本發(fā)明屬于生物合成領(lǐng)域中的微生物發(fā)酵合成，具體涉及一種覆盆子酮的微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

1、覆盆子酮，又叫樹莓酮(raspberry ketone,rk)，化學(xué)名為4-(4-羥基苯基)-2-丁酮，主要存在于樹莓中，廣泛用于香水，化妝品中，并可以為食品和飲料增香。覆盆子酮具有良好的生物活性功能，如對脂肪肝的調(diào)節(jié)作用、保護并提高肝臟功能、保護心臟、調(diào)節(jié)血脂及減肥降脂功能、調(diào)節(jié)血糖及抗糖尿病功能、抗氧化功能、抗炎癥功能等，在醫(yī)藥領(lǐng)域也有廣闊的應(yīng)用前景。

2、覆盆子酮的生產(chǎn)主要有提取法、化學(xué)法和生物法等。提取法一般采用天然植物原料如樹莓果實，利用溶劑提取法或者輔助其他手段提取，但由于天然植物原料中覆盆子酮含量較低，使得提取產(chǎn)量低，而且提取過程復(fù)雜，導(dǎo)致天然提取的覆盆子酮價格高，不適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)?；瘜W(xué)法合成樹莓酮具有產(chǎn)量高、價格低等優(yōu)點?；瘜W(xué)合成可以采用天然原料合成，如利用天然茴香醛與天然丙酮催化羥醛縮合生產(chǎn)前體苯甲醚丙酮；隨后，苯甲醚丙酮通過鎳或鈀/碳催化加氫轉(zhuǎn)化為茴香基丙酮；最后，通過茴香基丙酮的去甲基化反應(yīng)得到樹莓酮；但是此法合成受到原料價格以及使用催化劑等因素限制。其他化學(xué)合成法如采用苯酚-丁酮醇、苯酚-甲基乙烯酮、對羥基苯甲醛-丙酮、甲氧基芐氯-乙酰乙酸乙酯等原料合成，這些化學(xué)法合成會產(chǎn)生諸如有毒化學(xué)試劑殘留、重金屬催化劑殘留、酸堿腐蝕、副產(chǎn)物難以去除、產(chǎn)品有不良氣味影響等問題，影響到化學(xué)法合成合成的覆盆子酮在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域中的應(yīng)用；另外，化學(xué)法合成造成的環(huán)境污染問題也不容忽視。

3、與化學(xué)法合成相比，利用微生物的生命活動產(chǎn)生的酶及活性物質(zhì)生產(chǎn)目標化合物的生物合成法，以其制備過程中條件溫和安全，生產(chǎn)工藝綠色環(huán)保而體現(xiàn)出特別的優(yōu)勢，已經(jīng)逐漸引起重視。生物法合成應(yīng)用于覆盆子酮的合成也受到關(guān)注。

4、覆盆子酮(樹莓酮)是苯丙氨酸的衍生物通過復(fù)雜且緊密聯(lián)系的酶和調(diào)節(jié)系統(tǒng)產(chǎn)生的。覆盆子酮通過苯丙烷途徑產(chǎn)生，該途徑的前體是芳香族氨基酸。芳香族氨基酸的生物合成始于莽草酸途徑。第一步，二羥丙酮磷酸合成酶縮合磷酸戊糖途徑衍生的赤蘚糖-4-磷酸和糖酵解途徑衍生的磷酸烯醇式丙酮酸，進一步的酶促步驟生成該途徑的最終產(chǎn)物分支酸。分支酸變位酶1隨后將分支酸轉(zhuǎn)化為預(yù)苯酸，最后預(yù)苯酸可能通過龍原酸途徑在植物中生物合成苯丙氨酸。苯丙氨酸也可能在分支酸變位酶2的作用下在細胞質(zhì)中通過苯丙酮酸途徑生成。

5、對香豆酰輔酶a是樹莓酮在植物中合成的底物之一，通過苯丙烷合成途徑生成，苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸脫氨生成肉桂酸，肉桂酸羥基化酶催化肉桂酸生成對-香豆酸，對-香豆酰輔酶a連接酶催化對-香豆酸生成對-香豆酰輔酶a。由于對香豆酸價格低廉，在合成過程中通常外源添加以提高樹莓酮的產(chǎn)量。

6、丙二酰輔酶a是樹莓酮合成的另一個底物，首先通過乙酰輔酶a羧化酶催化乙酰輔酶a生成丙二酰輔酶a。一分子的丙二酰輔酶a和一分子的對香豆酰輔酶a在苯亞甲基丙酮合酶的催化下，脫羧縮合生成苯亞甲基丙酮，最后在苯亞甲基丙酮還原酶的催化下，還原生成目標化合物樹莓酮。

7、以上是植物中合成覆盆子酮的途徑，利用微生物進行生物合成樹莓酮的方法根據(jù)此途徑及途徑中的關(guān)鍵酶，通過基因工程手段，對微生物進行基因編輯，將相關(guān)酶的基因轉(zhuǎn)入微生物中，獲得能夠表達樹莓酮合成途徑相關(guān)酶的轉(zhuǎn)基因微生物，如大腸桿菌等，再利用轉(zhuǎn)基因微生物發(fā)酵生產(chǎn)樹莓酮。

8、目前已經(jīng)公布的生物合成法，主要是采用前期研究獲得的基因工程菌的發(fā)酵法合成。例如，2022年有研究者報道通過外加簡單碳源在大腸桿菌中合成樹莓酮；報道者構(gòu)建了從葡萄糖生產(chǎn)樹莓酮的微生物平臺；通過基因工程和苯丙氨酸解氨酶優(yōu)化使葡萄糖分別產(chǎn)生19.3g/l和1.9g/l的酪氨酸和對香豆酸；產(chǎn)生對香豆酸的菌株含有質(zhì)粒以表達對香豆酸連接酶、苯甲丙酮合酶進而從葡萄糖生產(chǎn)樹莓酮；通過遺傳和化學(xué)操作增加細胞中丙二酰輔酶a的含量，提高了樹莓酮的產(chǎn)量；最后，在最佳條件下補料分批培養(yǎng)以葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)62mg/l的樹莓酮。又如，王程程等人報道在大腸桿菌(escherichia coli)w3110中引入來源于植物的對-香豆酰輔酶a連接酶、苯亞甲基丙酮合酶和苯亞甲基丙酮還原酶基因，成功構(gòu)建了重組菌株wcc-1；通過對起始誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷濃度、誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化，該菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)樹莓酮質(zhì)量濃度可達125.86mg/l；在3l發(fā)酵罐上進行補料分批發(fā)酵，樹莓酮質(zhì)量濃度提高到178.13mg/l。再如，2020年有報道在谷氨酸棒狀桿菌(corymebacterium glutamicum)中成功地構(gòu)建了從對香豆酸生產(chǎn)樹莓酮的異源途徑，產(chǎn)生的菌株積累了高達99.80mg/l的樹莓酮。

9、國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局公布的專利申請中，申請?zhí)?02011316680x(申請公布號：cn112391418a)公布了一種覆盆子酮的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)方法，采用3種微生物通過3個階段的發(fā)酵獲得覆盆子酮。第一階段采用放線菌actinomycetes sp.omk-74，以對香豆酸為主要原料發(fā)酵生產(chǎn)對羥基苯甲醛；第二階段以芽孢桿菌bacillus sp.omk-75為發(fā)酵菌種，以第一階段合成然后經(jīng)過純化的對羥基苯甲醛與丙酮為主要原料，合成4-羥基芐叉丙酮；第三階段以第二階段合成然后經(jīng)過純化的羥基芐叉丙酮為主要原料，以酵母菌saccharomycesomk-75為發(fā)酵菌種，發(fā)酵培養(yǎng)并經(jīng)過純化，得到覆盆子酮。此方法利用3個不同菌種，經(jīng)過3個階段的發(fā)酵培養(yǎng)，并經(jīng)過3次分離純化，得到最終產(chǎn)物覆盆子酮；除去種子液制備及活化時間，發(fā)酵產(chǎn)覆盆子酮的培養(yǎng)時間共約300小時即12.5天(見其具體實施方式)，其中中間產(chǎn)物需要經(jīng)過2次純化，才能夠進行后續(xù)反應(yīng)。國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局公布的另一項專利申請(專利申請?zhí)枺?018106524422，申請公布號：cn108753852a)，分別將來源于植物歐芹、掌葉大黃、覆盆子的4-香豆酰輔酶a連接酶、芐基丙酮合酶和芐基丙酮還原酶利用基因工程手段轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達，之后進行搖瓶發(fā)酵條件下獲得70.62mg/l的覆盆子酮。以上方法均實現(xiàn)了覆盆子酮的微生物發(fā)酵生產(chǎn)，但是目前微生物發(fā)酵法仍存在前期基因工程菌構(gòu)建操作復(fù)雜、原料價格高、基因工程菌的穩(wěn)定性或者長時間的發(fā)酵污染風(fēng)險等不利因素，在工業(yè)化應(yīng)用時受到限制。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種覆盆子酮的微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法，以農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢棄物為發(fā)酵培養(yǎng)基原料，采用分離自樹莓果實的天然酵母菌一步發(fā)酵法生產(chǎn)覆盆子酮，解決操作復(fù)雜、發(fā)酵周期長、原料價格高等問題。

2、本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)。一種覆盆子酮的微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，操作步驟包括，s1：發(fā)酵菌種的活化，s2：發(fā)酵種子液的制備，s3：滅菌樹莓葉提取液的制備，s4：滅菌竹筍皮提取液的制備，s5：發(fā)酵培養(yǎng)基的配制，s6：生產(chǎn)接種及覆盆子酮的發(fā)酵，s7：覆盆子酮產(chǎn)品獲得。

3、所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方，按重量份計，由如下組分組成：滅菌樹莓葉提取液250-450份，滅菌竹筍皮提取液200-450份，滅菌煙酸母液0.2-2份，滅菌蛋氨酸母液1-10份，余量由滅菌水補充至所述發(fā)酵培養(yǎng)基總重量份為1000份，混合均勻后，無菌條件下調(diào)節(jié)ph為4.5-6.5；

4、所述發(fā)酵菌種為陸生伊薩酵母(issatchenkia terricola)wjl-g4，于2019年10月21日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：cgmcc no.18712。

5、具體操作細節(jié)按如下方案進行。

6、s1：發(fā)酵菌種的活化。

7、取安瓿瓶中保存的陸生伊薩酵母(issatchenkia terricola)wjl-g4菌種，接種到y(tǒng)pd液體培養(yǎng)基中，在25-28℃、120-250rpm、裝液量為30ml的250ml的錐形瓶中培養(yǎng)24h后，梯度稀釋到10-6，吸取100μl，涂布到y(tǒng)pd固體培養(yǎng)基中25-28℃下培養(yǎng)24h，挑取單菌落接種到y(tǒng)pd斜面培養(yǎng)基，25-28℃下培養(yǎng)24-36h，得到活化菌種。

8、s2：發(fā)酵種子液的制備。

9、挑取一環(huán)s1得到的活化菌種，接種到新的ypd液體培養(yǎng)基中，在25-28℃、120-250rpm、裝液量體積比為10％-25％條件下，培養(yǎng)24h后，加入無菌玻璃珠，振蕩20min，調(diào)節(jié)菌體濃度至1.0×107-5.0×107cfu/ml，得到發(fā)酵種子液。

10、s3：滅菌樹莓葉提取液的制備。

11、所述樹莓葉為薔薇科懸鉤子屬植物樹莓的新鮮葉片，新鮮樹莓葉片采摘后，蒸餾水清洗除去表面雜質(zhì)并瀝干水分，得到清洗樹莓葉，將清洗樹莓葉速凍后保存于-15℃至-20℃，得到冷凍樹莓葉；取清洗樹莓葉或者在25-45℃解凍30min的冷凍樹莓葉，剪碎研磨，得到樹莓葉研磨漿，按照樹莓葉研磨漿與蒸餾水的重量比1:1-2加入蒸餾水后，使用破壁機打漿1-3min，得到打漿樹莓葉，向打漿樹莓葉添加纖維素酶，纖維素酶添加重量為打漿樹莓葉重量的0.01-0.05％，攪拌均勻后，在容器口蓋上一層保鮮膜，恒溫35-55℃酶解0.5-1.5h后，置于超聲波提取器中，開啟超聲波提取器進行同時酶解與提取，時間為0.2-0.5h，超聲波提取器設(shè)定條件為，輸入功率200-350w、超聲頻率20-30khz，所述同時酶解與提取完成后，迅速升溫至90℃滅酶5分鐘，接著用8層紗布過濾，濾液采用巴氏滅菌法滅菌，之后冷卻到22-28℃，得到滅菌樹莓葉提取液。

12、作為優(yōu)選，所述樹莓葉研磨漿與蒸餾水的重量比為1:1.4-1.6。

13、作為優(yōu)選，所述纖維素酶的添加重量為打漿樹莓葉重量的0.02-0.03％，酶解時間為0.8-1.2h，溫度為42-46℃。

14、作為優(yōu)選，所述同時酶解與提取時間為0.3-0.4h，超聲波提取器設(shè)定條件為輸入功率250-280w、超聲頻率為23-26khz。

15、s4：滅菌竹筍皮提取液的制備

16、所述竹筍皮為禾本科竹屬的多年生植物竹的新鮮嫩筍的鮮外皮去掉最外層與空氣直接接觸已經(jīng)纖維化的部分后得到的內(nèi)層新鮮竹筍皮，取內(nèi)層新鮮竹筍皮用蒸餾水清洗去除土壤殘渣等雜質(zhì)，瀝干表面水分，得到清洗竹筍皮，將清洗竹筍皮速凍后保存于-15至-20℃，得到冷凍竹筍皮；取清洗竹筍皮或者在25-45℃解凍30min的冷凍竹筍皮，剪碎研磨，得到竹筍皮研磨漿，按照竹筍皮研磨漿與蒸餾水的重量比1:1-2加入蒸餾水后，使用破壁機打漿1-3min，得到竹筍皮漿，向竹筍皮漿添加纖維素酶，纖維素酶添加重量為竹筍皮漿重量的0.01-0.05％，混合均勻后，在容器口蓋上一層保鮮膜，溫度恒溫在35-52℃，酶解0.5-1.5h，之后置于超聲波提取器中進行酶解同時提?。凰雒附馔瑫r提取條件為，超聲波提取器設(shè)定在輸入功率200-400w、超聲頻率在15-20khz，溫度恒溫在35-52℃，所述酶解同時提取時間為0.1-0.5h，之后，迅速升溫至90℃滅酶5分鐘，接著用8層紗布過濾，濾液采用巴氏滅菌法滅菌，之后冷卻至22-28℃，得到滅菌竹筍皮提取液。

17、作為優(yōu)選，所述竹筍皮研磨漿與蒸餾水的重量比為1:1.3-1.7。

18、作為優(yōu)選，所述纖維素酶的添加重量為竹筍皮漿重量的0.02-0.03％，酶解時間為0.8-1.2h，溫度為42-46℃。

19、作為優(yōu)選，所述酶解同時提取條件為，超聲波提取器設(shè)定在輸入功率280-300w、超聲頻率在16-17khz，溫度恒溫在42-46℃，時間為0.2-0.3h。

20、s5：發(fā)酵培養(yǎng)基的配制

21、首先配制滅菌煙酸母液和滅菌蛋氨酸母液。稱取煙酸按照煙酸:蒸餾水的重量比為1:20的比例混合，獲得煙酸母液；稱取蛋氨酸按照蛋氨酸:蒸餾水的重量比為1:20的比例混合，獲得蛋氨酸母液；將兩種母液均在121℃條件下滅菌15分鐘，分別獲得所述滅菌煙酸母液和所述滅菌蛋氨酸母液。

22、按照所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方重量份及組成比例對各個組分進行量取和混合：

23、滅菌樹莓葉提取液250-450份；

24、滅菌竹筍皮提取液200-450份；

25、滅菌煙酸母液0.2-2份；

26、滅菌蛋氨酸母液1-10份；

27、余量由滅菌水補充所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總重量份至1000份；

28、混合均勻后，無菌調(diào)節(jié)ph為4.5-6.5，得到所述的發(fā)酵培養(yǎng)基。

29、作為優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中滅菌樹莓葉提取液的重量份為300-350份。

30、作為優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中滅菌竹筍皮提取液的重量份為250-350份。

31、作為優(yōu)選，所述滅菌煙酸母液的重量份為1.0-1.2份。

32、作為優(yōu)選，所述滅菌蛋氨酸母液的重量份為5-6份。

33、作為優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph調(diào)整為5.0-6.0。

34、s6：生產(chǎn)接種及覆盆子酮的發(fā)酵。

35、取s2步驟得到的所述發(fā)酵種子液，按照所述發(fā)酵種子液與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的重量比為1-10:100的比例，進行生產(chǎn)接種，得到發(fā)酵混合液，然后進行覆盆子酮的發(fā)酵培養(yǎng)，條件為，溫度22-28℃、轉(zhuǎn)速120-250rpm，裝液量體積比20％-55％，發(fā)酵時間20-48h，獲得覆盆子酮發(fā)酵液。

36、作為優(yōu)選，所述生產(chǎn)接種步驟中所述發(fā)酵種子液與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的重量比為6-7:10。

37、作為優(yōu)選，所述覆盆子酮的發(fā)酵步驟中，發(fā)酵溫度為24-26℃、轉(zhuǎn)速160-200rpm，裝液量體積比35-40％，發(fā)酵24-46h。

38、可選的，所述覆盆子酮的發(fā)酵采用分批補料發(fā)酵方法，在接種后發(fā)酵進行到18-24h時，向所述正在發(fā)酵的發(fā)酵混合液中分別加入所述滅菌樹莓葉提取液和所述滅菌竹筍皮提取液，加入的所述滅菌樹莓葉提取液重量份為30-50份，加入的所述滅菌竹筍皮提取液重量份為20-50份。

39、作為優(yōu)選，分批補料發(fā)酵中，加入的所述滅菌樹莓葉提取液重量份為42-45份，所述滅菌竹筍皮提取液的加入重量份為30-35份。

40、s7：覆盆子酮產(chǎn)品獲得。

41、覆盆子酮的發(fā)酵步驟完成后，進行覆盆子酮的分離提取純化，此步按照公知方法進行，如利用制備型高效液相色譜法分離純化，獲得覆盆子酮產(chǎn)品。

42、本發(fā)明優(yōu)點

43、本發(fā)明充分利用農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的廢棄物如樹莓葉和竹筍皮，即有效利用資源，減少了浪費，又減少了丟棄的農(nóng)業(yè)廢棄物對環(huán)境的污染；同時發(fā)酵培養(yǎng)基成本很低，產(chǎn)出的樹莓酮具有很高的經(jīng)濟價值，達到了變廢為寶的效果。

44、本發(fā)明只需要一步發(fā)酵即可完成覆盆子酮的發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵的菌種為來自樹莓果實的天然菌株，發(fā)酵條件溫和，發(fā)酵時間短，效率高，產(chǎn)量高，發(fā)酵培養(yǎng)基綠色環(huán)保，工業(yè)化生產(chǎn)所需設(shè)備為常規(guī)發(fā)酵設(shè)備，操作簡單、可行性強。

45、生物保藏信息

46、所述陸生伊薩酵母(issatchenkia terricola)wjl-g4，于2019年10月21日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：cgmcc no.18712，建議的分類命名為：陸生伊薩酵母issatchenkia terricola，檢測結(jié)果是存活，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

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