本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種內(nèi)生菌的分離方法。
背景技術(shù)：
內(nèi)生菌是指生活史全部階段或者部分階段生活在活的植物組織內(nèi)，而同時(shí)又不引起植物明顯病害癥狀的微生物?！皟?nèi)共生理論”認(rèn)為與宿主共同進(jìn)化的內(nèi)生菌可能從宿主中獲得相關(guān)基因的傳遞，具有合成與宿主相同或相似代謝產(chǎn)物的能力。1993年，首次從短葉紅豆杉中分離得到一株能夠產(chǎn)生抗癌物質(zhì)—紫杉醇的內(nèi)生真菌，進(jìn)一步證實(shí)了“內(nèi)共生理論”。植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物是天然藥用活性物質(zhì)的重要來(lái)源，而且很大一部分天然產(chǎn)物是新型生物活性物質(zhì)，具有廣闊的應(yīng)用前景。由于植物內(nèi)生菌繁殖速度快、產(chǎn)生代謝產(chǎn)物種類(lèi)多，加強(qiáng)對(duì)植物內(nèi)生菌的開(kāi)發(fā)和利用，是尋找和開(kāi)發(fā)新藥物的良好途徑，具有良好的應(yīng)用前景和開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。番石榴葉中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，新鮮成熟的番石榴葉中含有較高的蛋白質(zhì)和可溶性糖。同時(shí)含有黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)、三萜類(lèi)、雜源萜類(lèi)、揮發(fā)油、植物多糖等功能活性成分。研究表明番石榴葉提取物具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗微生物、抗腹瀉、抗腫瘤及保護(hù)肝臟的作用。現(xiàn)有技術(shù)中公布的內(nèi)生菌分離方法并不能很好的適用于番石榴葉內(nèi)生菌的分離，研究開(kāi)發(fā)一種從番石榴葉中高效分離內(nèi)生菌的方法能顯著擴(kuò)大番石榴的應(yīng)用范圍，具有廣闊的市場(chǎng)價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服以上
背景技術(shù)：
中提到的不足和缺陷，提供一種番石榴葉內(nèi)生菌的分離方法，該方法特別適用于番石榴葉，其內(nèi)生菌的分離效果更好。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為：一種番石榴葉內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)在夏季采集具有10年以上樹(shù)齡的新鮮番石榴老葉，低溫放置(在4℃下放置24h)；10年以上樹(shù)齡的番石榴老葉具有的內(nèi)生菌種類(lèi)最多的特點(diǎn)，且夏季樹(shù)葉生長(zhǎng)茂盛是采集番石榴葉的最好的時(shí)期；番石榴葉在低溫保存24h后，表面的微生物會(huì)受到抑制，有利于葉片表面消毒；(2)對(duì)番石榴老葉進(jìn)行表面滅菌處理得到備用葉片；表面滅菌處理的目的在于除去葉片表面的雜菌；(3)將步驟(2)中得到的備用葉片剪碎后，加入生理鹽水與纖維素酶后研磨成勻漿，將勻漿稀釋后涂布到培養(yǎng)平板上培養(yǎng)；將勻漿稀釋后涂布到培養(yǎng)平板上培養(yǎng)；番石榴葉為革質(zhì)葉片，質(zhì)地較堅(jiān)固，研磨時(shí)加入一定量的纖維素酶可以分解植物纖維及細(xì)胞壁，可以促進(jìn)內(nèi)生菌的浸出；(4)待培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出菌落時(shí)，挑選單菌落，進(jìn)行劃線分離純化，即得到番石榴葉內(nèi)生菌。上述分離方法中，優(yōu)選的，表面滅菌處理包括以下步驟：用自來(lái)水沖洗步驟(1)中經(jīng)低溫放置后的番石榴葉，將葉片放在無(wú)菌水中浸泡，同時(shí)加入2-3滴洗潔精，使用磁力攪拌儀低速攪拌30-60min，剔除損傷葉片后，用無(wú)菌水洗去葉片上殘留的洗潔精；再將葉片用0.2-0.4％的二氧化氯溶液浸泡1-3min，用無(wú)菌水沖洗干凈；最后將葉片用無(wú)菌水浸沒(méi)在封閉容器中后放入超聲消毒機(jī)，在10-15khz、80-150w條件下，消毒10-20min，再用無(wú)菌水沖洗，吸干葉片表面的水分即得到備用葉片。番石榴本身具有抑菌活性，葉片表面上的微生物數(shù)量較少，可以用較低消毒劑的濃度和較短的消毒時(shí)間，同樣可以達(dá)到表面消毒的目的，同時(shí)可以減弱消毒劑的滲透效果，避免內(nèi)生菌受到傷害。為了保證消毒效果可以輔助使用超聲消毒機(jī)，超聲波處理可以降低消毒劑的殘留，同時(shí)通過(guò)剪切力作用可以破碎植物細(xì)胞，加強(qiáng)破壁效果，可以促進(jìn)內(nèi)生菌的浸出。上述分離方法中，優(yōu)選的，所述步驟(3)中，控制所述備用葉片與纖維素酶的質(zhì)量比為1000：(0.8-1.2)。采用上述質(zhì)量比的纖維素酶，可以保證內(nèi)生菌的浸出效果最佳。上述分離方法中，優(yōu)選的，所述步驟(2)與步驟(3)之間還有消毒效果檢驗(yàn)過(guò)程，所述消毒效果檢驗(yàn)過(guò)程中使用的檢驗(yàn)方法包括漂洗對(duì)照、印跡對(duì)照和環(huán)境對(duì)照3種方法。所述漂洗對(duì)照是取最后一次漂洗無(wú)菌水100ul涂布在分離平板上，每個(gè)樣品重復(fù)3次；所述印跡對(duì)照是取消毒后的材料放在分離培養(yǎng)基上10min后再將培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；所述環(huán)境對(duì)照是在整個(gè)內(nèi)生菌分離過(guò)程中，放置3個(gè)開(kāi)蓋的培養(yǎng)平板于操作環(huán)境中，分離結(jié)束后進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)使用3種對(duì)照方法，可以確保獲得的菌株一定是內(nèi)生菌。上述分離方法中，優(yōu)選的，所述步驟(3)中勻漿稀釋后涂布到培養(yǎng)平板上培養(yǎng)是指：將勻漿用無(wú)菌水分別稀釋1倍、10倍、100倍、1000倍，分別取100ul稀釋液涂布于分離平板上，每個(gè)處理重復(fù)3次，在30℃下恒溫培養(yǎng)3-12d。上述分離方法中，優(yōu)選的，所述分離平板包括內(nèi)生真菌培養(yǎng)基、內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)基和內(nèi)生放線菌培養(yǎng)基，所述內(nèi)生真菌培養(yǎng)基使用pda培養(yǎng)基，內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)基使用na培養(yǎng)基，內(nèi)生放線菌培養(yǎng)基使用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，且所述內(nèi)生真菌培養(yǎng)基、內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)基和內(nèi)生放線菌培養(yǎng)基中均添加有番石榴葉浸出液。在培養(yǎng)過(guò)程中在培養(yǎng)基中加入少量的番石榴葉浸出液，可以提供內(nèi)生菌的更適的生長(zhǎng)環(huán)境，可以最大程度的分離到番石榴葉的內(nèi)生菌。勻漿的成分是一致的，在勻漿里有各種微生物，通過(guò)不同的培養(yǎng)基(即分離平板)可以培養(yǎng)出不同的優(yōu)勢(shì)菌。分離平板包括三種不同的分離培養(yǎng)用平板，每種平板適合不同的微生物，pda適合真菌的生長(zhǎng)，na適合細(xì)菌的生長(zhǎng)，高氏一號(hào)適合放線菌的生長(zhǎng)，可以在不同的培養(yǎng)基上，通過(guò)形態(tài)學(xué)表面特征鑒定出不同類(lèi)型的微生物，再通過(guò)步驟(4)的劃線分離純化即可得到純度很高的、不同種類(lèi)的番石榴葉內(nèi)生菌。上述分離方法中，優(yōu)選的，所述番石榴葉浸出液的制備過(guò)程包括以下步驟：將番石榴葉片剪碎，與蒸餾水以體積比1：1的方式混合，煮沸后，小火熬煮30min，過(guò)濾獲得清液即為番石榴葉浸出液。上述分離方法中，優(yōu)選的，所述內(nèi)生真菌培養(yǎng)基、內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)基和內(nèi)生放線菌培養(yǎng)基中添加的番石榴葉浸出液的體積占培養(yǎng)基體積的6-8％。上述番石榴葉浸出液的加入量可以保證內(nèi)生菌的生長(zhǎng)，其用量需要得到精確控制，用量過(guò)多與過(guò)少均不適合番石榴的生長(zhǎng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1、本發(fā)明針對(duì)番石榴葉的特性，在采集樣品的環(huán)節(jié)較細(xì)致，保證采集的番石榴葉內(nèi)生菌是處于種類(lèi)和數(shù)量最多的時(shí)期，最終得到的內(nèi)生菌種類(lèi)與數(shù)量最多。2、在研磨過(guò)程中，針對(duì)番石榴葉纖維素含量較高和細(xì)胞壁較厚的特點(diǎn)，添加一定量的纖維素酶可以加強(qiáng)破壁效果和效率，促進(jìn)內(nèi)生菌的浸出。3、在內(nèi)生菌的分離培養(yǎng)基中添加一定量的番石榴葉浸出液，可以一定程度的模擬番石榴葉內(nèi)生菌的培養(yǎng)條件，可以獲得更多的內(nèi)生菌。4、本發(fā)明的方法特別適合于從番石榴葉中分離內(nèi)生菌，其工藝步驟簡(jiǎn)單，操作方便。具體實(shí)施方式為了便于理解本發(fā)明，下文將結(jié)合較佳的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更全面、細(xì)致地描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于以下具體的實(shí)施例。除非另有定義，下文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中所使用的專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體實(shí)施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。除非另有特別說(shuō)明，本發(fā)明中用到的各種原材料、試劑、儀器和設(shè)備等均可通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)得到或者可通過(guò)現(xiàn)有方法制備得到。實(shí)施例1：一種番石榴葉內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)番石榴葉的采集及低溫保存：在夏季，采集具有10年以上樹(shù)齡的新鮮、健康的番石榴老葉，將采摘的番石榴葉片，在4℃下放置24h；(2)番石榴葉的預(yù)處理和表面消毒：取采集的番石榴葉片，用自來(lái)水沖洗，并用毛刷輕輕刷去葉片表面的泥土等雜質(zhì)，將葉片放在無(wú)菌水中浸泡，同時(shí)加入2-3滴洗潔精，用磁力攪拌裝置攪拌30min，剔除其中的損傷葉片，用無(wú)菌水沖洗5次，去掉殘留洗潔精，再將葉片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡3min，用無(wú)菌水沖洗5次；番石榴葉放入密封的玻璃容器中，用無(wú)菌水浸沒(méi)，使用超聲消毒機(jī)在10khz、80w條件下，消毒10min，再用無(wú)菌水沖洗5次，使用無(wú)菌吸水紙吸干，得到備用葉片；(3)檢驗(yàn)消毒效果：檢驗(yàn)表面消毒的番石榴葉消毒效果，作為分離內(nèi)生菌的對(duì)照，同時(shí)使用漂洗對(duì)照、印跡對(duì)照和環(huán)境對(duì)照3種方法；(4)內(nèi)生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無(wú)菌剪刀剪碎，放入無(wú)菌的研缽，加入10ml無(wú)菌生理鹽水，加入0.4mg纖維素酶研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)3d；使用不同的培養(yǎng)基分別加入6％的番石榴葉浸出液，內(nèi)生細(xì)菌使用na培養(yǎng)基，內(nèi)生放線菌使用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，內(nèi)生真菌使用pda培養(yǎng)基；其中，番石榴葉浸出液的制備過(guò)程包括以下步驟：將番石榴葉片剪碎，與蒸餾水以體積比1：1的方式混合，煮沸后，小火熬煮30min，過(guò)濾獲得清液即為番石榴葉浸出液；(5)內(nèi)生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出菌落時(shí)，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。實(shí)施例2：一種番石榴葉內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)番石榴葉的采集及低溫保存：在夏季，采集具有10年以上樹(shù)齡的新鮮、健康的番石榴老葉，將采摘的番石榴葉片，在4℃下放置24h；(2)番石榴葉的預(yù)處理和表面消毒：取采集的番石榴葉片，用自來(lái)水沖洗，并用毛刷輕輕刷去葉片表面的泥土等雜質(zhì)，將葉片放在無(wú)菌水中浸泡，同時(shí)加入2-3滴洗潔精，用磁力攪拌裝置攪拌30min，剔除其中的損傷葉片，用無(wú)菌水沖洗5次，去掉殘留洗潔精，再將葉片用0.3％的二氧化氯溶液浸泡1min，用無(wú)菌水沖洗5次；番石榴葉放入密封的玻璃容器中，用無(wú)菌水浸沒(méi)，使用超聲消毒機(jī)在10khz、80w條件下，消毒10min，再用無(wú)菌水沖洗5次，使用無(wú)菌吸水紙吸干，得到備用葉片；(3)檢驗(yàn)消毒效果：檢驗(yàn)表面消毒的番石榴葉消毒效果，作為分離內(nèi)生菌的對(duì)照，同時(shí)使用漂洗對(duì)照、印跡對(duì)照和環(huán)境對(duì)照3種方法；(4)內(nèi)生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無(wú)菌剪刀剪碎，放入無(wú)菌的研缽，加入10ml無(wú)菌生理鹽水，加入0.5mg纖維素酶研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)7d；使用不同的培養(yǎng)基分別加入7％的番石榴葉浸出液，內(nèi)生細(xì)菌使用na培養(yǎng)基，內(nèi)生放線菌使用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，內(nèi)生真菌使用pda培養(yǎng)基；(5)內(nèi)生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出菌落時(shí)，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。實(shí)施例3：一種番石榴葉內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)番石榴葉的采集及低溫保存：在夏季，采集具有10年以上樹(shù)齡的新鮮、健康的番石榴老葉，將采摘的番石榴葉片，在4℃下放置24h；(2)番石榴葉的預(yù)處理和表面消毒：取采集的番石榴葉片，用自來(lái)水沖洗，并用毛刷輕輕刷去葉片表面的泥土等雜質(zhì)，將葉片放在無(wú)菌水中浸泡，同時(shí)加入2-3滴洗潔精，用磁力攪拌裝置攪拌30min，剔除其中的損傷葉片，用無(wú)菌水沖洗5次，去掉殘留洗潔精，再將葉片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡1min，用無(wú)菌水沖洗5次；番石榴葉放入密封的玻璃容器中，用無(wú)菌水浸沒(méi)，使用超聲消毒機(jī)在10khz、80w條件下，消毒10min，再用無(wú)菌水沖洗5次，使用無(wú)菌吸水紙吸干，得到備用葉片；(3)檢驗(yàn)消毒效果：檢驗(yàn)表面消毒的番石榴葉消毒效果，作為分離內(nèi)生菌的對(duì)照，同時(shí)使用漂洗對(duì)照、印跡對(duì)照和環(huán)境對(duì)照3種方法；(4)內(nèi)生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無(wú)菌剪刀剪碎，放入無(wú)菌的研缽，加入10ml無(wú)菌生理鹽水，加入0.6mg纖維素酶研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)12d；使用不同的培養(yǎng)基分別加入8％的番石榴葉浸出液，內(nèi)生細(xì)菌使用na培養(yǎng)基，內(nèi)生放線菌使用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，內(nèi)生真菌使用pda培養(yǎng)基；(5)內(nèi)生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出菌落時(shí)，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。實(shí)施例4：一種番石榴葉內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)番石榴葉的采集及低溫保存：在夏季，采集具有10年以上樹(shù)齡的新鮮、健康的番石榴老葉，將采摘的番石榴葉片，在4℃下放置24h；(2)番石榴葉的預(yù)處理和表面消毒：取采集的番石榴葉片，用自來(lái)水沖洗，并用毛刷輕輕刷去葉片表面的泥土等雜質(zhì)，將葉片放在無(wú)菌水中浸泡，同時(shí)加入2-3滴洗潔精，用磁力攪拌裝置攪拌30min，剔除其中的損傷葉片，用無(wú)菌水沖洗5次，去掉殘留洗潔精，再將葉片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡2min，用無(wú)菌水沖洗5次；番石榴葉放入密封的玻璃容器中，用無(wú)菌水浸沒(méi)，使用超聲消毒機(jī)在10khz、80w條件下，消毒10min，再用無(wú)菌水沖洗5次，使用無(wú)菌吸水紙吸干，得到備用葉片；(3)檢驗(yàn)消毒效果：檢驗(yàn)表面消毒的番石榴葉消毒效果，作為分離內(nèi)生菌的對(duì)照，同時(shí)使用漂洗對(duì)照、印跡對(duì)照和環(huán)境對(duì)照3種方法；(4)內(nèi)生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無(wú)菌剪刀剪碎，放入無(wú)菌的研缽，加入10ml無(wú)菌生理鹽水，加入0.6mg纖維素酶研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)12d；使用不同的培養(yǎng)基分別加入8％的番石榴葉浸出液，內(nèi)生細(xì)菌使用na培養(yǎng)基，內(nèi)生放線菌使用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，內(nèi)生真菌使用pda培養(yǎng)基；(5)內(nèi)生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出菌落時(shí)，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。實(shí)施例5：一種番石榴葉內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)番石榴葉的采集及低溫保存：在夏季，采集具有10年以上樹(shù)齡的新鮮、健康的番石榴老葉，將采摘的番石榴葉片，在4℃下放置24h；(2)番石榴葉的預(yù)處理和表面消毒：取采集的番石榴葉片，用自來(lái)水沖洗，并用毛刷輕輕刷去葉片表面的泥土等雜質(zhì)，將葉片放在無(wú)菌水中浸泡，同時(shí)加入2-3滴洗潔精，用磁力攪拌裝置攪拌30min，剔除其中的損傷葉片，用無(wú)菌水沖洗5次，去掉殘留洗潔精，再將葉片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡1min，用無(wú)菌水沖洗5次；番石榴葉放入密封的玻璃容器中，用無(wú)菌水浸沒(méi)，使用超聲消毒機(jī)在15khz、140w條件下，消毒18min，再用無(wú)菌水沖洗5次，使用無(wú)菌吸水紙吸干，得到備用葉片；(3)檢驗(yàn)消毒效果：檢驗(yàn)表面消毒的番石榴葉消毒效果，作為分離內(nèi)生菌的對(duì)照，同時(shí)使用漂洗對(duì)照、印跡對(duì)照和環(huán)境對(duì)照3種方法；(4)內(nèi)生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無(wú)菌剪刀剪碎，放入無(wú)菌的研缽，加入10ml無(wú)菌生理鹽水，加入0.6mg纖維素酶研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)12d；使用不同的培養(yǎng)基分別加入8％的番石榴葉浸出液，內(nèi)生細(xì)菌使用na培養(yǎng)基，內(nèi)生放線菌使用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，內(nèi)生真菌使用pda培養(yǎng)基；(5)內(nèi)生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出菌落時(shí)，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。實(shí)施例6：一種番石榴葉內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)番石榴葉的采集及低溫保存：在夏季，采集具有10年以上樹(shù)齡的新鮮、健康的番石榴老葉，將采摘的番石榴葉片，在4℃下放置24h；(2)番石榴葉的預(yù)處理和表面消毒：取采集的番石榴葉片，用自來(lái)水沖洗，并用毛刷輕輕刷去葉片表面的泥土等雜質(zhì)，將葉片放在無(wú)菌水中浸泡，同時(shí)加入2-3滴洗潔精，用磁力攪拌裝置攪拌30min，剔除其中的損傷葉片，用無(wú)菌水沖洗5次，去掉殘留洗潔精，再將葉片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡1min，用無(wú)菌水沖洗5次；番石榴葉放入密封的玻璃容器中，用無(wú)菌水浸沒(méi)，使用超聲消毒機(jī)在10khz、80w條件下，消毒10min，再用無(wú)菌水沖洗5次，使用無(wú)菌吸水紙吸干，得到備用葉片；(3)檢驗(yàn)消毒效果：檢驗(yàn)表面消毒的番石榴葉消毒效果，作為分離內(nèi)生菌的對(duì)照，同時(shí)使用漂洗對(duì)照、印跡對(duì)照和環(huán)境對(duì)照3種方法；(4)內(nèi)生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無(wú)菌剪刀剪碎，放入無(wú)菌的研缽，加入10ml無(wú)菌生理鹽水，加入0.5mg纖維素酶研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)12d；使用不同的培養(yǎng)基分別加入7％的番石榴葉浸出液，內(nèi)生細(xì)菌使用na培養(yǎng)基，內(nèi)生放線菌使用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，內(nèi)生真菌使用pda培養(yǎng)基；(5)內(nèi)生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出菌落時(shí)，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。實(shí)施例7：一種番石榴葉內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)番石榴葉的采集及低溫保存：在夏季，采集具有10年以上樹(shù)齡的新鮮、健康的番石榴老葉，將采摘的番石榴葉片，在4℃下放置24h；(2)番石榴葉的預(yù)處理和表面消毒：取采集的番石榴葉片，用自來(lái)水沖洗，并用毛刷輕輕刷去葉片表面的泥土等雜質(zhì)，將葉片放在無(wú)菌水中浸泡，同時(shí)加入2-3滴洗潔精，用磁力攪拌裝置攪拌30min，剔除其中的損傷葉片，用無(wú)菌水沖洗5次，去掉殘留洗潔精，再將葉片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡1min，用無(wú)菌水沖洗5次；番石榴葉放入密封的玻璃容器中，用無(wú)菌水浸沒(méi)，使用超聲消毒機(jī)在10khz、80w條件下，消毒10min，再用無(wú)菌水沖洗5次，使用無(wú)菌吸水紙吸干，得到備用葉片；(3)檢驗(yàn)消毒效果：檢驗(yàn)表面消毒的番石榴葉消毒效果，作為分離內(nèi)生菌的對(duì)照，同時(shí)使用漂洗對(duì)照、印跡對(duì)照和環(huán)境對(duì)照3種方法；(4)內(nèi)生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無(wú)菌剪刀剪碎，放入無(wú)菌的研缽，加入10ml無(wú)菌生理鹽水，加入0.7mg纖維素酶研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)12d；使用不同的培養(yǎng)基分別加入8％的番石榴葉浸出液，內(nèi)生細(xì)菌使用na培養(yǎng)基，內(nèi)生放線菌使用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，內(nèi)生真菌使用pda培養(yǎng)基；(5)內(nèi)生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出菌落時(shí)，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。對(duì)比例1：一種番石榴葉內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)番石榴葉的采集及低溫保存：在夏季，采集具有10年以上樹(shù)齡的新鮮、健康的番石榴老葉，將采摘的番石榴葉片，在4℃下放置24h；(2)番石榴葉的預(yù)處理和表面消毒：取采集的番石榴葉片，用自來(lái)水沖洗，并用毛刷輕輕刷去葉片表面的泥土等雜質(zhì)，將葉片放在無(wú)菌水中浸泡，同時(shí)加入2-3滴洗潔精，用磁力攪拌裝置攪拌30min，剔除其中的損傷葉片，用無(wú)菌水沖洗5次，去掉殘留洗潔精，再使用75％的乙醇浸泡3min，無(wú)菌水沖洗5次，再使用3％的次氯酸鈉浸泡5min，再用無(wú)菌水沖洗5次，使用無(wú)菌吸水紙吸干，得到備用葉片；(3)-(5)與實(shí)施例3的步驟(3)-(5)相同。對(duì)比例2：一種番石榴葉內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)-(3)與實(shí)施例3的步驟(1)-(3)相同；(4)內(nèi)生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無(wú)菌剪刀剪碎，放入無(wú)菌的研缽，加入10ml無(wú)菌生理鹽水，加入0.6mg纖維素酶研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)12d；使用不同的培養(yǎng)基不加入番石榴葉浸出液，內(nèi)生細(xì)菌使用na培養(yǎng)基，內(nèi)生放線菌使用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，內(nèi)生真菌使用pda培養(yǎng)基；(5)內(nèi)生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出菌落時(shí)，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。對(duì)比例3：一種番石榴葉內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)-(3)與實(shí)施例3的步驟(1)-(3)相同；(4)內(nèi)生菌的浸出和培養(yǎng)：取表面消毒滅菌后的番石榴葉片0.5g，使用無(wú)菌剪刀剪碎，放入無(wú)菌的研缽，加入10ml無(wú)菌生理鹽水，不加入纖維素酶，研磨成勻漿，將研磨后的勻漿梯度稀釋10-103倍，各取100ul涂布到培養(yǎng)平板，在30℃下，培養(yǎng)12d；使用不同的培養(yǎng)基分別加入8％的番石榴葉浸出液，內(nèi)生細(xì)菌使用na培養(yǎng)基，內(nèi)生放線菌使用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，內(nèi)生真菌使用pda培養(yǎng)基；(5)內(nèi)生菌的分離純化：待培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出菌落時(shí)，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征，挑選出其中的單菌落，平板劃線培養(yǎng)，純化后移入試管斜面保存。實(shí)施例1-7與對(duì)比例1-3中消毒效果與最終得到的內(nèi)生菌種類(lèi)總量經(jīng)測(cè)試結(jié)果如下表1所示。表1：實(shí)施例1-7與對(duì)比例1-3中消毒效果與內(nèi)生菌種類(lèi)總量消毒效果細(xì)菌種類(lèi)放線菌種類(lèi)真菌種類(lèi)內(nèi)生菌種類(lèi)總量實(shí)施例1無(wú)菌1712332實(shí)施例2無(wú)菌1514837實(shí)施例3無(wú)菌18141042實(shí)施例4無(wú)菌17131040實(shí)施例5無(wú)菌18141042實(shí)施例6無(wú)菌1614838實(shí)施例7無(wú)菌1513836對(duì)比例1無(wú)菌94619對(duì)比例2無(wú)菌124521對(duì)比例3無(wú)菌133723由表1可知，采用實(shí)施例1-7中的分離方法得到的內(nèi)生菌種類(lèi)總量明顯多于對(duì)比例1-3中的分離方法。當(dāng)前第1頁(yè)12

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