Effects of tea polyphenols on anti-inflammation and promotion of wound healing and its mechanisms

ZHAO Hangye , ,1, XIA Chen1,2, HE Puming1, TU Youying , ,1

1.Department of Tea Science, College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

2.Hangzhou Easily Biotechnology Co. , Ltd. , Hangzhou 310015, China

摘要

為研究茶多酚（復(fù)合物）在活體動(dòng)物傷口愈合過程中的作用及其機(jī)制，試驗(yàn)選取ICR小鼠作為試驗(yàn)材料，進(jìn)行傷口造模，并使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.3%、0.5%、0.8%、1.0%的茶多酚溶液對傷口進(jìn)行處理，以人工細(xì)胞愈合膜處理作為陽性對照，并設(shè)置空白對照組，于9 d后測定不同含量茶多酚對受傷小鼠免疫系統(tǒng)以及傷口處肉芽組織的影響。結(jié)果表明：0.5%茶多酚處理能加速小鼠傷口愈合，其愈合情況優(yōu)于陽性對照組；同時(shí)，0.3%、0.5%茶多酚處理在傷口愈合后期可降低腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2, IL-2）等細(xì)胞因子水平，防止過度的炎癥反應(yīng)。通過對傷口處超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）水平的測定發(fā)現(xiàn)，茶多酚處理組的SOD活性較空白對照組顯著降低，表明其可能對傷口處因炎癥反應(yīng)而產(chǎn)生的自由基的清除有一定作用，從而阻止其對機(jī)體的損害；對傷口處肉芽組織進(jìn)行蘇木精-伊紅染色、切片觀察發(fā)現(xiàn)，茶多酚處理可促進(jìn)傷口處毛細(xì)血管的形成。同時(shí)，茶多酚（復(fù)合物）表現(xiàn)出的促外傷愈合功能與其含量有關(guān)。在較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%以下）時(shí)，隨著茶多酚含量的升高，其促外傷愈合能力增強(qiáng)；而在較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.8%以上）時(shí)，茶多酚表現(xiàn)出抑制傷口愈合的生理特性。該試驗(yàn)結(jié)果在一定程度上闡明了茶多酚的部分抗炎和促外傷愈合機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)促進(jìn)創(chuàng)面愈合的茶多酚的適宜質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.3%～0.8%。

關(guān)鍵詞：茶多酚;ICR小鼠;免疫系統(tǒng);肉芽組織;傷口愈合

Abstract

This study focuses on the effects of tea polyphenols (TPPs) on anti-inflammation and promoting wound healing in vivo and its mechanisms. ICR mice were selected as animal materials to make the wound. The wounded mice were treated with 0.3%, 0.5%, 0.8% and 1.0% TPPs, respectively. The treatment with artificial cell healing membrane was used as the positive control, and the blank control was set up. The effects of different concentrations of TPPs on the immune system and granulation tissue of wounded mice were measured after 9 d. The results showed that 0.5% TPPs could accelerate the wounded mice healing and the healing speed of this treatment was faster than the positive control. Meanwhile, 0.3% and 0.5% TPPs treatment groups could reduce the concentrations of tumor necrosis factor-α (TNF-α)and interleukin-2 (IL-2) in the late stage of wound healing to prevent excessive inflammatory reaction. Superoxide dismutase (SOD) activity in wound tissues was decreased significantly by the TPPs treatment as compared with the blank control group, which showed that TPPs may help to eliminate excessive free radicals in wound, and then to prevent its damage to the body. Hematoxylin-eosin (HE) staining sections of granulation tissue at the wound showed that TPPs treatment could promote the formation of capillaries in the wound. The function of TPPs in promoting wound healing was related to its concentration. At lower concentrations (below 0.5%), with the increase of concentration of TPPs, the ability of promoting wound healing increased; at higher concentrations (above 0.8%), TPPs showed the physiological characteristics of inhibiting wound healing. To some extent, the experimental results elucidate the partial mechanisms of promoting wound healing and anti-inflammation by TPPs and find that the suitable concentration range of TPPs for promoting wound healing is 0.3%-0.8%.

Keywords：tea polyphenols;ICR mice;immune system;granulation tissue;wound healing

活體動(dòng)物開放性傷口的愈合是一個(gè)由多種生理生化反應(yīng)所組成的復(fù)雜過程，一處傷口的愈合往往同時(shí)涉及整個(gè)生物機(jī)體的多個(gè)器官與組織和多種細(xì)胞、酶、激素等的生理反應(yīng)。其過程大致可以劃分為炎癥反應(yīng)階段與新組織形成階段。在炎癥反應(yīng)階段，主要是機(jī)體產(chǎn)生多種免疫細(xì)胞來清除傷口處的各種雜質(zhì)，防止病原體通過開放性傷口進(jìn)入機(jī)體的循環(huán)系統(tǒng)；在新組織形成階段，傷口處產(chǎn)生大量的肉芽組織，直至傷口處完全愈合，肉芽組織的增殖與遷移速率直接影響傷口愈合的速率。

目前，促進(jìn)傷口愈合藥物的作用機(jī)制主要有以下2方面：其一，藥物在炎癥反應(yīng)階段的作用，部分藥物可直接刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更多的免疫細(xì)胞，從而加速炎癥反應(yīng)的進(jìn)行。其二，藥物在新組織形成階段的作用，部分藥物能夠促進(jìn)傷口處肉芽組織的形成與轉(zhuǎn)移，或提高肉芽組織細(xì)胞的活力與分化能力，以加速傷口處新組織的形成。目前，已有研究報(bào)告證實(shí)，一些具有抗氧化、抗自由基功能的化合物及天然產(chǎn)物具有促進(jìn)傷口愈合的功效，如馬黛茶提取物[1]、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epi-gallocatechin-3-gallate, EGCG）[2]、木蝴蝶提取物[3]、單環(huán)氧生育三烯酚-α[4]、維生素C[5-6]等。茶多酚作為一種從茶葉中提取的天然抗氧化劑，近年來，國內(nèi)外多項(xiàng)研究成果表明其在體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下，能夠有效促進(jìn)人和動(dòng)物成纖維細(xì)胞的增殖以及遷移[7-8]，促使膠原蛋白的產(chǎn)生[9]，對開放性傷口的愈合具有促進(jìn)和加速作用；同時(shí)，茶多酚能夠有效清除自由基[10]并且抑制傷口處多種致病菌的生長繁殖，即能夠有效預(yù)防傷口出現(xiàn)感染性炎癥[11-12]；此外，茶多酚也能夠于傷口愈合后期在基因?qū)用嫔弦种芃MP-1和IL-1β基因的表達(dá)，防止傷口處過度的炎癥反應(yīng)[13-14]。然而，以上相關(guān)研究多停留在體外細(xì)胞試驗(yàn)階段，茶多酚在活體動(dòng)物傷口愈合過程中是否有效以及相關(guān)的作用機(jī)制并不清楚。為此，本文通過建立小鼠傷口模型，涂抹茶多酚后觀測傷口愈合情況并檢測相關(guān)指標(biāo)變化，旨在探究茶多酚在活體動(dòng)物外傷愈合過程中的作用并闡明其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)動(dòng)物：5周齡雄性ICR小鼠48只，購于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑

試驗(yàn)藥品：96%茶多酚復(fù)合物（含茶多酚96.02%，咖啡堿1.60%），購于杭州英仕利生物科技有限公司；肝素鈉、氯化鈉、無水乙醚、無水乙醇、組織固定液（4%多聚甲醛）、人工細(xì)胞愈合膜，購于杭州積好脂質(zhì)體有限公司。

試劑盒：小鼠超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒和小鼠白細(xì)胞介素-2（interleukin-2, IL-2）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，均購于武漢基因美生物科技有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）、AUX理發(fā)器B8（浙江省寧波市奧克斯集團(tuán)有限公司）、5804R高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）、恒溫培養(yǎng)箱（美國Shellab制造公司）。

1.4 試驗(yàn)方法1.4.1 試驗(yàn)分組及造模

48只雄性ICR小鼠隨機(jī)分成6組，每組8只，分別記為空白對照組、陽性對照組以及0.3%、0.5%、0.8%和1.0%茶多酚處理組。

茶多酚溶液按如下方法配置：準(zhǔn)確稱取5.21 g 96%茶多酚復(fù)合物，加入適量蒸餾水并通過溫水浴 （40～50 ℃）加熱至完全溶解后，定容于500 mL容量瓶中，配置成1.0%茶多酚溶液。以1.0%茶多酚溶液為母液，按照不同稀釋倍數(shù)分別配置成0.3%、0.5%、0.8%茶多酚溶液。

創(chuàng)傷模型按如下方式制作：首先對小白鼠進(jìn)行麻醉，讓其俯臥，選取小白鼠背部靠近臀部一段，以脊柱作為中軸線，使用理發(fā)器對小鼠背部進(jìn)行剃毛處理，剃毛范圍2 cm×3 cm；使用消毒處理后的鉛筆、鑷子、手術(shù)刀、剪刀于小鼠背部剃毛處制造大小為1 cm×1 cm的傷口，傷口深度至筋膜層。具體操作方法為將小鼠麻醉后使用鉛筆在其背部進(jìn)行標(biāo)記，描繪邊長為1 cm的正方形，然后用鑷子夾起外層皮膚，用剪刀沿鉛筆標(biāo)記處小心剪開，最后用手術(shù)刀將皮膚切下。使用該操作方法時(shí)應(yīng)盡可能保證小鼠背部皮下筋膜層完整，肌肉和骨骼不受傷害[1,15-16]，參考《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 福利倫理審查指南》 （GB/T 35892—2018）的規(guī)定進(jìn)行試驗(yàn)。

給藥方法如下：陽性對照組涂抹藥物為人工細(xì)胞愈合膜，使用消毒后的衛(wèi)生棉簽進(jìn)行給藥，給藥時(shí)需保證傷口被藥物完全覆蓋?？瞻讓φ战M為傷口模型制作后，不進(jìn)行任何處理。茶多酚試驗(yàn)組給藥量為每次50 μL，即使用移液槍吸取相應(yīng)含量的茶多酚溶液50 μL，小心滴至傷口處，使用消毒后的衛(wèi)生棉簽將茶多酚溶液完全涂抹均勻（衛(wèi)生棉簽已在相應(yīng)含量的溶液中完全浸潤）。各組給藥時(shí)間均為晚上8：00，每天一次，持續(xù)9 d，每3 d觀測傷口大小并拍照。給藥期間，每天早、中、晚進(jìn)行觀察，同時(shí)對傷口處沾染的異物進(jìn)行清理[17]。處理9 d后，用乙醚將小鼠麻醉取血、處死，留存小鼠血清及傷口處皮膚，備用。

1.4.2 肉眼觀察

分組試驗(yàn)開始后，每3 d對各組小鼠傷口大小進(jìn)行測量并拍照，粗略計(jì)算各組小鼠傷口的縮小比例，計(jì)算公式如下：小鼠背部傷口縮小比例/%=（初始時(shí)小鼠傷口面積/cm2－處死時(shí)小鼠傷口面積/cm2）÷初始時(shí)小鼠傷口面積/cm2。在計(jì)算以上小鼠傷口面積時(shí)，均將小鼠傷口近似地看作矩形，根據(jù)長×寬的方式進(jìn)行計(jì)算，并求各組平均值作為感觀的傷口愈合速率比較指標(biāo)。

1.4.3 小鼠血清中TNF-α及IL-2含量測定

分組試驗(yàn)9 d后，將小鼠處死并取血，小鼠血液收集于預(yù)先加入肝素鈉的離心管中，在4 ℃、2 500 r/min條件下離心10 min，收集上清液，保存于4 ℃冰箱中，于1周內(nèi)完成測樣。

使用小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素-2（IL-2）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒對小鼠血清進(jìn)行測定，通過測定所得數(shù)據(jù)，分析茶多酚處理對受傷小鼠免疫系統(tǒng)的影響。試驗(yàn)具體操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.4 小鼠血清SOD水平測定

使用SOD酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒測定小鼠血清中SOD含量，研究茶多酚對小鼠傷口處自由基的清除情況。試驗(yàn)具體操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.5 傷口處皮膚蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色切片

將小鼠處死并取血后，以傷口為中心取2 cm× 2 cm表皮，置于組織固定液（4%多聚甲醛）中固定24 h以上，隨后對樣品進(jìn)行脫水、包埋、切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察傷口情況，主要觀察肉芽組織中成纖維細(xì)胞的生長、增殖情況以及膠原纖維、新毛細(xì)血管的生成情況，并使用目鏡網(wǎng)格計(jì)數(shù)法對成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間顯著性分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚對傷口愈合效果的觀察

使用不同含量的茶多酚對各組小鼠處理9 d后觀察其傷口宏觀變化，結(jié)果如圖1所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，陽性對照組以及空白對照組傷口顏色較淺，而茶多酚處理組傷口顏色較深。其中：在試驗(yàn)3 d后，陽性對照、0.3%和0.5%茶多酚處理組的傷口變化較明顯，傷口面積明顯減??；在試驗(yàn)6 d后，空白處理組的傷口面積也明顯減小，而0.8%和1.0%茶多酚處理后的傷口變化并不明顯。

圖1

圖1  小鼠背部傷口肉眼觀察結(jié)果

Fig. 1  Eye observation results of the back wound in mice

處理9 d后，各處理組傷口面積變化如表1所示。從中可知：當(dāng)茶多酚處理的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.3%及0.5%時(shí)，茶多酚能夠較為明顯地提升傷口的愈合速率，其對傷口的早期止血結(jié)痂具有明顯的加速作用，優(yōu)于陽性對照組和空白對照組。在傷口形成3 d后，0.3%及0.5%茶多酚處理組傷口面積均減小約50%，表明較低含量的茶多酚在傷口愈合早期對傷口處的血液凝結(jié)以及炎癥反應(yīng)具有一定的促進(jìn)作用，但較高含量茶多酚會減緩小鼠傷口愈合速率。

表1  各處理組傷口面積縮小比例

Table 1  Reduction rates of the wound area in each treatment group

處理組

Treatment group

9 d后傷口面積平均縮小比例

Reduction rate of the wound

area after 9 d/%

陽性對照 Positive control75.30±3.24a空白對照 Blank control64.40±4.73b0.3%茶多酚 0.3% TPPs79.30±3.21a0.5%茶多酚 0.5% TPPs77.07±6.67a0.8%茶多酚 0.8% TPPs57.84±8.22bc1.0%茶多酚 1.0% TPPs43.83±9.33c

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在P＜0.05水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；n=8。

TPPs: Tea polyphenols. The values within a column followed by different lowercase letters show significant differences at the 0.05 probability level; n=8.

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2.2 茶多酚對血清中TNF-α及IL-2含量的影響

腫瘤壞死因子（TNF-α）是生物體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子，在免疫調(diào)節(jié)過程中，TNF-α作為一個(gè)“啟動(dòng)環(huán)節(jié)”，對生物體內(nèi)的各項(xiàng)免疫應(yīng)答都起到了重要的調(diào)節(jié)作用[18]。生物體血清內(nèi)的TNF-α濃度可以比較直觀地顯示出該生物體的免疫應(yīng)答狀態(tài)。IL-2主要來源于活化的T淋巴細(xì)胞，它能夠保證T淋巴細(xì)胞在體液中維持正常的形態(tài)與功能，同時(shí)，也能夠激活其他多種免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，是一種在炎癥反應(yīng)階段發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子[19]。本試驗(yàn)測定的小鼠血清中TNF-α及IL-2含量如表2所示。

表2  各處理組小鼠血清中TNF-α和IL-2含量

Table 2  Concentrations of TNF-α and IL-2 in mice serum of each treatment group

處理組

Treatment group

ρ（TNF-α）/

(pg/mL)

ρ（IL-2）/

(pg/mL)

陽性對照 Positive control110.20±1.10b25.43±1.75d空白對照 Blank control129.68±3.46a33.36±2.32a0.3%茶多酚 0.3% TPPs124.68±17.19ab29.66±1.76bc0.5%茶多酚 0.5% TPPs111.30±16.97b27.87±0.74c0.8%茶多酚 0.8% TPPs121.33±3.27ab30.80±1.44b1.0%茶多酚 1.0% TPPs130.99±19.33a28.83±1.33bc

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在P＜0.05水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；n=8。

TPPs: Tea polyphenols. The values within a column followed by different lowercase letters show significant differences at the 0.05 probability level; n=8.

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陽性對照組的TNF-α及IL-2含量顯著低于空白對照組，說明該組小鼠體內(nèi)針對創(chuàng)傷的應(yīng)激免疫反應(yīng)已恢復(fù)至正常水平。各茶多酚處理組中，與空白對照組相比，0.5%茶多酚處理組的TNF-α和IL-2含量顯著降低，0.3%、0.8%、1.0%茶多酚處理組的TNF-α含量下降不明顯，IL-2含量顯著降低，說明一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的茶多酚（1.0% TPPs）能在炎癥反應(yīng)階段后期顯著地降低小鼠體內(nèi)免疫因子的含量，防止小鼠出現(xiàn)免疫過度現(xiàn)象。與陽性對照組相比，較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.3%、0.5%）的茶多酚處理組中的TNF-α、IL-2含量仍然較高。此外，與0.5%茶多酚處理組及陽性對照組相比，1.0%茶多酚處理組的TNF-α含量顯著升高；比較各組IL-2含量也發(fā)現(xiàn)，0.3%與0.5%茶多酚處理組均與空白對照組之間差異極顯著，0.5%與0.8%茶多酚處理組之間差異顯著。以上結(jié)果表明，茶多酚對受傷小鼠炎癥反應(yīng)階段后期體內(nèi)炎癥反應(yīng)的抑制作用受到茶多酚含量的影響，在含量較低時(shí)（0.8%以下），其抑制效果較好，且0.5%茶多酚具有最好的抑制效果，之后隨著茶多酚含量的升高，其抑制作用減弱。

2.3 茶多酚對SOD含量的影響

SOD是一種生物體內(nèi)的活性物質(zhì)，簡而言之，SOD具有抗氧化作用，在體內(nèi)可催化自由基的歧化反應(yīng)，消除體內(nèi)過量的自由基，以免其對機(jī)體造成損害，延緩機(jī)體衰老。小鼠在受到創(chuàng)傷后，由于炎癥反應(yīng)，受傷小鼠體內(nèi)會產(chǎn)生大量的自由基，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更多的SOD以消除體內(nèi)過量的自由基[20]。

本試驗(yàn)測定的小鼠血清中SOD含量如表3所示。與空白對照組相比，陽性對照組機(jī)體內(nèi)SOD含量并無顯著性差異，這是由于人工細(xì)胞愈合膜主要作用于新組織形成階段，對于清除傷口處的自由基并沒有明顯作用。而與空白對照組相比，茶多酚處理組試驗(yàn)小鼠體內(nèi)SOD含量均顯著降低。一般來說，正常健康小鼠體內(nèi)SOD處于較低水平，而在受傷或應(yīng)激小鼠體內(nèi)，機(jī)體受自由基的刺激產(chǎn)生大量的SOD，可清除炎癥過程中伴隨產(chǎn)生的自由基，因此，在一般情況下機(jī)體內(nèi)較高水平的SOD可相應(yīng)地說明其體內(nèi)丙二醛（malondialdehyde, MDA）等過氧化物含量較低。在本試驗(yàn)中，茶多酚作為一種外源物質(zhì)直接施用于傷口處，而茶多酚作為一種天然產(chǎn)物具有良好的清除自由基的功能，因此，推測這一試驗(yàn)結(jié)果可能是由于茶多酚能夠在一定程度上直接清除傷口處自由基，從而使得機(jī)體內(nèi)SOD仍維持在較低水平。

表3  各處理組小鼠血清SOD含量

Table 3  Concentrations of SOD in mice serum of each treatment group

處理組

Treatment group

ρ（SOD）/(pg/mL)陽性對照 Positive control434.72±10.23ab空白對照 Blank control445.39±20.05a0.3%茶多酚 0.3% TPPs429.16±4.33b0.5%茶多酚 0.5% TPPs393.83±6.57c0.8%茶多酚 0.8% TPPs400.00±9.96c1.0%茶多酚 1.0% TPPs413.62±4.05bc

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在P＜0.05水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；n=8。

TPPs: Tea polyphenols. The values within a column followed by different lowercase letters show significant differences at the 0.05 probability level; n=8.

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2.4 HE染色切片結(jié)果

HE染色切片結(jié)果如圖2所示。除空白對照組及1.0%茶多酚處理組外，其余各組切片均顯示小鼠傷口處肉芽組織內(nèi)有大量毛細(xì)血管生成。同時(shí)也可以觀察到，各組小鼠肉芽組織內(nèi)均能夠產(chǎn)生大量的成纖維細(xì)胞及膠原纖維束，且各組的數(shù)量并沒有太大差別，說明各組處理均不會影響生物體在新組織形成階段的正常生理功能。但可以發(fā)現(xiàn)，在完全不敷藥的情況下，傷口處肉芽組織新血管形成較為緩慢，且膠原纖維束較細(xì)；而在1.0%茶多酚處理情況下，也出現(xiàn)了類似的狀況，即肉芽組織新血管形成較少。不過，在本次試驗(yàn)所得的HE染色切片中并未發(fā)現(xiàn)明顯的中性粒細(xì)胞，這可能是由于試驗(yàn)時(shí)間過長，小鼠傷口處炎癥反應(yīng)階段已基本結(jié)束，中性粒細(xì)胞浸潤速率降低。

圖2

圖2  肉芽組織HE染色切片

A. 陽性對照組；B. 空白對照組；C. 0.3%茶多酚處理組；D. 0.5%茶多酚處理組；E. 0.8%茶多酚處理組；F. 1.0%茶多酚處理組。BV：血管；Fib：成纖維細(xì)胞；CF：膠原纖維束。

Fig. 2  HE staining sections of granulation tissue

A. Positive control group; B. Blank control group; C. 0.3% tea polyphenols (TPPs) treatment group; D. 0.5% TPPs treatment group; E. 0.8% TPPs treatment group; F. 1.0% TPPs treatment group. BV: Blood vessel; Fib: Fibroblast; CF: Collagenous fiber bundle.

使用目鏡網(wǎng)格計(jì)數(shù)法對成纖維細(xì)胞與血管進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明：與空白對照組相比，用0.3%及0.5%的茶多酚處理傷口，對傷口處成纖維細(xì)胞的增殖沒有顯著影響，而在0.8%、1.0%較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的TPPs處理下，成纖維細(xì)胞的增殖受到顯著抑制。在本試驗(yàn)中，計(jì)數(shù)血管為真皮層靜脈血管，且HE切片為縱切面，視野中的血管分布不均勻，主要靠近表皮層和皮下組織的兩側(cè)，因此，按 4 μm厚度切片，對每厘米真皮層中所含有的血管數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與空白對照組相比，0.3%和0.5%茶多酚處理組血管數(shù)量有所增加，茶多酚對血管的形成有一定的促進(jìn)作用，然而各組數(shù)據(jù)與空白對照組相比并無顯著性差異。以上結(jié)果表明，用較低含量的茶多酚對傷口進(jìn)行處理，可加速傷口處肉芽組織的增殖，加快新毛細(xì)血管的形成，從而加速傷口愈合。

圖3

圖3  成纖維細(xì)胞與血管數(shù)目計(jì)數(shù)結(jié)果

A. 陽性對照組；B. 空白對照組；C. 0.3%茶多酚處理組；D. 0.5%茶多酚處理組；E. 0.8%茶多酚處理組；F. 1.0%茶多酚處理組。短柵上不同小寫字母表示在P＜0.05水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；n=8。

Fig. 3  Number of fibroblasts and blood vessels

A. Positive control group; B. Blank control group; C. 0.3% tea polyphenols (TPPs) treatment group; D. 0.5% TPPs treatment group; E. 0.8% TPPs treatment group; F. 1.0% TPPs treatment group. Different lowercase letters above bars represent significant differences at the 0.05 probability level; n=8.

3 討論與結(jié)論

綜上所述，可以從如下幾點(diǎn)來闡明茶多酚促外傷愈合的部分機(jī)制：1）茶多酚可以加速傷口處炎癥反應(yīng)，并在炎癥反應(yīng)后期抑制部分免疫細(xì)胞因子（如IL-2）的生成，防止炎癥反應(yīng)過度；2）茶多酚可能具有清除傷口處因炎癥反應(yīng)而生成的大量自由基的作用，以防止自由基對傷口處新生組織的破壞；3）茶多酚可能具有加速傷口處肉芽組織的增殖和組織內(nèi)部新血管生成的作用。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚對小鼠外傷愈合的促進(jìn)效果受到茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，0.5%茶多酚處理下效果最好，而當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高（0.8%以上）時(shí)，則會減緩?fù)鈧?。本試?yàn)測定的TNF-α含量在茶多酚各處理組中普遍較低。TNF-α作為一種“啟動(dòng)因子”，影響傷口愈合階段成纖維細(xì)胞的增殖以及其他細(xì)胞因子例如IL-2、IL-6等的表達(dá)與釋放，因此，推斷茶多酚處理可加速小鼠受傷后的免疫應(yīng)答，在較短時(shí)間內(nèi)即可使TNF-α恢復(fù)至正常水平。

我國是茶葉生產(chǎn)大國，在一些產(chǎn)茶地區(qū)，流傳著使用茶渣、濃茶水外敷處理傷口的偏方，國內(nèi)也有研究表明，茶多酚中的EGCG在一定濃度下可影響受創(chuàng)傷小鼠體內(nèi)一些白細(xì)胞介素的表達(dá)[14]；ER等[7]指出，茶多酚可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。以上研究均表明茶多酚在促進(jìn)傷口愈合方面有一定的研究價(jià)值和應(yīng)用潛力。2013年，ASADI等的研究指出，0.6%綠茶乙醇提取物（主要功效成分為茶多酚）在混合凡士林后敷于小鼠外科手術(shù)傷口處，可加速傷口處毛細(xì)血管生成及傷口愈合[21]；該團(tuán)隊(duì)同時(shí)還指出，凡士林混合0.6%綠茶乙醇提取物對小鼠燒傷傷口的愈合有一定的幫助[22]，但他們未對不同濃度綠茶提取物進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，因而茶多酚促進(jìn)傷口愈合的適宜濃度范圍并未確定。由于茶多酚具有一定的生物毒性，在較高濃度條件下對人體正常細(xì)胞有一定的毒副作用，其對正常細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）一般在200 μg/mL左右，但鮮有茶多酚作為皮膚外敷藥的適宜濃度的探究。本試驗(yàn)所選取的茶多酚濃度是在前人研究的成果上進(jìn)行的探究，可作為該研究結(jié)果的補(bǔ)充和深入。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，茶多酚處理組小鼠傷口處顏色較深，推測其可能的原因?yàn)榻佑|較高濃度茶多酚溶液導(dǎo)致外層細(xì)胞壞死或茶多酚在傷口處堆積并氧化后變成褐色。試驗(yàn)整體結(jié)果進(jìn)一步探尋了茶多酚作為創(chuàng)傷藥物的適宜濃度以及作為外敷藥時(shí)對機(jī)體的生物毒性，為將來可能的醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

對目前市場上各類創(chuàng)傷藥物進(jìn)行調(diào)研可以發(fā)現(xiàn)，市售各類藥物均以復(fù)合藥物為主，單一功效成分的藥物存在較大的局限性，并不能發(fā)揮最大的治療功效。如QIN等[23]利用茶多酚及EGCG與殼聚糖復(fù)合治療創(chuàng)傷傷口并取得了較好的功效，該研究表明，茶多酚及EGCG在與殼聚糖復(fù)合后均能顯著提升傷口愈合效果。本試驗(yàn)在QIN等的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索茶多酚作為單獨(dú)藥物使用時(shí)對傷口愈合的作用機(jī)制，以期排除殼聚糖等干擾因素，為將來更多樣化的藥物復(fù)合選擇提供一定的理論依據(jù)。因此，在今后研究中可考慮探究茶多酚與其他相關(guān)藥物（例如大黃、乳香、兒茶、血竭等中草藥）之間的相互影響及聯(lián)合作用，制作以茶多酚為主，其他藥物為輔的復(fù)合藥物，提高該類藥物的治療效果。值得注意的是，茶多酚并不是一種單一的化合物，而是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，因此，探究茶多酚中某些單體（例如EGCG等）的愈傷作用也可作為研究重點(diǎn)，從而進(jìn)一步提高相關(guān)藥物的愈傷效率。除此之外，活體動(dòng)物傷口的愈合除考慮愈合速率外，還需考慮愈后的傷口美觀度，傷口愈合美觀度與傷口處各類型膠原蛋白的產(chǎn)生量及其比值有關(guān)。有研究者認(rèn)為，若Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白在機(jī)體內(nèi)生成的比例不當(dāng)，容易在傷口愈合后形成較大面積的瘢痕[24]。本次試驗(yàn)初步證明了茶多酚在傷口愈合后期具有加速傷口處新組織形成的功效，且傷口處宏觀觀察結(jié)果顯示，茶多酚處理組小鼠愈后美觀度較好，新生毛發(fā)生長情況正常。該試驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)茶多酚作為一種創(chuàng)傷藥物的祛疤功能研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

總之，在如今茶葉產(chǎn)能逐漸過剩的背景下，研究茶多酚對于傷口愈合的影響具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。通過本次試驗(yàn)，初步證明了適宜含量茶多酚可宏觀上加速傷口愈合，減輕愈傷后期傷口處免疫應(yīng)答的激烈程度，同時(shí)對傷口處真皮層肉芽組織的增殖和血管的形成有一定的積極影響。

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