我們知道，腸道微生物群對人類健康和福祉很重要，調(diào)節(jié)宿主代謝，塑造免疫系統(tǒng)并防止病原體定植。

通過糞便微生物群移植（FMT）恢復(fù)平衡多樣的微生物群，已成為研究疾病發(fā)病機制中微生物群因果關(guān)系的潛在治療策略和有前途的工具。

然而，F(xiàn)MT 帶來了后勤方面的挑戰(zhàn)和潛在的安全風險，如病原微生物的轉(zhuǎn)移、不期望的表型（如肥胖）的潛在轉(zhuǎn)移，或在生命后期發(fā)展疾病的風險增加。

因此，一種更可控、更個性化的培養(yǎng)有益微生物混合物可能是更好的選擇。

這些有益微生物中的大多數(shù)將是宿主的內(nèi)源性共生體，沒有長期安全有益的使用歷史，因此通常被稱為下一代益生菌（NGP）或活生物治療產(chǎn)品（LBP）。

植物乳桿菌菌株，其益生菌和功能特性及其促進健康的作用脫穎而出，可以很好地調(diào)節(jié)腸道菌群組成。

一項FMT研究發(fā)現(xiàn)共生產(chǎn)丁酸菌Anaerobutyricum spp.（以前稱為Eubacterium hallii）與代謝綜合征受試者胰島素敏感性的提高有關(guān)。因此，著手進一步研究和開發(fā)這種潛在的有益微生物，并將重點放在Anaerobutyricum soehngenii L2-7等，因為它的特征最好。

在小鼠模型中使用Anaerobutyricum soehngenii 完成臨床前試驗后，在受控條件下生產(chǎn)菌株，并進行了幾項臨床研究，以評估其在人體中的安全性和有效性。

本文將以植物乳桿菌為例，介紹其益生菌特性；以A.soehingeii為例，介紹用于臨床的的開發(fā)，為下一代益生菌的開發(fā)和測試提供了實踐指導(dǎo)。

01下一代益生菌和活生物治療產(chǎn)品的定義

傳統(tǒng)的益生菌被定義為“活的微生物，當給予足夠的量時，會給宿主帶來健康益處”。這些微生物使用歷史悠久，被認為是安全的。

注：在美國具有公認安全（GRAS）狀態(tài)，在歐盟具有合格安全推定（QPS）狀態(tài)。

益生菌的使用可能代表一種調(diào)節(jié)腸道微生物群和改善人類疾病的治療策略。

相比之下，下一代益生菌（NGP）是一種沒有長期安全有益使用歷史的微生物，與傳統(tǒng)益生菌一樣，當以足夠的量給藥時，下一代益生菌對宿主健康有益。

2012年，美國食品和藥物管理局引入了活生物治療產(chǎn)品（LBP）一詞，定義為“一種生物產(chǎn)品”，其：

（1）含有活生物體，如細菌；

（2）適用于預(yù)防、治療或治愈人類疾病或病癥；

（3）不是疫苗。

LBP在《歐洲藥典》（Ph.Eur.）中被定義為“含有活微生物（細菌或酵母）的供人類使用的醫(yī)藥產(chǎn)品”。然而，由于LBP除了微生物外還包括最終產(chǎn)品的配方，并且被定義為藥物產(chǎn)品，因此不應(yīng)系統(tǒng)地使用該術(shù)語來替代NGP。

NGP一詞更為廣泛，包括LBP中存在的微生物和目前正在研究的、尚未在最終產(chǎn)品中配制的微生物。此外，NGPs既可以用作傳統(tǒng)益生菌等食品補充劑，也可以用作預(yù)防、治療或治愈疾病的醫(yī)藥產(chǎn)品。最后，轉(zhuǎn)基因微生物也可以被視為NGP，盡管最有可能作為LBP上市。

下圖示意性地描述了各種定義。

02植物乳桿菌作為益生菌特性

植物乳桿菌是乳桿菌中最重要的成員之一，由于其出色的益生菌特性（良好的 GI 耐受性、粘附性、抗氧化性和抗菌性），它通常被用作益生菌。

抵抗胃腸道疾病

將微生物視為益生菌的一個基本特征是能夠在人類胃腸道的惡劣條件下存活。

植物乳桿菌MA2菌株和B23菌株表現(xiàn)出良好的耐受性，可以在低pH值（2.5-3）下存活。植物乳桿菌KU15149 具有胃和膽汁鹽耐受性。

對腸粘膜和/或細胞外基質(zhì)成分的粘附能力

粘附到上皮細胞的粘膜或粘附到腸道細胞外基質(zhì)的成分是益生菌微生物的理想特征，因為它們將有利于益生菌在宿主中的定植和持久存在。

兩種植物乳桿菌菌株DKL3 和 JGR2 分別顯示出 82.8% 和 79.6% 的粘附程度。

植物乳桿菌菌株 KACC11451 和 Wikim0112 的腸上皮粘附率約為 60–62%.

抗氧化活性

一些益生菌已被證明具有抗氧化活性，可減少氧化反應(yīng)造成的損害。

植物乳桿菌DMDL 9010具有優(yōu)異的抗氧化能力

植物乳桿菌N-1 的完整細胞中存在抗氧化化合物

植物乳桿菌Wikim0112 和 KACC11451 表現(xiàn)出超過 70% 的活性類似于超氧化物歧化酶 (SOD)

植物乳桿菌 KU15149 具有高豐度的抗氧化劑

植物乳桿菌 MA2 具有高抗氧化能力

細菌素生產(chǎn)

細菌素可以在食物和宿主中發(fā)揮各種益處，因為它們可以分別延長保質(zhì)期和防止不必要的定植。許多植物乳桿菌菌株已被證明能夠產(chǎn)生細菌素，賦予這種微生物益生菌特性。

植物乳桿菌產(chǎn)生通常稱為 plantaricin 的細菌素。

KLDS1.0391、ZJ5、TN635、B23 和 AA135 菌株分別是細菌素 Plantaricin MG、Plantaricin ZJ5、細菌素 ST28MS 和 ST26MS、細菌素 BacTN635、細菌素 Lac-B23 和 Plantaricin AA135 的生產(chǎn)者，它們具有對幾種革蘭氏陰性菌的抗菌作用。

抗菌活性

益生菌的特點是抑制病原微生物的生長、發(fā)育和定植。

在植物乳桿菌的發(fā)酵代謝過程中，它會產(chǎn)生多種抗菌化合物（除細菌素外），其中可能包括有機酸，例如乳酸、檸檬酸、異丁酸和乙酸、乙醇、雙乙酰和 H2O2. 植物乳桿菌還可以產(chǎn)生具有天然抗真菌活性的胞外多糖。

植物乳桿菌WiKim0112 和 KACC11451的無細胞上清液顯示出抑制六種食源性病原體（即大腸桿菌）的能力

植物乳桿菌DMDL 9010 具有有效的抗菌成分，包括針對 4 種不同病原體的多種有機酸

植物乳桿菌SJ14中測定了對致病菌和機會性細菌（革蘭氏陰性和陽性）的抗菌能力以及對 8 種真菌的抗真菌能力

本土腸道調(diào)節(jié)

構(gòu)成腸道微生物組的不同物種的生態(tài)平衡，對于預(yù)防傳染性和非傳染性疾病以及阻止微生物群平衡的紊亂至關(guān)重要。益生菌具有調(diào)整腸道菌群組成和糾正免疫系統(tǒng)異常反應(yīng)的能力，從而對宿主產(chǎn)生不同的有益作用。

植物乳桿菌ZJ316 在體外腸道模型中發(fā)揮了微生物群的調(diào)節(jié)作用，增加了Veillonella的生長，這可以提高人體呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的免疫力。同時減少了 Blautia 的存在。

注：Blautia與肥胖兒童的腸道炎癥有關(guān)。

此外，ZJ316 菌株減少了腸桿菌科，包括共生生物和原發(fā)性和機會性病原體。

注：這些病原體很容易在發(fā)炎的腸道中繁殖，從而導(dǎo)致微生物群失衡。

不同植物乳桿菌菌株對腸道菌群的影響

更多關(guān)于植物乳桿菌的介紹詳見：

客觀認識植物乳桿菌 (L. plantarum) 及其健康益處

03Anaerobutyricum soehngenii 的發(fā)現(xiàn)與分離

隨著全球肥胖流行病的惡化，代謝綜合征的發(fā)病率急劇增加，比較容易患上心血管疾病和2型糖尿病。腸道微生物群的動態(tài)變化與代謝綜合征的出現(xiàn)相關(guān)。

進一步研究腸道微生物群在代謝綜合征中的因果作用 ↓↓↓

研究人員先前向患有代謝綜合征的男性受試者輸注了來自瘦健康供體的糞便微生物群。輸注供體微生物群6周后，與自體FMT組相比，外周胰島素敏感性隨著丁酸產(chǎn)生菌的水平而增加。

在這些產(chǎn)生丁酸的細菌中，厭氧產(chǎn)丁酸菌在小腸中更為豐富，這表明其在通過丁酸產(chǎn)生調(diào)節(jié)胰島素敏感性方面具有潛在作用。

由于胰島素抵抗代謝綜合征受試者的特點是產(chǎn)短鏈脂肪酸菌水平降低，口服丁酸鹽可改善飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的胰島素抵抗和血脂異常。

因此研究人員得出結(jié)論，A.soehingenii可能是一種有前途的下一代益生菌，可改善胰島素抵抗。

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1996年，從嬰兒糞便中分離出的A.soehngenii菌株L2-7，以前被命名為E.hallii，是一種嚴格厭氧、革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的Lachnospiracae科細菌。A.soehngenii菌是人類胃腸道核心菌群的一部分。與其他已知的丁酸鹽生產(chǎn)物種（如Roseburia和Faecalibacterium spp.）不同，A.soehingenii有能力在乙酸鹽存在下利用D-和L-乳酸鹽。此外，基因組中含有膽汁酸鈉共轉(zhuǎn)運蛋白和膽堿水解酶基因，表明A.soehngenii 可以影響宿主膽汁酸代謝。

學(xué)習要點和方向

下一代益生菌的開發(fā)通常采用兩種策略。

第一種方法是將特定菌株的存在與健康表型相關(guān)聯(lián)，并探討該菌株是否對疾病表型有因果影響。

迄今為止，已經(jīng)使用測序技術(shù)確定了許多NGP候選株，以選擇患病受試者中豐度耗盡的菌株或與FMT治療成功相關(guān)的菌株。

第二種策略是采用具有良好特征的益生菌菌株，并對該菌株進行基因修飾，例如通過生物活性分子的生產(chǎn)和遞送，從而賦予健康益處。

后一種方法將導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因生物（GMO）在世界各地受到特定法規(guī)的約束，如歐盟。

無論用于識別或生成NGP的策略如何，在體內(nèi)研究任何健康益處之前，需要在體外充分表征候選菌株。

下圖總結(jié)了除了菌株的基因分型和表型外，必須評估的最重要特征。

此外，必須記錄菌株的起源和隨后的操縱或基因修飾。如果存在任何抗微生物耐藥基因或毒力基因，則應(yīng)評估人體微生物群向其他微生物傳播的可能性，并采取措施減輕這種風險。

當下一代益生菌用于患有免疫抑制的上皮屏障損傷的患者時，應(yīng)確定細菌易位的風險。徹底的菌株特征評估對于在健康或患病人群中使用NGP的潛在安全問題至關(guān)重要。

04Anaerobutyricum soehngenii 臨床前發(fā)展

在對A.soehngenii進行體外測試后，研究人員轉(zhuǎn)向動物模型，以評估該菌株對胰島素敏感性的安全性和有效性。

首先，在厭氧條件下生產(chǎn)了一批臨床前的A.soehngenii。

簡而言之，培養(yǎng)物在厭氧條件下生長至指數(shù)階段結(jié)束，通過厭氧離心濃縮，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌，最后用10%甘油稀釋至100μl的106、108和1010菌落形成單位（CFU）濃度。

通過16S rRNA測序和細胞形態(tài)學(xué)的顯微評估來評估純度。

通過最可能數(shù)（MPN）分析評估生存能力，并通過顯微分析確認。樣品直接儲存在?80°C下，并在生產(chǎn)6個月內(nèi)使用，在此期間生存能力穩(wěn)定。

此外，其中一些樣品在2年內(nèi)進行了穩(wěn)定性測試，以支持臨床試驗的產(chǎn)品開發(fā)。

接下來，研究人員在雄性糖尿?。╠b/db）小鼠中進行了一項劑量發(fā)現(xiàn)研究，以測試口服A.soehingeii對胰島素敏感性和脂質(zhì)代謝的安全性和有效性。

每天用A.soehingeii或安慰劑（10%甘油）治療小鼠達4周，期間未觀察到不良事件（正常生命體征）。在胰島素耐受試驗期間觀察到胰島素敏感性的顯著改善，這在108CFU劑量下最強。這伴隨著肝臟脂肪的減少和Fasn和Acc1基因的表達減少，兩者都參與脂肪生成。

為了證實這些發(fā)現(xiàn)并進一步剖析A.soehingeii的治療機制，B?ckhed教授的實驗室對db/db小鼠進行了第二項研究。

用108 CFU的A.soehingeii或熱滅活A(yù).soehingeii處理小鼠4周。當體重保持不變時，在活躍的A.soehingeii治療后觀察到靜息能量消耗增加。此外，與熱滅活的A.soehingeii相比，活性A.Soehingeii增加了糞便丁酸水平，并改變了膽汁酸代謝。

這兩項小鼠研究表明，用 A.soehingeii 進行治療是安全的，并對代謝產(chǎn)生有益影響，這可能由丁酸鹽的產(chǎn)生和膽汁酸代謝的變化介導(dǎo)。這些數(shù)據(jù)用于獲得我們在人類中進行的臨床研究的倫理批準。

最近，對A.soehingeii CH106（一種來自A.soehingeii 菌株L2-7T的四環(huán)素敏感衍生物）進行了毒理學(xué)安全性評估，表明以推薦劑量攝入是安全的。

根據(jù)歐洲食品安全局（EFSA）和美國食品和藥物管理局（FDA）對新的不可吸收食品成分進行安全評估的要求，對A.soehingeii進行了遺傳毒性和亞慢性毒性評估。細菌反向突變和體外哺乳動物細胞微核試驗均未顯示出遺傳毒性作用。

此外，大鼠的90天亞慢性毒性沒有發(fā)現(xiàn)與A.soehingeii 喂養(yǎng)相關(guān)的任何不良事件，即使在最高劑量（5×1011 CFU/kg體重/天）下，也沒有發(fā)現(xiàn)超過人類建議每日攝入量100倍以上的不良事件。

這些研究結(jié)果支持口服A.soehingeii 作為食物補充劑是安全的。

學(xué)習要點和方向

在臨床前開發(fā)期間，應(yīng)提供足夠的藥理學(xué)和毒理學(xué)信息，以支持擬議的臨床試驗。

NGP的安全性和毒性研究具有挑戰(zhàn)性

由于該產(chǎn)品通常不會到達全身循環(huán)，但其代謝產(chǎn)物或其活性可能直接或間接影響身體的生理功能，因此療效和毒性不一定與劑量有關(guān)。

人體生理學(xué)和微生物群組成等其他因素可能會影響安全性和療效。

由于大多數(shù)NGP與人類宿主（全生物概念）共同進化，很難將動物研究的結(jié)果轉(zhuǎn)化為人類環(huán)境。

因此，強烈建議將體外、離體和體內(nèi)模型結(jié)合起來，以建立適應(yīng)預(yù)期人群風險的全球安全性概況。

通常根據(jù)經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）的良好實驗室規(guī)范（GLP）原則進行安全性和毒性研究。然而，由于需要創(chuàng)新的方法和模型（例如，人類胃腸道的人工模型），而這些方法和模型可能既無法驗證，也無法在GLP水平上驗證，因此這可能很困難。

對于食品成分和膳食補充劑，EFSA建議采用毒理學(xué)研究的分級方法。

該分級方法評估NGP的毒代動力學(xué)、遺傳毒性、亞慢性和慢性毒性、致癌性和致畸性，平衡數(shù)據(jù)要求和風險。該方法也用于A.soehingeii CH106的毒理學(xué)安全性評估。如果NGP打算用作患病人群中的藥物產(chǎn)品，則必須證明目標人群的安全性。

前面的圖總結(jié)了必須解決的最重要的問題，例如治療劑量和持續(xù)時間對毒性反應(yīng)的影響，以及致畸、致癌和遺傳毒性的可能性。

05生產(chǎn)適用于臨床試驗的 A. soehngenii

在能夠口服 A. soehngenii 給人類之前，必須制造出適合臨床試驗的產(chǎn)品。

在獨立倫理委員會批準時（2014年），A.soehngenii被視為益生菌，必須遵守荷蘭“Warenwet”，這符合歐盟膳食補充劑法規(guī)。這意味著必須根據(jù)危害分析和關(guān)鍵控制點（HACCP）標準進行生產(chǎn)。可根據(jù)HACCP標準進行臨床干預(yù)研究。

生長培養(yǎng)基

首先，為了大規(guī)模生產(chǎn)食品級產(chǎn)品，進一步優(yōu)化了生長培養(yǎng)基。該組合物基于先前的經(jīng)驗：

（1）實驗室化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為食品級來源

（2）僅使用無動物成分（無血紅素或肉蛋白胨）

（3）復(fù)雜性降低（微量礦物質(zhì)、維生素、碳源和有機酸的去除/減少）

（4）生物量產(chǎn)量進一步提高。原材料來源于經(jīng)過審計的可靠供應(yīng)商，以確保高質(zhì)量。發(fā)酵前，在大型發(fā)酵罐系統(tǒng)中制備并消毒生長培養(yǎng)基，通過氮氣（N2）沖洗使其完全厭氧。

發(fā) 酵

發(fā)酵分四個連續(xù)步驟進行，如下圖所示：

首先，用精心準備的A.soehngenii 冷凍種子儲備接種少量食品級培養(yǎng)基。動物研究中使用了相同的菌株，因此，該菌株具有良好的特性，是可行的、純凈的，沒有任何細菌或病毒污染物。在37°C下發(fā)酵24小時后，使用培養(yǎng)物接種1 L培養(yǎng)基，再次發(fā)酵18小時。

然后，使用該二級種子培養(yǎng)物在小型發(fā)酵罐中接種30 L培養(yǎng)基。該發(fā)酵罐發(fā)酵17小時，作為大規(guī)模發(fā)酵的試車。

最后，用10L小發(fā)酵罐的接種物接種大發(fā)酵罐中的290L培養(yǎng)基?？刂菩⌒秃痛笮桶l(fā)酵罐的溫度、pH和氧氣水平，并使用培養(yǎng)物的光密度（OD）確定發(fā)酵時間（14至18小時）。在大型發(fā)酵罐中發(fā)酵16小時后，A.soehngenii生長至OD約為10.

濃縮和洗滌

使用中空纖維膜（Koch膜系統(tǒng)；HF3043-25-43-PM500；HF3043-16-106-PM500）和PBS滲濾，濃縮并洗滌細胞。將發(fā)酵液冷卻至10°C，泵送通過厭氧膜裝置，并在3小時內(nèi)濃縮至40–50 L。

在第二階段進行滲濾以降低培養(yǎng)基成分和發(fā)酵產(chǎn)物的水平。使用超高溫對洗滌緩沖液進行滅菌、脫氣并直接添加到返回的細胞流中進入發(fā)酵罐。6小時后，將細胞濃縮約20倍至15升，99.8%的培養(yǎng)基化合物被丟棄成廢物，最終濃縮物中只剩下2.9%的培養(yǎng)基組分。

最后，可將9L產(chǎn)品從系統(tǒng)中收獲到10L的無菌N2沖洗容器中。

最終產(chǎn)品的制備

為臨床研究生產(chǎn)了四個不同的批次，包括600個試管和一個安慰劑批次，其中PBS中含有濃度為106、108和1010 CFU/mL的10mL A.soehngenii，PBS+10%甘油，PBS中只有10%甘油。

對于每一批，用甘油和PBS制備7L瓶用于進一步稀釋，將其高壓滅菌、冷卻并用N2沖洗。從9L收獲的濃縮液中，向這些瓶中加入必要的體積以獲得正確的濃度。在連續(xù)攪拌和N2沖洗下，將瓶子置于冰上。

首先用N2填充10mL管，然后用定量管泵填充10mL產(chǎn)品。立即關(guān)閉試管，貼上標簽，并在灌裝后10分鐘內(nèi)將其置于?30°C的冰箱中。所有填充均在消毒層流柜內(nèi)進行。

質(zhì)量控制

在制造過程中，持續(xù)監(jiān)測溫度、pH值和氧氣水平。此外，在過程中的每一步都測定了細胞計數(shù)和OD，以及是否存在任何污染物。由于厭氧菌很難在瓊脂平板上定量計數(shù)，因此在厭氧條件下進行MPN分析以獲得活細胞的數(shù)量，并用顯微鏡評估細胞形態(tài)。所有上述質(zhì)量控制均針對符合人類消費標準的包裝小瓶進行。

Anaerobutyricum soehingeii 中間體和最終產(chǎn)品規(guī)范

隨后，每6個月測試生產(chǎn)的小瓶的穩(wěn)定性。生產(chǎn)完成后，這些小瓶的“保質(zhì)期”為6個月，這是荷蘭法律要求的食品。如果滿足生存能力和純度標準，有機會延長小瓶的有效期。

下表顯示了在3年時間段內(nèi)具有最高劑量 A. soehngenii 的小瓶的效力和純度。

學(xué)習要點和方向

工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)是技術(shù)挑戰(zhàn)

與實驗室規(guī)模培養(yǎng)相比，以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)菌株對菌株和培養(yǎng)基的要求不同。因此，當一種菌株符合潛在NGP的條件時，應(yīng)采取措施，看看該菌株是否可以在工業(yè)規(guī)模上培養(yǎng)。

培養(yǎng)NGPs所需的嚴格條件是技術(shù)挑戰(zhàn)之一，例如需要特定的營養(yǎng)、缺氧、穩(wěn)定的溫度和合適的pH。此外，更長的保持時間、泵送的絕對壓力、下游凈化過程和儲存可能會對細菌細胞的生存能力產(chǎn)生負面影響。

將菌株加入產(chǎn)品后需要有效策略，將其輸送到作用部位

接下來，必須將菌株加入產(chǎn)品中，如膠囊、粉末或液體懸浮液。由于大多數(shù)NGP是嚴格的厭氧菌或兼性厭氧菌，因此應(yīng)盡量減少接觸氧氣。為此，應(yīng)降低容器中的氧氣滲透性，并可添加抗氧化劑以降低氧化還原電位。

攝入產(chǎn)品后，NGP必須在胃腸道的惡劣環(huán)境中生存。腸溶膠囊和微膠囊是保護細菌并將其運送至其作用部位的有效策略。

有效期之前，足夠量的遞送劑量

最終，制造需要產(chǎn)生一種強健、穩(wěn)定的產(chǎn)品，該產(chǎn)品將允許在有效期之前以足夠數(shù)量的NGP遞送有效劑量。

質(zhì)量控制和質(zhì)量保證計劃需要到位

對于醫(yī)藥產(chǎn)品或LBP，需要按照良好生產(chǎn)規(guī)范（GMP）進行生產(chǎn)。對于食品和膳食補充劑，HACCP認證工廠的生產(chǎn)是標準。無論如何，質(zhì)量控制和質(zhì)量保證計劃需要到位，以確保成分和最終產(chǎn)品的一致質(zhì)量，并確?？煽康纳a(chǎn)過程。

應(yīng)從所用原材料、細胞庫系統(tǒng)、細胞生長和收獲、純化和下游加工到過程中測試，應(yīng)清楚記錄菌株的制造過程。

徹底描述最終產(chǎn)品的制造

同樣，必須徹底描述最終產(chǎn)品的制造，包括生產(chǎn)記錄和配方、填充、標簽和包裝說明。對于菌株和產(chǎn)品制造，必須評估與同一房間或同一接觸設(shè)備生產(chǎn)的其他產(chǎn)品交叉污染的風險。

必須描述菌株和產(chǎn)品的規(guī)格

包括采樣程序和驗證測試方法的說明。這些規(guī)范應(yīng)描述身份、效力、純度、污染、外觀，如果適用，還應(yīng)描述活細胞百分比、顆粒物、熱原、pH和殘留水分的附加測試。

必須生成穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

證明產(chǎn)品在計劃的使用期限內(nèi)，在效力和污染方面是穩(wěn)定的。

對于冷凍產(chǎn)品，應(yīng)評估多次凍融循環(huán)的影響，而對于凍干產(chǎn)品，應(yīng)探討重構(gòu)后的保質(zhì)期。

需要評估該產(chǎn)品對環(huán)境的影響

特別是當該菌株經(jīng)過基因修飾、致病、生態(tài)上比野生型更適合或難以根除時。

06Anaerobutyricum soehingeii 的臨床試驗

安全性/劑量發(fā)現(xiàn)試驗

為了驗證人類環(huán)境中的小鼠數(shù)據(jù)，研究人員建立了一項單盲、I期/II期劑量遞增試驗，以確定Anaerobutyricum soehingeii 在肥胖、胰島素抵抗受試者中的安全性和有效性。

在這項研究中，27名患有代謝綜合征的肥胖高加索男性被納入并分配接受soehngenii，劑量為107、109或1011個細胞/天，持續(xù)28天。

當受試者對其各自的治療劑量進行盲測時，前9名受試者必須在劑量增加到更高濃度之前成功完成最低劑量的研究方案。

受試者在家中的?20°C溫度下儲存冷凍瓶，每天解凍一個10mL瓶，與100mL牛奶混合并口服。添加牛奶以增加胃中的pH值，從而在胃腸道通過期間保護活細胞。主要結(jié)果是安全性，此外，治療4周后評估了對胰島素敏感性和脂解的影響。

使用高達1011個細胞/天的A.soehngenii治療耐受性良好，無任何嚴重不良事件。

當所有治療組合并時，A.soehngenii 的糞便豐度與改善的外周胰島素敏感性相關(guān)，并伴有膽汁酸分布的有益變化。

出乎意料的是，沒有觀察到糞便丁酸鹽水平的增加，這可以通過短鏈脂肪酸的揮發(fā)性和化驗的檢測限來解釋，這使得丁酸鹽難以測量。

A.soehngenii 豐度的增加是短暫的，大多數(shù)在停止后2周消失。給藥菌株的生存能力受到胃酸和氧氣的負面影響。

然而，如接受最高劑量的受試者糞便中的最高復(fù)制信號所示，A.soehngenii部分能夠在胃腸道中存活。通過包封和/或冷凍干燥更好地保護菌株免受酸性和含氧環(huán)境的影響，可以進一步提高生存能力（和治療效果）。

不同的管理方法和行為方式

為了進一步闡明A.soehngenii在人體中的作用模式，進行了一項隨機安慰劑對照交叉試驗，在該試驗中，直接在十二指腸中施用該菌株，從而避免胃酸并減少氧氣暴露。

由于小腸在葡萄糖增敏、調(diào)節(jié)胰島素敏感性/分泌和葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起著核心作用，因此假設(shè)十二指腸直接輸注A.soehngenii 可以進一步提高治療效果。

同樣，患有代謝綜合征（N=12）的肥胖受試者被納入并隨機接受單次鼻十二指腸輸注，輸注最高劑量的A.soehngenii（1011個細胞）或安慰劑（PBS中的10%甘油）。6小時后，進行十二指腸活檢和混合膳食試驗。

此外，受試者監(jiān)測了24小時血糖，并收集了一些糞便樣本。經(jīng)過4周的沖洗期后，受試者轉(zhuǎn)為另一個治療組，在第一次試驗中，該治療組被確定為足夠長的時間來減輕壓力。

再次，這項研究表明，A.soehngenii 的給藥安全且耐受性良好。該菌株的治療增加了促胰島素激素胰高血糖素樣肽1（GLP-1）的餐后漂移，伴隨著葡萄糖變異性的降低。

鑒于A.soehngenii 具有產(chǎn)生丁酸鹽的能力，并且在A.soehngenii處理后，糞便中的丁酸鹽水平趨于較高，GLP-1分泌增加可能是丁酸鹽激活腸L細胞上的G蛋白偶聯(lián)受體43（GPR43）的結(jié)果。

由于A.soehngenii表達膽汁酸鈉共轉(zhuǎn)運蛋白和膽汁酸水解酶，并且二級膽汁酸的血漿水平升高，GLP-1表達增加也可能是TGR5被二級膽汁酸類激活的結(jié)果。

注：TGR5是G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，TGR5不僅是膽汁酸受體，也是多種選擇性合成激動劑的受體，調(diào)節(jié)不同信號通路的衍生物。參與能量穩(wěn)態(tài)、膽汁酸平衡及葡萄糖代謝。

此外，用A.soehingeii治療導(dǎo)致十二指腸核法尼素X受體（FXR）及其靶基因OSTa的表達降低，這也可能是GLP-1可用性增加的原因。

最后，葡萄糖變異性的改善可以通過GLP-1和丁酸鹽的胰島素增敏作用來解釋。

此外，A.soehingeii改變了73個基因的十二指腸轉(zhuǎn)錄，最顯著的是誘導(dǎo)REG1B和REG1A的表達，后者編碼生成胰島衍生蛋白1A/B。

注：Reg1A和Reg1B在腸隱窩底部的Paneth細胞中強烈表達，在管腔中分泌，可能通過誘導(dǎo)祖細胞或L細胞增生局部發(fā)揮作用。

此外，發(fā)現(xiàn)REG1B的誘導(dǎo)與施用A.soehngenii后24小時GLP-1分泌增加和葡萄糖變異性降低相關(guān)。單劑量A.soehingeii 的治療不會影響微生物群的組成或多樣性，正如之前的研究中所見。

此外，糞便A.soehngenii的豐度沒有隨時間變化，排除了交叉時微生物群介導(dǎo)的遺留效應(yīng)。

學(xué)習要點和方向

第一次臨床研究的主要目的是確定安全性，并根據(jù)產(chǎn)品的耐受性確定適當?shù)膭┝糠秶头桨?。這包括確定最小有效劑量或最佳有效劑量范圍，如果可能，還包括最大安全劑量。

除給藥外，重點應(yīng)是獲取安全數(shù)據(jù)，以識別常見的產(chǎn)品相關(guān)不良事件。這些早期臨床研究通常在健康志愿者中進行，但納入患者可能更合適，例如當NGP應(yīng)糾正生物失調(diào)時。應(yīng)考慮確保研究參與者安全的風險緩解措施，如連續(xù)入組、劑量遞增和獨立數(shù)據(jù)監(jiān)測委員會的監(jiān)測。

此外，監(jiān)測易位、炎癥和感染以及確定NGP的持久性及其在最終給藥后的作用是有利的。

重要的是考慮影響微生物群功能或組成的其他混雜因素，如年齡、飲食、生活方式和環(huán)境因素。在這方面，采用安慰劑對照交叉設(shè)計的研究非常有用，因為它們可以限制這種外在和內(nèi)在混雜因素的影響，從而允許更小的樣本量。不用說，盲板非常重要，應(yīng)仔細考慮沖洗期。

越來越多地，基線微生物群組成也被納入篩選標準，例如尋找特定腸道類型中特定細菌群的存在或集群。這將導(dǎo)致更具可比性的研究組，并且當特定的菌群參與作用機制時，可以優(yōu)化干預(yù)的效果。

07監(jiān)管框架下一代益生菌

根據(jù)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織對益生菌的定義，益生菌可分為膳食補充劑和藥物，但兩者在監(jiān)管上存在著巨大的差異。同樣，含下一代益生菌的產(chǎn)品可以作為食品、膳食補充劑或藥物進入市場，具體取決于預(yù)期用途。

在歐盟，食品由歐洲食品安全局監(jiān)管，藥品由歐洲藥品管理局監(jiān)管，而在美國，食品和藥物管理局負責這兩類產(chǎn)品。當預(yù)期用途與預(yù)防、緩解或治療疾病有關(guān)時，該產(chǎn)品將被視為醫(yī)療產(chǎn)品或醫(yī)療器械。

與增強生理功能或降低疾病風險因素有關(guān)的口服攝入產(chǎn)品可被歸類為功能性食品或食品補充劑。此外，具有純美容功能的局部應(yīng)用產(chǎn)品可被評定為化妝品。為了確保法規(guī)遵從性，在臨床前研究和制造之前，必須決定縮進的用途和隨后的法規(guī)分類。

功能性食品或膳食補充劑

在歐盟，“食品” 被定義為“任何物質(zhì)或產(chǎn)品，無論是加工的、部分加工的還是未加工的，旨在或合理預(yù)期被人類攝入”。根據(jù)標簽、展示和廣告的一般要求和規(guī)定，對每一類進行了相應(yīng)的管理。

當NGP被用作食品或膳食補充劑時，它們很可能被認為是一種新型食品。然而，如果NGP經(jīng)過了基因改造，它將作為轉(zhuǎn)基因食品受到監(jiān)管。為了使NGP作為一種新型食品進入市場，它需要獲得授權(quán)并列入歐盟名單。

最重要的條件之一是NGP不會對人類健康造成風險，這必須得到科學(xué)證據(jù)的支持。這包括一項綜合風險評估，結(jié)合預(yù)期人類接觸的生物和毒理學(xué)研究，評估對人類健康的潛在風險。此外，申請應(yīng)包含NGP、制造工藝、產(chǎn)品成分、使用的分析方法、標簽和預(yù)期用途條件的詳細說明。

除安全性外，該產(chǎn)品不得促進食品鏈或環(huán)境中抗微生物耐藥性的傳播，需要對抗微生物耐藥性進行表型和基因型評估。

即使“含有益生菌/益生元”的聲明在歐盟也被視為健康聲明。為了接受健康聲明，需要對NGP進行適當?shù)拿枋?，并通過高質(zhì)量的研究證明其對健康有益的影響和因果關(guān)系。

活體生物治療產(chǎn)品

自2012年和2019年以來，F(xiàn)DA和EDQM明確了LBP的質(zhì)量要求，其中LBP被描述為含有供人類使用的活微生物的醫(yī)藥產(chǎn)品。除這些質(zhì)量要求外，目前沒有具體的LBP法規(guī)。

然而，由于LBP含有活微生物，它們被視為生物醫(yī)藥產(chǎn)品，因此必須遵守立法和監(jiān)管框架。如果沒有特定的LBP子類別，開發(fā)商將不得不依賴其他子類別生物醫(yī)藥產(chǎn)品的監(jiān)管概念。

其中一個概念是基于從臨床前和臨床研究中獲得的質(zhì)量、安全性和療效數(shù)據(jù)進行徹底的風險效益分析。

臨床前和臨床研究設(shè)計的其他相關(guān)指南包括：

國際人用藥品技術(shù)要求協(xié)調(diào)理事會(ICH)關(guān)于臨床試驗一般考慮的指南(ICHE8)；

人用藥品委員會(CHMP)關(guān)于識別和減輕試驗性藥品首次人體和早期臨床試驗風險的策略指南；

CHMP關(guān)于人類細胞基藥品的指南。

迄今為止，沒有LBP進入歐盟市場，這部分是由于缺乏明確的監(jiān)管框架。在缺乏明確指導(dǎo)方針的情況下，盡早與主管當局進行互動，以討論不確定性和減少風險的重要性。

08結(jié) 語

隨著對我們腸道微生物群的了解越來越多，將發(fā)現(xiàn)和開發(fā)越來越多的潛在下一代益生菌。本文以A.soehingeii為例，介紹了將其開發(fā)為下一代益生菌的經(jīng)驗。

重要的是，這些新菌株具有良好的特性、高質(zhì)量和安全性。對NGPs進行徹底的安全評估非常重要（雖然很復(fù)雜），特別是因為療效和毒性不一定與劑量有關(guān)。

由于這個領(lǐng)域相對稚嫩，目前還沒有具體的LBP監(jiān)管，因此在開發(fā)的早期階段與監(jiān)管機構(gòu)進行溝通有助于降低風險并澄清任何不確定性。這需要在開發(fā)初期對市場（食品或藥品）的路線有明確的看法。

在FMT干預(yù)后，A.soehingeii 這種微生物被確定為潛在的有益微生物，在臨床前的體外和體內(nèi)研究以及人類研究中都顯示出很有前景的結(jié)果。它在改善胰島素敏感性、增加GLP-1分泌和降低葡萄糖變異性方面顯示出良好的效果。

這些效應(yīng)可能通過丁酸和次生膽汁酸的產(chǎn)生介導(dǎo)。通過更好地保護菌株免受酸性和含氧環(huán)境的影響，例如通過冷凍干燥和封裝，可以潛在地提高生存能力，從而提高治療效果。

主要參考文獻：

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網(wǎng)址: 從糞便菌群移植到下一代有益菌：Anaerobutyricum http://www.u1s5d6.cn/newsview694484.html