本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，尤其涉及一種內生菌的分離方法。
背景技術：
內生菌是指生活史全部階段或者部分階段生活在活的植物組織內，而同時又不引起植物明顯病害癥狀的微生物。“內共生理論”認為與宿主共同進化的內生菌可能從宿主中獲得相關基因的傳遞，具有合成與宿主相同或相似代謝產(chǎn)物的能力。1993年，首次從短葉紅豆杉中分離得到一株能夠產(chǎn)生抗癌物質—紫杉醇的內生真菌，進一步證實了“內共生理論”。植物內生菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物是天然藥用活性物質的重要來源，而且很大一部分天然產(chǎn)物是新型生物活性物質，具有廣闊的應用前景。由于植物內生菌繁殖速度快、產(chǎn)生代謝產(chǎn)物種類多，加強對植物內生菌的開發(fā)和利用，是尋找和開發(fā)新藥物的良好途徑，具有良好的應用前景和開發(fā)利用價值。番石榴葉中含有豐富的營養(yǎng)物質，新鮮成熟的番石榴葉中含有較高的蛋白質和可溶性糖。同時含有黃酮類、多酚類、三萜類、雜源萜類、揮發(fā)油、植物多糖等功能活性成分。研究表明番石榴葉提取物具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗微生物、抗腹瀉、抗腫瘤及保護肝臟的作用?，F(xiàn)有技術中公布的內生菌分離方法并不能很好的適用于番石榴葉內生菌的分離，研究開發(fā)一種從番石榴葉中高效分離內生菌的方法能顯著擴大番石榴的應用范圍，具有廣闊的市場價值。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是克服以上
背景技術：
中提到的不足和缺陷，提供一種番石榴葉內生菌的分離方法，該方法特別適用于番石榴葉，其內生菌的分離效果更好。為解決上述技術問題，本發(fā)明提出的技術方案為：一種番石榴葉內生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)在夏季采集具有10年以上樹齡的新鮮番石榴老葉，低溫放置(在4℃下放置24h)；10年以上樹齡的番石榴老葉具有的內生菌種類最多的特點，且夏季樹葉生長茂盛是采集番石榴葉的最好的時期；番石榴葉在低溫保存24h后，表面的微生物會受到抑制，有利于葉片表面消毒；(2)對番石榴老葉進行表面滅菌處理得到備用葉片；表面滅菌處理的目的在于除去葉片表面的雜菌；(3)將步驟(2)中得到的備用葉片剪碎后，加入生理鹽水與纖維素酶后研磨成勻漿，將勻漿稀釋后涂布到培養(yǎng)平板上培養(yǎng)；將勻漿稀釋后涂布到培養(yǎng)平板上培養(yǎng)；番石榴葉為革質葉片，質地較堅固，研磨時加入一定量的纖維素酶可以分解植物纖維及細胞壁，可以促進內生菌的浸出；(4)待培養(yǎng)平板上長出菌落時，挑選單菌落，進行劃線分離純化，即得到番石榴葉內生菌。上述分離方法中，優(yōu)選的，表面滅菌處理包括以下步驟：用自來水沖洗步驟(1)中經(jīng)低溫放置后的番石榴葉，將葉片放在無菌水中浸泡，同時加入2-3滴洗潔精，使用磁力攪拌儀低速攪拌30-60min，剔除損傷葉片后，用無菌水洗去葉片上殘留的洗潔精；再將葉片用0.2-0.4％的二氧化氯溶液浸泡1-3min，用無菌水沖洗干凈；最后將葉片用無菌水浸沒在封閉容器中后放入超聲消毒機，在10-15khz、80-150w條件下，消毒10-20min，再用無菌水沖洗，吸干葉片表面的水分即得到備用葉片。番石榴本身具有抑菌活性，葉片表面上的微生物數(shù)量較少，可以用較低消毒劑的濃度和較短的消毒時間，同樣可以達到表面消毒的目的，同時可以減弱消毒劑的滲透效果，避免內生菌受到傷害。為了保證消毒效果可以輔助使用超聲消毒機，超聲波處理可以降低消毒劑的殘留，同時通過剪切力作用可以破碎植物細胞，加強破壁效果，可以促進內生菌的浸出。上述分離方法中，優(yōu)選的，所述步驟(3)中，控制所述備用葉片與纖維素酶的質量比為1000：(0.8-1.2)。采用上述質量比的纖維素酶，可以保證內生菌的浸出效果最佳。上述分離方法中，優(yōu)選的，所述步驟(2)與步驟(3)之間還有消毒效果檢驗過程，所述消毒效果檢驗過程中使用的檢驗方法包括漂洗對照、印跡對照和環(huán)境對照3種方法。所述漂洗對照是取最后一次漂洗無菌水100ul涂布在分離平板上，每個樣品重復3次；所述印跡對照是取消毒后的材料放在分離培養(yǎng)基上10min后再將培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；所述環(huán)境對照是在整個內生菌分離過程中，放置3個開蓋的培養(yǎng)平板于操作環(huán)境中，分離結束后進行培養(yǎng)。同時使用3種對照方法，可以確保獲得的菌株一定是內生菌。上述分離方法中，優(yōu)選的，所述步驟(3)中勻漿稀釋后涂布到培養(yǎng)平板上培養(yǎng)是指：將勻漿用無菌水分別稀釋1倍、10倍、100倍、1000倍，分別取100ul稀釋液涂布于分離平板上，每個處理重復3次，在30℃下恒溫培養(yǎng)3-12d。上述分離方法中，優(yōu)選的，所述分離平板包括內生真菌培養(yǎng)基、內生細菌培養(yǎng)基和內生放線菌培養(yǎng)基，所述內生真菌培養(yǎng)基使用pda培養(yǎng)基，內生細菌培養(yǎng)基使用na培養(yǎng)基，內生放線菌培養(yǎng)基使用高氏一號培養(yǎng)基，且所述內生真菌培養(yǎng)基、內生細菌培養(yǎng)基和內生放線菌培養(yǎng)基中均添加有番石榴葉浸出液。在培養(yǎng)過程中在培養(yǎng)基中加入少量的番石榴葉浸出液，可以提供內生菌的更適的生長環(huán)境，可以最大程度的分離到番石榴葉的內生菌。勻漿的成分是一致的，在勻漿里有各種微生物，通過不同的培養(yǎng)基(即分離平板)可以培養(yǎng)出不同的優(yōu)勢菌。分離平板包括三種不同的分離培養(yǎng)用平板，每種平板適合不同的微生物，pda適合真菌的生長，na適合細菌的生長，高氏一號適合放線菌的生長，可以在不同的培養(yǎng)基上，通過形態(tài)學表面特征鑒定出不同類型的微生物，再通過步驟(4)的劃線分離純化即可得到純度很高的、不同種類的番石榴葉內生菌。上述分離方法中，優(yōu)選的，所述番石榴葉浸出液的制備過程包括以下步驟：將番石榴葉片剪碎，與蒸餾水以體積比1：1的方式混合，煮沸后，小火熬煮30min，過濾獲得清液即為番石榴葉浸出液。上述分離方法中，優(yōu)選的，所述內生真菌培養(yǎng)基、內生細菌培養(yǎng)基和內生放線菌培養(yǎng)基中添加的番石榴葉浸出液的體積占培養(yǎng)基體積的6-8％。上述番石榴葉浸出液的加入量可以保證內生菌的生長，其用量需要得到精確控制，用量過多與過少均不適合番石榴的生長。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：1、本發(fā)明針對番石榴葉的特性，在采集樣品的環(huán)節(jié)較細致，保證采集的番石榴葉內生菌是處于種類和數(shù)量最多的時期，最終得到的內生菌種類與數(shù)量最多。2、在研磨過程中，針對番石榴葉纖維素含量較高和細胞壁較厚的特點，添加一定量的纖維素酶可以加強破壁效果和效率，促進內生菌的浸出。3、在內生菌的分離培養(yǎng)基中添加一定量的番石榴葉浸出液，可以一定程度的模擬番石榴葉內生菌的培養(yǎng)條件，可以獲得更多的內生菌。4、本發(fā)明的方法特別適合于從番石榴葉中分離內生菌，其工藝步驟簡單，操作方便。具體實施方式為了便于理解本發(fā)明，下文將結合較佳的實施例對本發(fā)明作更全面、細致地描述，但本發(fā)明的保護范圍并不限于以下具體的實施例。除非另有定義，下文中所使用的所有專業(yè)術語與本領域技術人員通常理解的含義相同。本文中所使用的專業(yè)術語只是為了描述具體實施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明的保護范圍。除非另有特別說明，本發(fā)明中用到的各種原材料、試劑、儀器和設備等均可通過市場購買得到或者可通過現(xiàn)有方法制備得到。實施例1：一種番石榴葉內生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)番石榴葉的采集及低溫保存：在夏季，采集具有10年以上樹齡的新鮮、健康的番石榴老葉，將采摘的番石榴葉片，在4℃下放置24h；(2)番石榴葉的預處理和表面消毒：取采集的番石榴葉片，用自來水沖洗，并用毛刷輕輕刷去葉片表面的泥土等雜質，將葉片放在無菌水中浸泡，同時加入2-3滴洗潔精，用磁力攪拌裝置攪拌30min，剔除其中的損傷葉片，用無菌水沖洗5次，去掉殘留洗潔精，再將葉片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡3min，用無菌水沖洗5次；番石榴葉放入密封的玻璃容器中，用無菌水浸沒，使用超聲消毒機在10khz、80w條件下，消毒10min，再用無菌水沖洗5次，使用無菌吸水紙吸干，得到備用葉片；(3)檢驗消毒效果：檢驗表面消毒的番石榴葉消毒效果，作為分離內生菌的對照，同時使用漂洗對照、印跡對照和環(huán)境對照3種方法；(4)內生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無菌剪刀剪碎，放入無菌的研缽，加入10ml無菌生理鹽水，加入0.4mg纖維素酶研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)3d；使用不同的培養(yǎng)基分別加入6％的番石榴葉浸出液，內生細菌使用na培養(yǎng)基，內生放線菌使用高氏一號培養(yǎng)基，內生真菌使用pda培養(yǎng)基；其中，番石榴葉浸出液的制備過程包括以下步驟：將番石榴葉片剪碎，與蒸餾水以體積比1：1的方式混合，煮沸后，小火熬煮30min，過濾獲得清液即為番石榴葉浸出液；(5)內生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長出菌落時，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。實施例2：一種番石榴葉內生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)番石榴葉的采集及低溫保存：在夏季，采集具有10年以上樹齡的新鮮、健康的番石榴老葉，將采摘的番石榴葉片，在4℃下放置24h；(2)番石榴葉的預處理和表面消毒：取采集的番石榴葉片，用自來水沖洗，并用毛刷輕輕刷去葉片表面的泥土等雜質，將葉片放在無菌水中浸泡，同時加入2-3滴洗潔精，用磁力攪拌裝置攪拌30min，剔除其中的損傷葉片，用無菌水沖洗5次，去掉殘留洗潔精，再將葉片用0.3％的二氧化氯溶液浸泡1min，用無菌水沖洗5次；番石榴葉放入密封的玻璃容器中，用無菌水浸沒，使用超聲消毒機在10khz、80w條件下，消毒10min，再用無菌水沖洗5次，使用無菌吸水紙吸干，得到備用葉片；(3)檢驗消毒效果：檢驗表面消毒的番石榴葉消毒效果，作為分離內生菌的對照，同時使用漂洗對照、印跡對照和環(huán)境對照3種方法；(4)內生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無菌剪刀剪碎，放入無菌的研缽，加入10ml無菌生理鹽水，加入0.5mg纖維素酶研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)7d；使用不同的培養(yǎng)基分別加入7％的番石榴葉浸出液，內生細菌使用na培養(yǎng)基，內生放線菌使用高氏一號培養(yǎng)基，內生真菌使用pda培養(yǎng)基；(5)內生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長出菌落時，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。實施例3：一種番石榴葉內生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)番石榴葉的采集及低溫保存：在夏季，采集具有10年以上樹齡的新鮮、健康的番石榴老葉，將采摘的番石榴葉片，在4℃下放置24h；(2)番石榴葉的預處理和表面消毒：取采集的番石榴葉片，用自來水沖洗，并用毛刷輕輕刷去葉片表面的泥土等雜質，將葉片放在無菌水中浸泡，同時加入2-3滴洗潔精，用磁力攪拌裝置攪拌30min，剔除其中的損傷葉片，用無菌水沖洗5次，去掉殘留洗潔精，再將葉片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡1min，用無菌水沖洗5次；番石榴葉放入密封的玻璃容器中，用無菌水浸沒，使用超聲消毒機在10khz、80w條件下，消毒10min，再用無菌水沖洗5次，使用無菌吸水紙吸干，得到備用葉片；(3)檢驗消毒效果：檢驗表面消毒的番石榴葉消毒效果，作為分離內生菌的對照，同時使用漂洗對照、印跡對照和環(huán)境對照3種方法；(4)內生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無菌剪刀剪碎，放入無菌的研缽，加入10ml無菌生理鹽水，加入0.6mg纖維素酶研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)12d；使用不同的培養(yǎng)基分別加入8％的番石榴葉浸出液，內生細菌使用na培養(yǎng)基，內生放線菌使用高氏一號培養(yǎng)基，內生真菌使用pda培養(yǎng)基；(5)內生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長出菌落時，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。實施例4：一種番石榴葉內生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)番石榴葉的采集及低溫保存：在夏季，采集具有10年以上樹齡的新鮮、健康的番石榴老葉，將采摘的番石榴葉片，在4℃下放置24h；(2)番石榴葉的預處理和表面消毒：取采集的番石榴葉片，用自來水沖洗，并用毛刷輕輕刷去葉片表面的泥土等雜質，將葉片放在無菌水中浸泡，同時加入2-3滴洗潔精，用磁力攪拌裝置攪拌30min，剔除其中的損傷葉片，用無菌水沖洗5次，去掉殘留洗潔精，再將葉片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡2min，用無菌水沖洗5次；番石榴葉放入密封的玻璃容器中，用無菌水浸沒，使用超聲消毒機在10khz、80w條件下，消毒10min，再用無菌水沖洗5次，使用無菌吸水紙吸干，得到備用葉片；(3)檢驗消毒效果：檢驗表面消毒的番石榴葉消毒效果，作為分離內生菌的對照，同時使用漂洗對照、印跡對照和環(huán)境對照3種方法；(4)內生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無菌剪刀剪碎，放入無菌的研缽，加入10ml無菌生理鹽水，加入0.6mg纖維素酶研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)12d；使用不同的培養(yǎng)基分別加入8％的番石榴葉浸出液，內生細菌使用na培養(yǎng)基，內生放線菌使用高氏一號培養(yǎng)基，內生真菌使用pda培養(yǎng)基；(5)內生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長出菌落時，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。實施例5：一種番石榴葉內生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)番石榴葉的采集及低溫保存：在夏季，采集具有10年以上樹齡的新鮮、健康的番石榴老葉，將采摘的番石榴葉片，在4℃下放置24h；(2)番石榴葉的預處理和表面消毒：取采集的番石榴葉片，用自來水沖洗，并用毛刷輕輕刷去葉片表面的泥土等雜質，將葉片放在無菌水中浸泡，同時加入2-3滴洗潔精，用磁力攪拌裝置攪拌30min，剔除其中的損傷葉片，用無菌水沖洗5次，去掉殘留洗潔精，再將葉片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡1min，用無菌水沖洗5次；番石榴葉放入密封的玻璃容器中，用無菌水浸沒，使用超聲消毒機在15khz、140w條件下，消毒18min，再用無菌水沖洗5次，使用無菌吸水紙吸干，得到備用葉片；(3)檢驗消毒效果：檢驗表面消毒的番石榴葉消毒效果，作為分離內生菌的對照，同時使用漂洗對照、印跡對照和環(huán)境對照3種方法；(4)內生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無菌剪刀剪碎，放入無菌的研缽，加入10ml無菌生理鹽水，加入0.6mg纖維素酶研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)12d；使用不同的培養(yǎng)基分別加入8％的番石榴葉浸出液，內生細菌使用na培養(yǎng)基，內生放線菌使用高氏一號培養(yǎng)基，內生真菌使用pda培養(yǎng)基；(5)內生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長出菌落時，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。實施例6：一種番石榴葉內生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)番石榴葉的采集及低溫保存：在夏季，采集具有10年以上樹齡的新鮮、健康的番石榴老葉，將采摘的番石榴葉片，在4℃下放置24h；(2)番石榴葉的預處理和表面消毒：取采集的番石榴葉片，用自來水沖洗，并用毛刷輕輕刷去葉片表面的泥土等雜質，將葉片放在無菌水中浸泡，同時加入2-3滴洗潔精，用磁力攪拌裝置攪拌30min，剔除其中的損傷葉片，用無菌水沖洗5次，去掉殘留洗潔精，再將葉片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡1min，用無菌水沖洗5次；番石榴葉放入密封的玻璃容器中，用無菌水浸沒，使用超聲消毒機在10khz、80w條件下，消毒10min，再用無菌水沖洗5次，使用無菌吸水紙吸干，得到備用葉片；(3)檢驗消毒效果：檢驗表面消毒的番石榴葉消毒效果，作為分離內生菌的對照，同時使用漂洗對照、印跡對照和環(huán)境對照3種方法；(4)內生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無菌剪刀剪碎，放入無菌的研缽，加入10ml無菌生理鹽水，加入0.5mg纖維素酶研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)12d；使用不同的培養(yǎng)基分別加入7％的番石榴葉浸出液，內生細菌使用na培養(yǎng)基，內生放線菌使用高氏一號培養(yǎng)基，內生真菌使用pda培養(yǎng)基；(5)內生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長出菌落時，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。實施例7：一種番石榴葉內生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)番石榴葉的采集及低溫保存：在夏季，采集具有10年以上樹齡的新鮮、健康的番石榴老葉，將采摘的番石榴葉片，在4℃下放置24h；(2)番石榴葉的預處理和表面消毒：取采集的番石榴葉片，用自來水沖洗，并用毛刷輕輕刷去葉片表面的泥土等雜質，將葉片放在無菌水中浸泡，同時加入2-3滴洗潔精，用磁力攪拌裝置攪拌30min，剔除其中的損傷葉片，用無菌水沖洗5次，去掉殘留洗潔精，再將葉片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡1min，用無菌水沖洗5次；番石榴葉放入密封的玻璃容器中，用無菌水浸沒，使用超聲消毒機在10khz、80w條件下，消毒10min，再用無菌水沖洗5次，使用無菌吸水紙吸干，得到備用葉片；(3)檢驗消毒效果：檢驗表面消毒的番石榴葉消毒效果，作為分離內生菌的對照，同時使用漂洗對照、印跡對照和環(huán)境對照3種方法；(4)內生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無菌剪刀剪碎，放入無菌的研缽，加入10ml無菌生理鹽水，加入0.7mg纖維素酶研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)12d；使用不同的培養(yǎng)基分別加入8％的番石榴葉浸出液，內生細菌使用na培養(yǎng)基，內生放線菌使用高氏一號培養(yǎng)基，內生真菌使用pda培養(yǎng)基；(5)內生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長出菌落時，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。對比例1：一種番石榴葉內生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)番石榴葉的采集及低溫保存：在夏季，采集具有10年以上樹齡的新鮮、健康的番石榴老葉，將采摘的番石榴葉片，在4℃下放置24h；(2)番石榴葉的預處理和表面消毒：取采集的番石榴葉片，用自來水沖洗，并用毛刷輕輕刷去葉片表面的泥土等雜質，將葉片放在無菌水中浸泡，同時加入2-3滴洗潔精，用磁力攪拌裝置攪拌30min，剔除其中的損傷葉片，用無菌水沖洗5次，去掉殘留洗潔精，再使用75％的乙醇浸泡3min，無菌水沖洗5次，再使用3％的次氯酸鈉浸泡5min，再用無菌水沖洗5次，使用無菌吸水紙吸干，得到備用葉片；(3)-(5)與實施例3的步驟(3)-(5)相同。對比例2：一種番石榴葉內生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)-(3)與實施例3的步驟(1)-(3)相同；(4)內生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無菌剪刀剪碎，放入無菌的研缽，加入10ml無菌生理鹽水，加入0.6mg纖維素酶研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)12d；使用不同的培養(yǎng)基不加入番石榴葉浸出液，內生細菌使用na培養(yǎng)基，內生放線菌使用高氏一號培養(yǎng)基，內生真菌使用pda培養(yǎng)基；(5)內生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長出菌落時，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。對比例3：一種番石榴葉內生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)-(3)與實施例3的步驟(1)-(3)相同；(4)內生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無菌剪刀剪碎，放入無菌的研缽，加入10ml無菌生理鹽水，不加入纖維素酶，研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)12d；使用不同的培養(yǎng)基分別加入8％的番石榴葉浸出液，內生細菌使用na培養(yǎng)基，內生放線菌使用高氏一號培養(yǎng)基，內生真菌使用pda培養(yǎng)基；(5)內生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長出菌落時，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。實施例1-7與對比例1-3中消毒效果與最終得到的內生菌種類總量經(jīng)測試結果如下表1所示。表1：實施例1-7與對比例1-3中消毒效果與內生菌種類總量消毒效果細菌種類放線菌種類真菌種類內生菌種類總量實施例1無菌1712332實施例2無菌1514837實施例3無菌18141042實施例4無菌17131040實施例5無菌18141042實施例6無菌1614838實施例7無菌1513836對比例1無菌94619對比例2無菌124521對比例3無菌133723由表1可知，采用實施例1-7中的分離方法得到的內生菌種類總量明顯多于對比例1-3中的分離方法。當前第1頁12

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