抗PD-1免疫治療，在兩種治療方案下，SCAP敲除小鼠的腫瘤生長(zhǎng)都有所減少，且對(duì)抗PD-1治療尤為敏感(Fig. d-f)。以上結(jié)果提示：針對(duì)Treg細(xì)胞中的SCAP/SREBP信號(hào)通路的靶向治療會(huì)釋放出強(qiáng)大的抗腫瘤作用。

3. 為了確定SCAP缺陷Treg細(xì)胞在形成TME中的影響，研究者使用scRNAseq來(lái)描述B16腫瘤小鼠的CD45+免疫細(xì)胞(Fig. 2a)。與對(duì)照組相比，F(xiàn)oxp3CreScapfl/fl小鼠的TME中總/效應(yīng)/記憶CD8+T細(xì)胞和總Foxp3-CD4+T細(xì)胞的比例增加(Fig 2)，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析進(jìn)行驗(yàn)證。 

4. CD8+T細(xì)胞與Treg細(xì)胞的比例是癌癥相關(guān)的關(guān)鍵預(yù)后因子，在Foxp3CreScapfl/fl腫瘤中其比例也是增加的(Fig. 2c)。然而MC38結(jié)腸腺癌在Foxp3CreScapfl/fl小鼠中被排斥（Fig.1b），這樣CD8+T細(xì)胞的耗竭導(dǎo)致部分腫瘤恢復(fù)生長(zhǎng)，表明此效應(yīng)部分依賴于CD8+T細(xì)胞的功能。

5. 此外，scRNAseq分析確定了Foxp3CreScapfl/fl小鼠腫瘤中Treg細(xì)胞的比例降低(Fig. 2b)。流式細(xì)胞術(shù)分析還顯示，腫瘤中Treg細(xì)胞的占比降低，但其在Foxp3CreScapfl/fl小鼠的PLNs的占比沒(méi)有降低，而瘤內(nèi)Treg細(xì)胞的數(shù)量沒(méi)有減少，可能是因?yàn)槟[瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞總數(shù)的增加。與腫瘤相比，在穩(wěn)態(tài)下Treg細(xì)胞的積累沒(méi)有變化。

6. 接著本文確定了SCAP缺乏對(duì)Treg細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響。與CD8+T細(xì)胞增殖中SCAP介導(dǎo)的膽固醇生物合成的要求一致，體外急性抗原刺激后，SCAP缺陷的Treg細(xì)胞顯示有缺陷增殖，但這種缺陷可被膽固醇補(bǔ)充劑部分逆轉(zhuǎn)。然而，F(xiàn)oxp3CreScapfl/fl小鼠腫瘤中的Treg細(xì)胞或PLNs并沒(méi)有顯示出胸苷類似物BrdU的變化，而SCAP缺乏對(duì)PLNs的Treg細(xì)胞也表現(xiàn)出由淋巴細(xì)胞減少誘導(dǎo)出增殖，這種現(xiàn)象同樣也能被IL-2/抗IL-2復(fù)合物的治療而引起。此外，與代謝驅(qū)動(dòng)的增殖密切相關(guān)的CTLA4(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4)的表達(dá)并沒(méi)有因SCAP缺乏而改變。因此，SCAP功能在穩(wěn)態(tài)和TME下對(duì)Treg細(xì)胞的增殖很大程度上是可有可無(wú)的，這突出了在CD8+T細(xì)胞中觀察到的環(huán)境特異性增殖需求。

7. 檢查Treg細(xì)胞的凋亡，發(fā)現(xiàn)SCAP缺陷的Treg細(xì)胞在腫瘤中活性Caspase-3（一種觸發(fā)細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)）染色增加，但在PLNs中沒(méi)有增加。然而，CD36的表達(dá)(調(diào)節(jié)瘤內(nèi)Treg細(xì)胞生存所需的脂質(zhì)攝取)和中性脂質(zhì)的攝取不受SCAP缺乏的影響。同時(shí)檢測(cè)了對(duì)照和SCAP缺乏的Treg細(xì)胞也顯示出類似的線粒體輪廓，包括線粒體質(zhì)量、膜電位和活性氧的產(chǎn)生。因此，SCAP對(duì)脂質(zhì)攝取和線粒體適應(yīng)性雖非必要，但有助于瘤內(nèi)Treg細(xì)胞的生存。

8. 文獻(xiàn)亦探討了SCAP可能參與Treg細(xì)胞從靜止的rTreg(CD44loCD62Lhi)細(xì)胞到激活的aTreg(CD44hiCD62Llo)種群的分化，以及Foxp3表達(dá)變化，這兩者的表達(dá)都是炎癥形成的條件。在穩(wěn)態(tài)時(shí)，即使SCAP缺失，F(xiàn)oxp3的表達(dá)和腫瘤中aTreg的累積無(wú)論是數(shù)量和比例均無(wú)明顯變化，所以SCAP在aTreg細(xì)胞累積和Foxp3表達(dá)變化上也非必要。

9. 在腫瘤內(nèi)有一種特殊的“脆弱Treg細(xì)胞”，它表達(dá)Foxp3，但卻存在分泌IFNγ障礙。研究發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)態(tài)時(shí)，可分泌IFNγ的Treg細(xì)胞并未因?yàn)镾CAP缺乏而發(fā)生改變；但與對(duì)照組相比，在SCAP缺失小鼠腫瘤內(nèi)，能分泌干擾素的IFNγ+Treg表達(dá)增加（PLNs內(nèi)卻無(wú)此變化），且無(wú)論是B16黑色素瘤還是MC38結(jié)腸腺癌模型的腫瘤生長(zhǎng)速度均受到顯著抑制，這與脆弱Treg細(xì)胞在腫瘤中重塑TME的作用一致。

10. 對(duì)照組和Foxp3CreScapfl/fl小鼠的腫瘤浸潤(rùn)性Treg細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，SREBP在腫瘤Treg細(xì)胞中激活兩種脂代謝通路, 包括脂肪酸合成和甲羥戊酸(mevalonate)代謝途徑(Fig. 3a,b)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)：Treg細(xì)胞中的FASN（脂肪酸合酶）缺失抑制了MC38和B16腫瘤的生長(zhǎng)(Fig. 3c,d),但受SCAP缺失影響的僅TME。而FASN缺乏的Treg細(xì)胞中脂肪酸代謝途徑下調(diào)。值得注意的是，由激活的TCRs（T細(xì)胞抗原受體）所驅(qū)動(dòng)的Treg特異性基因也被下調(diào)了。假設(shè)FASN信號(hào)傳遞有助于Treg細(xì)胞的TCR依賴性激活和/或功能成熟。新分離的FASN缺乏Treg細(xì)胞在體外具有正常的抑制功能，由TCR誘導(dǎo)激活后，F(xiàn)ASN缺陷激活的Treg細(xì)胞功能降低。為了將FASN與脂肪酸合成聯(lián)系起來(lái)，體外添加了FASN的產(chǎn)物——棕櫚酸鹽，發(fā)現(xiàn)可恢復(fù)因FASN缺乏導(dǎo)致的Treg細(xì)胞激活障礙的作用（Fig. 3e）。此外，盡管有正常TCR誘導(dǎo)的增殖，F(xiàn)ASN缺乏仍損害了TCR依賴的Treg細(xì)胞激活和成熟的標(biāo)記上調(diào)。綜上所述，F(xiàn)ASN介導(dǎo)脂肪酸合成通路可促進(jìn)瘤內(nèi)Treg細(xì)胞的功能成熟，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

11. SCAP/SREBP激活下游的其他機(jī)制也通過(guò)scRNAseq和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，瘤內(nèi)SCAP缺乏的Treg細(xì)胞降低其Pdcd1及PD-1表達(dá)顯著降低，但在PLNs中沒(méi)有降低(Fig. 3f)。相比之下，SCAP缺陷的Treg細(xì)胞在Treg特征分子CTLA4、ICOS、CD69、CD25、Nrp-1、CD39和CD73有正常表達(dá)。穩(wěn)態(tài)下，F(xiàn)oxp3CreScapfl/fl小鼠的脾臟或NLT（非淋巴樣組織）上的PD-1表達(dá)沒(méi)有改變。因此，SCAP/SREBP信號(hào)是腫瘤中Treg細(xì)胞表達(dá)PD-1的必要信號(hào)，而在PLNs和NLT中則不需要。PD-1已被證明通過(guò)磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的抑制信號(hào)，而PI3K的激活與Treg細(xì)胞的IFNγ產(chǎn)生的增加有關(guān)?？筆D-1治療后，增加了Treg細(xì)胞中的IFNγ表達(dá),且Treg細(xì)胞在腫瘤中pAKT和S6蛋白水平升高，但在PLNs中沒(méi)有(Fig.3g, h)。而SCAP缺乏的Treg細(xì)胞在腫瘤中pAKT和S6水平亦升高，進(jìn)一步支持SCAP和PD-1信號(hào)在瘤內(nèi)Treg細(xì)胞PI3K活性中的作用(Fig. 3i, j)。SCAP/SREBP和PD-1抑制了腫瘤內(nèi)Treg細(xì)胞中的IFNγ表達(dá)和PI3K信號(hào)傳導(dǎo)。

12. 為了確定TME和其他背景對(duì)Treg細(xì)胞的PD-1表達(dá)的影響，并檢查不同模型中PD-1的調(diào)節(jié)。與脾臟Treg細(xì)胞相比，TME Treg細(xì)胞誘導(dǎo)PD-1表達(dá)增加；然而，在EAE模型中并沒(méi)有觀察到Treg細(xì)胞誘導(dǎo)PD-1的表達(dá)增加(Fig. 4a)。在分子水平上SREBP信號(hào)是如何調(diào)控PD-1的表達(dá)，與上述表面蛋白的調(diào)節(jié)相一致,在腫瘤中，Pdcd1但不是Icos，其mRNA的表達(dá)降低，但在PLNs中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)差異(Fig. 4b)，提示SREBP信號(hào)主要影響瘤內(nèi)Treg細(xì)胞中Pdcd1表達(dá)。

13. 為了確定調(diào)節(jié)PD-1表達(dá)的上游信號(hào)，對(duì)從TME中分離出來(lái)的PD-1hi和PD-1loTreg細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。PD-1hi細(xì)胞中Treg特異性的TCR依賴的基因及Nur77-GFP的表達(dá)升高(Fig.4d)。此外，體外TCR刺激后，PD-1在Treg細(xì)胞上的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)也上調(diào)了SREBP基因靶點(diǎn)的表達(dá)，表明PD-1表達(dá)依賴TCR誘導(dǎo)。值得注意的是，Treg細(xì)胞中的SCAP缺失損害了TCR誘導(dǎo)的表面PD-1的表達(dá)(Fig. 4e)。因此，SCAP/SREBP信號(hào)傳遞將TCR刺激與Treg細(xì)胞上的PD-1表達(dá)聯(lián)系起來(lái)。

14. SREBPs調(diào)節(jié)脂肪酸合成和甲戊酸代謝酶的表達(dá)。脂肪酸的合成對(duì)于PD-1的表達(dá)是不可或缺的，因?yàn)镻D-1的水平在瘤內(nèi)FASN缺乏的Treg細(xì)胞上不受干擾，甲戊酸代謝的參與，有助于合成膽固醇和異戊二烯類，且甲戊酸代謝有助于膽固醇和異戊二烯類藥物的合成。通過(guò)代謝組學(xué)追蹤示，SCAP缺乏的Treg細(xì)胞中醋酸衍生碳與膽固醇的結(jié)合有所減少(Fig. 4f)。針對(duì)甲戊酸代謝中的限速酶HMGCR的辛伐他汀，可以抑制TCR刺激的Treg細(xì)胞上PD-1的表達(dá)(Fig. 4g)。此外，HMGCR缺陷的Treg細(xì)胞在TCR刺激時(shí)顯示PD-1表達(dá)有缺陷。然而，補(bǔ)充SCAP缺陷的Treg細(xì)胞的膽固醇，可部分糾正增殖缺陷。CTLA4的上調(diào)，不影響PD-1的表達(dá)。這些結(jié)果揭示了與膽固醇無(wú)關(guān)的甲戊酸鹽代謝對(duì)Treg細(xì)胞PD-1調(diào)節(jié)的重要性。

15. 除膽固醇外，甲戊酸鹽途徑還分別生成類異戊二烯法尼基焦磷酸酯(FPP)和香葉基香葉基焦磷酸酯(GGPP)， 這些脂質(zhì)分子通過(guò)法尼基轉(zhuǎn)移酶（Fntb編碼的催化基因）和香葉酰香葉酰轉(zhuǎn)移酶I型（Pggt1b編碼的催化亞基）的酶活性調(diào)節(jié)法尼基化和香葉基香葉化的翻譯后蛋白修飾。HMGCR下游的代謝物在辛伐他汀治療的Treg細(xì)胞上的PD-1表達(dá)。(Fig. 4h)。值得注意的是，GGPP治療也恢復(fù)了這些細(xì)胞上PD-1的表達(dá)，而FPP只顯示出輕微的補(bǔ)救效果(Fig. 4h)。此外，甲戊酸鹽或GGPP治療也在很大程度上挽救了辛伐他汀治療的Treg細(xì)胞中Pdcd1mRNA的表達(dá)。這些結(jié)果表明GGPP依賴蛋白香葉基香葉化在促進(jìn)Treg細(xì)胞PD-1表達(dá)中的作用。 

綜上所述，SCAP的缺失會(huì)導(dǎo)致腫瘤組織而不是外周淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞上PD-1表達(dá)減少，甲羥戊酸代謝介導(dǎo)的蛋白四異戊二烯化可增強(qiáng)Treg細(xì)胞中PD-1的表達(dá)。如此，SCAP/SREBP介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝通路對(duì)于Treg細(xì)胞特異性的在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，為腫瘤免疫治療提供了新的細(xì)胞和分子靶點(diǎn)，也再次強(qiáng)調(diào)了脂肪代謝在免疫系統(tǒng)中的地位。

編譯：凌佳倩

審校：張軍，繆長(zhǎng)虹

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