一、引 言

每年年底，《Nature Methods》都會對過去一年中推動生命科學發(fā)展的技術方法做出回顧與總結，由此評選出當年最受矚目、影響力最大的技術。

2017年，類器官（organoids）榮膺Nature Methods年度生命科學技術。在廣大科研工作者的不懈努力之下，近年來，類器官研究取得了豐碩的研究成果。

所謂的“類器官”是由干細胞或腫瘤細胞在三維培養(yǎng)條件下自我組裝而成的一種三維的微器官，它能夠高度模擬原位組織的生理結構和功能，經長期傳代保持穩(wěn)定的遺傳信息。

類器官可以稱得上是神奇的“多面手”，其高度仿真的特性，讓研究人員可以利用該模型，深入觀察器官的發(fā)育進程，檢驗藥物的功能以及發(fā)展實驗室層面的再生治療方法。 

本文作者：Dr. Grace Yuan

二、類器官培養(yǎng)進展

2019年美國賓夕法尼亞大學的科研人員在Cell上發(fā)表了題為“A Patient-Derived Glioblastoma Organoid Model and Biobank Recapitulates Inter- and Intra-tumoral Heterogeneity”的文章，文章中報道了病人源性膠質母細胞瘤類器官（glioblastoma organoid，GBO）模型和生物庫的建立。

該研究表明GBO保留了膠質母細胞瘤的主要特征，可以迅速用于為患者制定治療策略?？蒲腥藛T建立的生物庫為膠質母細胞瘤基礎和轉化研究提供了豐富的資源。

通過明場圖像展示保留親代腫瘤組織學特征的病人源性膠質母細胞瘤類器官的形成過程

在這篇文章中，科研工作者不僅通過顯微鏡觀察記錄了類器官的生長過程和形態(tài)變化，還通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察了一些蛋白標志物在類器官中的表達模式，證明了類器官細胞形態(tài)與特征上明顯的異質性，其細胞組成與親代腫瘤高度相似。

共聚焦圖像展示了病人源性膠質母細胞瘤類器官中的微血管以及缺氧梯度。框1中細胞因缺氧無增殖細胞產生，而框2中綠色細胞為增殖細胞。

2020年1月24日，Science期刊發(fā)表了一篇題為“Chromatin accessibility dynamics in a model of human forebrain development”的論文。在這篇論文中，科研人員描述了人類前腦類器官的培育及用途。作為球狀結構，人類前腦類器官可以自組裝成前腦的不同部分。更令人興奮的是，研究人員還找到了一種可以極大地延長人類前腦類器官的壽命（長達300天）的方法，這足以觀察到前腦類器官發(fā)展成更復雜的結構。

2022年發(fā)表在Science上的“Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects”，揭示了人類特定的發(fā)育過程是導致皮質發(fā)育畸形(MCDs)的原因，這會導致兒童發(fā)育遲緩和癲癇。研究中，科研人員建立了結節(jié)硬化癥(tuberous sclerosis complex, TSC)的人腦類器官模型，并鑒定了一種特定的神經干細胞類型，即尾部晚期中間神經元祖細胞 (caudal late interneuron progenitor，CLIP)。在TSC中，CLIP細胞過度增殖，產生過多的中間神經元、腦腫瘤和皮層畸形。

雖然類器官作為研究模型，在發(fā)育、疾病和藥物研究，以及再生醫(yī)學等領域具有廣闊的發(fā)展前景，但因其培養(yǎng)條件及結構等都要比貼壁細胞復雜，因此在類器官的培養(yǎng)、觀察以及數(shù)據(jù)量化分析方面，都具有很多難點。今天就給大家簡單梳理一下，顯微成像設備如何助力類器官的培養(yǎng)、觀察和數(shù)據(jù)分析。

三、顯微成像助力類器官相關研究

1. 類器官的培養(yǎng)質控

類器官制備的典型方法是分離胚胎或多能干細胞，然后將這些細胞培養(yǎng)在基質膠Matrigel類的支持介質上，使其能夠三維生長。介導類器官形成的信號通路與體內器官發(fā)育與穩(wěn)態(tài)維持的信號通路是相同的，因此，細胞因子、生長因子和小分子也要添加到培養(yǎng)基中，以激活或者抑制參與類器官形成的特定信號通路。制備不同的類器官需使用不同的添加物組合，即使對于小腸和結腸等結構非常相近的組織，添加物的組合也不盡相同。

有研究表明，未分化狀態(tài)培養(yǎng)過程中 iPS 細胞系的初始增殖狀態(tài)對隨后的分化誘導效率有著極大的影響。因此，在為類器官分化階段開發(fā)更優(yōu)方案之外，優(yōu)化單個 iPS 細胞系的未分化狀態(tài)培養(yǎng)階段的方案，對于可重復地生成多份類器官樣本來說至關重要。

奧林巴斯公司研發(fā)的CM20細胞培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)可將監(jiān)控頭和細胞或類器官培養(yǎng)物共同置于培養(yǎng)箱中，系統(tǒng)定期對培養(yǎng)標本進行掃描，數(shù)據(jù)將通過計算機工作站進行無線通信。使用CM20 細胞培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)，對樣品進行時間序列培養(yǎng)數(shù)據(jù)采集、存儲和分析，科研工作者能夠了解 iPS 細胞在培養(yǎng)期間的狀態(tài)，并確定提高分化效率的關鍵因素，從而進一步改進試驗方案。

細胞培養(yǎng)監(jiān)控系統(tǒng)CM20

由于類器官的培養(yǎng)時間長，所需培養(yǎng)基以及維持其生長的添加物價格較貴，因此科研工作者需要特別關注類器官的培養(yǎng)過程及其生長狀況，并且盡量避免培養(yǎng)中的類器官被污染。使用CM20系統(tǒng)后，科研人員無需進入潔凈室從培養(yǎng)箱中取出標本鏡檢，即可對培養(yǎng)標本的生長狀況進行遠程監(jiān)控，極大地提升了實驗效率，降低了污染的風險。

CM20系統(tǒng)除了幫助科研人員遠程監(jiān)控持續(xù)培養(yǎng)中的標本的生長狀況，還可以提供定量數(shù)據(jù)，例如對細胞進行計數(shù)并確定融合度分析，從而幫助廣大科研工作者優(yōu)化培養(yǎng)條件，實現(xiàn)對培養(yǎng)物進行精確的質量控制并評估實驗流程節(jié)點。

CM20拍攝到的類器官在培養(yǎng)箱中的發(fā)育過程

2. 類器官的顯微成像

由于類器官屬于三維細胞培養(yǎng)物，具有一定的體積，因此在進行成像時，為了獲取完整的類器官形態(tài)特征及內部細胞結構，能夠采集多層Z軸圖像信息進行3D成像的顯微成像設備是首選。

1）激光掃描共聚焦因其光路設計中增加了用于阻擋非焦平面信息的針孔，可以提高Z軸的分辨率，適合對類器官標本進行Z序列圖像的采集。

奧林巴斯激光掃描共聚焦FV3000具有靈敏度高、成像精度高、光譜分辨率高等特點，系統(tǒng)采用專利的體相位全息透射衍射光柵進行分光，可在所有通道上進行高效、準確的全真光譜檢測獲得高分辨率、高對比度的樣品圖像，從而構建精確的3D圖像，特別適合進行類器官的深層觀察。該系統(tǒng)還提供了成熟的近紅外成像解決方案，近紅外成像由于具有穿透深、光毒性小、組織自發(fā)光干擾小等優(yōu)點，可與可見光范圍內的各種熒光染料搭配，進行無串擾的類器官多色熒光成像。

激光掃描共聚焦顯微鏡FV3000  

FV3000對3D培養(yǎng)的細胞球連續(xù)觀察21天。SYTOX? Orange標記細胞核，Alexa Fluor 488 標記了細胞骨架。

2）對于體積較大的類器官標本，不僅需要采集Z序列圖像，往往還需要進行拼圖，這對成像系統(tǒng)的圖像采集速度有較高的要求。

奧林巴斯超分辨轉盤共聚焦SpinSR具有成像速度快、靈敏度高、光毒性低、可升級分辨率高達110nm的超分辨模塊等特點，可以對類器官標本進行快速的Z序列成像及拼圖。SpinSR系統(tǒng)可搭配奧林巴斯率先研發(fā)的一系列硅油物鏡，對類器官進行高分辨率高信噪比深層成像。

超分辨轉盤共聚焦系統(tǒng)SpinSR

適合進行深層成像的硅油物鏡

硅油物鏡以其特殊的折射率為1.40的硅油做為介質，即滿足采集高分辨率圖像的要求（分辨率高于浸水介質物鏡），又滿足類器官等厚標本的高散射標本觀察。

3）對于體積較大的類器官標本，為了采集到完整的標本圖像，對成像深度有更高的需求。雙光子或者光片顯微鏡是最適合進行深層成像的顯微成像系統(tǒng)。

奧林巴斯FVMPE-RS多光子顯微鏡采用了先進的光學設計，可提高深度成像靈敏度和分辨率。400 nm至1600 nm的超寬光譜透過率可在不影響短波長檢測的情況下實現(xiàn)更高效近紅外激發(fā)；大靶面高效率的檢測光路可以匯集更多的發(fā)射信號，尤其是大角度的散射光子 ，采集到類器官標本更深層的信息；TruResolution物鏡可通過自動球差補償提高深層成像亮度和分辨率，從而獲得三維圖像在各個層面上的更多細節(jié)信息。

雙光子顯微鏡 FVMPE-RS

奧林巴斯在售的光片顯微鏡系統(tǒng) Alpha3 具備實時光學聚焦擴展功能的雙照明系統(tǒng)，可在整個視場上實現(xiàn)均勻照明，有助于獲取標本的全部信息，并使得采集到的類器官Z序列數(shù)據(jù)，經3D重構后完全沒有拼接的痕跡；

系統(tǒng)可以搭配多種耐腐蝕樣品適配器，具備從細胞到整個透明化組織或生物體成像的靈活性；該光片系統(tǒng)還具備智能3D掃描技術，能夠以75幅/秒的速度采集圖像；兼容奧林巴斯全系列物鏡，適合對多種標本進行從宏觀到微觀的成像。

需要特別注意的是，當類器官體積較大時，則需要對其進行透明化處理，才能利用光片顯微鏡或雙光子顯微鏡采集到完整的類器官圖像。

光片顯微鏡系統(tǒng)Alpha3

3. 類器官圖像的量化分析

利用激光掃描共聚焦、雙光子、光片等高端顯微成像設備，可以拍攝到類器官標本從宏觀到微觀清晰的圖像，幫助科研工作者觀察到3D標本內部每一個細胞乃至亞細胞的精細結構。

但是對于生命科學研究來說，只是觀察到標本的細節(jié)圖像是不夠的，在以類器官模型檢驗藥物功效及毒理分析等實驗中，還需要對類器官標本形態(tài)及內部的細胞進行定性和定量分析。例如比較多孔板中不同給藥濃度下多個類器官標本之間的差異，從而獲得更令人信服的統(tǒng)計學數(shù)據(jù)。

針對這些應用需求，奧林巴斯開發(fā)了一款專門針對微組織球與類器官等3D標本進行細胞分析的軟件— Novisight。

Novisight軟件界面及對不同濃度紫杉醇處理后的細胞球內部有絲分裂細胞的量化分析示例

NoviSight特別適合對多孔板內培養(yǎng)的細胞球或類器官等標本在復雜的3D范圍內進行細胞識別、分析和統(tǒng)計。該軟件特有的True 3D技術可幫助您真實還原樣品的空間形態(tài)，而多參量測量模塊可快速識別類器官及細胞組分，獲取如體積、表面積、空間距離和熒光強度等數(shù)據(jù)。此外，其交互式的設計讓您可以輕松地將細胞和統(tǒng)計數(shù)據(jù)一一對應，保證了數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析時的準確性。

由于類器官在基因水平和形態(tài)特點上能夠很好地模擬人體相應的組織，使其在發(fā)育模擬、疾病研究、臨床免疫、腫瘤藥敏、再生醫(yī)學和精準醫(yī)療等領域擁有廣闊的發(fā)展前景。但作為新興技術，類器官標本培養(yǎng)、質量控制、實驗重復性等方面依然有著局限性，因此類器官的基礎研究和應用轉化依然任重道遠。

奧林巴斯作為一家具有百年歷史的顯微鏡制造商, 一直致力于為廣大科研工作者提供全流程的實驗協(xié)助和技術支持。

我們希望通過為類器官研究提供從樣本制備到3D 數(shù)據(jù)采集與分析的完整解決方案，為”實現(xiàn)世界人民的健康、安心和幸福生活”略盡綿薄之力。

參考文獻：

[1] Fadi Jacob  A Patient-Derived Glioblastoma Organoid Model and Biobank Recapitulates Inter- and Intra-tumoral Heterogeneity. Cell 180 188-204 (2020)

[2] Alexandro E. Trevino  Chromatin accessibility dynamics in a model of human forebrain development. Science 367 No 6476 (2020)

[3] Oliver L.  Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects. Science 375, No 6579 (2022)

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網址: 如何用顯微成像解決方案“助力類器官研究” http://www.u1s5d6.cn/newsview681614.html