采用UNIFI鑒定綠茶提取物中的化學(xué)成分

本文介紹了使用以超高效液相色譜(UPLC?)，四級桿飛行時間質(zhì)譜(QTof MS)以及中藥數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)的UNIFI?天然產(chǎn)物解決方案分析綠茶中化學(xué)成分的方法。方法將實驗采集、數(shù)據(jù)處理與中藥數(shù)據(jù)庫的導(dǎo)入有機(jī)結(jié)合起來, 使得復(fù)雜中藥體系中化學(xué)組分的定性工作變得簡單、有效，而且程序化，從而大大提高了工作效率，降低了對操作人員技術(shù)背景的要求。

中藥的功效已為幾千年的歷史和現(xiàn)代臨床驗證所肯定。但中藥的作用本質(zhì)、物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)理的研究尚且面臨諸多挑戰(zhàn)，其核心就是了解中藥中所含的化學(xué)成分。

所有天然產(chǎn)物的研究都要起源于成分分析，然而成分分析的研究工作長久以來一直面臨多重挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的成分分析方法復(fù)雜，耗時且低效。中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究效率低下一直是制約中藥現(xiàn)代化的瓶頸。近年來，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的興起對解決這一挑戰(zhàn)有所幫助，但未顯示出關(guān)鍵性突破。目前最常見的液質(zhì)聯(lián)用解決方案依然是對每個色譜峰逐一鑒定，通過檢索數(shù)據(jù)庫尋找可能的結(jié)構(gòu)信息，然后再查文獻(xiàn)進(jìn)一步匹配二級碎片的數(shù)據(jù)與裂解途徑，最終確定化合物的結(jié)構(gòu)。這類研究模式最大的局限性仍是耗時長、效率低，同時對操作人員的中藥及化學(xué)背景要求很高。圖1展示了UNIFI天然產(chǎn)物整體解決方案成分分析的工作流程。

綠茶作為天然飲品深受大眾的喜愛，由于其未經(jīng)過發(fā)酵過程而較多地保留了鮮葉中天然物質(zhì)，含有茶多酚、兒茶素、兒茶酚、咖啡堿、氨基酸、維生素等化學(xué)成分。這些都為綠茶中化學(xué)成分的研究提供了良好的基礎(chǔ)，因此可借此實例來闡述UNIFI天然產(chǎn)物整體解決方案，并用可得的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗證。整個工作流程從進(jìn)樣分析到報告的生成只需約2h。

圖1. UNIFI天然產(chǎn)物整體解決方案成分分析的工作流程。

實驗條件

樣品處理

取33mg綠茶提取物(Waters，No. 186006962)溶解于2 ml MeOH:H2O 1:3，稀釋至兩倍濃度備用。將兒茶素混合物標(biāo)品(Green Tea Catechin Mix)用甲醇稀釋至50μg/ml，進(jìn)樣量為1μl。

液相色譜條件

儀器：ACQUITY UPLC I-Class with FTN Sample Manger;色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3， 2.1×100 mm，1.8 μm，40oC;樣品室溫度：15 oC;流動相 A：水(0.1% 甲酸);流動相B：乙腈;梯度如表1所示。

表1.流動相梯度

時間

流速

（ml/min）

溶劑A

（%）

溶劑B

（%）

曲線

0

0.6

99

1

開始

0.5

0.6

99

1

6

16

0.6

65

35

6

18

0.6

0

100

1

20

0.6

99

1

1

質(zhì)譜條件

儀器：Xevo G2-S QTof MS;采集質(zhì)量范圍：100~1500 Da;掃描時間：0.1s;采集模式：ESI+和ESI-分辨率模式，MSE;Lock mass：亮氨酸腦啡肽(LE) 1 ppm(0.3s 掃描，間隔：15s);毛細(xì)管電壓：3 KV (ESI+)/ 2.5 KV (ESI-);錐孔電壓：100V;碰撞能量(eV)：low CE：6 /High CE：15~40;電離源溫度：120 oC;脫溶劑溫度：500 oC;錐孔氣流速：30 L/h;脫溶劑氣流速：1000 L/h;數(shù)據(jù)采集時間：20 min。

結(jié)果與討論

使用超高效液相色譜(ACQUITY UPLC I-Class)與四級桿飛行時間質(zhì)譜 (Xevo G2-S QTof)對綠茶提取物中的相關(guān)化學(xué)成分進(jìn)行分離。采用 UNIFI 天然產(chǎn)物整體工作流程結(jié)合天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，軟件初步鑒定28個組分，經(jīng)MassFragment?確證16個成分。整個工作流程從進(jìn)樣分析到報告的生成只需約2h。

UNIFI 天然產(chǎn)物整體解決方案包括ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜、Xevo G2-S QTof 四級桿飛行時間質(zhì)譜、含有UNIFI中藥數(shù)據(jù)庫的UNIFI軟件平臺。該整體解決方案提供了十四個預(yù)設(shè)的樣品分析工作模板和三個結(jié)果報告模版，從而使數(shù)據(jù)采集、處理、數(shù)據(jù)庫檢索、結(jié)構(gòu)確認(rèn)以及結(jié)果報告全部自動化。

圖2是綠茶提取物的UPLC/QTof MS 基峰離子色譜圖(BPI)。此圖顯示了采用超高效液相色譜分析復(fù)雜中藥體系的優(yōu)勢，不僅運(yùn)行時間短(有效分離時間為15 min)，且分離效率與峰容量都很高;同時四級桿飛行時間質(zhì)譜又提供了含精確質(zhì)量信息的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。除此之外，采用MSE的數(shù)據(jù)采集模式使我們能在一次進(jìn)樣的情況下可以同時獲得化合物分子量(低碰撞能量)以及與之對應(yīng)的二級碎片離子信息(高碰撞能量)。這一切都為下一步的成分分析及結(jié)構(gòu)認(rèn)定奠定了良好的基礎(chǔ)。

圖2. 綠茶提取物的UPLC/QTof MS 基峰離子色譜圖(BPI)。

天然產(chǎn)物研究瓶頸的另一個關(guān)鍵問題所在是盡管有大量的在線數(shù)據(jù)庫，但至今沒有任何與儀器分析有機(jī)結(jié)合專適用于中藥成分研究的商業(yè)數(shù)據(jù)庫。UNIFI天然產(chǎn)物解決方案首次填補(bǔ)了這一空白。我們首次提出的UNIFI中藥數(shù)據(jù)庫緊貼2010版中國藥典，列入了所有此版藥典收錄的藥材。圖3顯示了該數(shù)據(jù)庫的基本結(jié)構(gòu)及其包含的信息，包括化合物的名稱、化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子式、精確質(zhì)量以及其藥材產(chǎn)地。該數(shù)據(jù)庫還針對每個所列藥材提供了其名稱(中文、拼音及拉丁名)，文獻(xiàn)已報道的主要化合物等。此外，該數(shù)據(jù)庫還將每個所列化合物進(jìn)行了化學(xué)分類，為下一步碎片分析墊定了基礎(chǔ)。

圖3. UNIFI中藥數(shù)據(jù)庫的基本結(jié)構(gòu)及其包含的信息。

UNIFI天然產(chǎn)物解決方案將該數(shù)據(jù)庫的導(dǎo)入有機(jī)地融合進(jìn)UNIFI成分分析的工作流程之中。圖4是融合了UNIFI數(shù)據(jù)庫整體工作流程后運(yùn)行數(shù)據(jù)得到的結(jié)果。

圖4a羅列了十四個預(yù)設(shè)的樣品分析工作模板。點擊該表單的任意一項便可在右邊的4b、4c及4d中看到相應(yīng)的結(jié)果。比如點擊Component-Good Match便可以看到響應(yīng)值高于2000 counts且分子量偏差小于3ppm的被鑒定出的組分信息。其中，圖4b是已鑒定的與數(shù)據(jù)庫成分匹配的組分表。此表所列的每個化學(xué)成分均包含以下重要信息：化合物名稱、分子式、分子量、響應(yīng)強(qiáng)度、保留時間、質(zhì)量偏差、離子的檢測模式、加合離子以及鑒定狀態(tài)。圖4c是4b所顯示組分對應(yīng)的色譜圖(此處顯示的是咖啡堿);圖4d對應(yīng)于4c所示成分的MSE質(zhì)譜圖(含母離子譜圖和二級碎片譜圖)。

圖4.UNIFI軟件處理后綠茶提取物鑒定成分列表。4a：UNIFI天然產(chǎn)物的整體工作流程摸版;4b：成分分析結(jié)果，組分鑒定表;4c：每個組分對應(yīng)的譜圖(咖啡堿);4d：對應(yīng)于4c 所示成分的MSE質(zhì)譜圖。

在之前UNIFI的成分分析解決方案中，研究人員需要提取每個色譜峰，查看其質(zhì)譜圖，基于得到的精確分子量，推導(dǎo)可能的分子式。然后再根據(jù)分子式檢索在線數(shù)據(jù)庫，并且需要通過相關(guān)的二級碎片推導(dǎo)可能的裂解途徑，進(jìn)而確定結(jié)構(gòu)。現(xiàn)在，采用UNIFI天然產(chǎn)物整體解決方案，通過導(dǎo)入中藥數(shù)據(jù)庫后，數(shù)據(jù)處理及數(shù)據(jù)庫檢索可自動運(yùn)行，且鑒定結(jié)果可以自動直接顯示(圖5)并且結(jié)構(gòu)是否合理也已通過MassFragment被自動確證。

圖4d中與化合物母離子相對應(yīng)的每個二級碎片均可以通過點擊藍(lán)色的圖標(biāo)

直接看到。 此時操作人員需要做的工作只是判斷具體裂解碎片結(jié)構(gòu)是否正確.。如果其裂解合理，便可初步斷定結(jié)構(gòu)正確，從而將該化合物定義為已確認(rèn)。如果懷疑是假陽性，可進(jìn)一步利用手動鑒定功能，搜索在線數(shù)據(jù)庫并應(yīng)用MassFragment來進(jìn)一步推斷。當(dāng)然，對沒有與UNIFI數(shù)據(jù)庫匹配的組分也可如此操作而定性。最后確認(rèn)的結(jié)果可以在Component– Confirmed Table中直接顯示(圖4b), 同時也可以采用鑒定成分圖(圖5)或列表的方式顯示并生成報告。

圖5. UNIFI軟件處理后綠茶提取物鑒定成分圖。

UNIFI 天然產(chǎn)物整體解決方案中包含三個預(yù)設(shè)的報告模板，以方便研究人員直接打印相關(guān)的報告。與成分分析相關(guān)的報告模板有：天然產(chǎn)物組分信息總覽模板，天然產(chǎn)物詳細(xì)組分信息模板。被測物中組分鑒定概況的報告只需導(dǎo)入天然產(chǎn)物組分信息總攬模板便可輕易獲得,報告包括了樣品的信息、樣品的采集和后處理方法，以及相關(guān)的各種數(shù)據(jù)信息。

小結(jié)

本文以綠茶成分分析為應(yīng)用實例，系統(tǒng)介紹了UNIFI天然產(chǎn)物整體解決方案成分分析的工作流程。UPLC超高效液相色譜分離克服了傳統(tǒng)HPLC分離所固有的分離時間長、分離度有限、峰容量不高的各種缺陷。四級桿飛行時間質(zhì)譜提供了精確定性信息和足夠的動態(tài)范圍，為中藥組分的定性和定量墊定了扎實的基礎(chǔ)。UNIFI天然產(chǎn)物整體解決方案輔以中藥數(shù)據(jù)庫，并結(jié)合組分結(jié)構(gòu)的自動鑒定功能，是嶄新的中藥復(fù)雜組分分析的解決方案。UNIFI軟件平臺從采樣到數(shù)據(jù)處理，到最后打印報告可一次性完成。該方案還含有預(yù)設(shè)的工作流程模板及各種報告模板，省去研究人員再編輯的漫長過程。

所有成分分析定性工作由軟件自動進(jìn)行，這一切皆使得復(fù)雜中藥體系中化學(xué)組分的定性工作變得簡單、有效、而且程序化，從而大大提高了工作效率，降低了對操作人員技術(shù)背景的要求。所有一切都為解決中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究所面臨的挑戰(zhàn)，為中醫(yī)藥發(fā)展做出突破性貢獻(xiàn)。

相關(guān)知識

一種綠茶提取物的提取方法與流程
綠茶提取物
茶葉中有效成分的提取
“品”茶——淺談茶葉中的有機(jī)化學(xué)成分
綠茶茶渣半纖維素的提取及組成性質(zhì)研究
離子沉淀法提取綠茶中的茶多酚
綠茶茶渣中蛋白質(zhì)的提取技術(shù)研究
綠茶渣是什么意思?如何鑒定“綠茶渣”?有哪些特征?
不同處理方法茶葉提取液香氣成分分析
茶渣的價值化：成分、生物活性、提取方法和利用,Food Science & Nutrition

網(wǎng)址: 綠茶提取物中化學(xué)成分的鑒定 http://www.u1s5d6.cn/newsview728364.html