本發(fā)明涉及醫(yī)藥、食品和保健品領域，尤其涉及一種新型柑橘橘絡提取物及其制備方法和改善腸道菌群作用的醫(yī)學用途。
背景技術：
：柑橘果膠是來源于植物細胞壁的多糖，一般可作為食品添加劑使用，有很好的膠凝、穩(wěn)定、乳化、增稠、懸浮功能，同樣的，天然柑橘果膠分子量大(5-30萬da),食用后無法被腸道吸收而不能使其在體內充分發(fā)揮作用。鑒于此，對其分子進行大小及結構的改性，具有增強生物學功能的前景。果膠改性的幾類主要方法，包括化學(ph)改性、酶改性、熱改性、輻照改性、接枝改性、交聯(lián)改性和取代改性；目前，國內外的小分子果膠提取技術,主要是利用天然柑橘果膠經過改性方法制備，包括化學(ph)改性、酶改性、熱改性、輻照改性、接枝改性、交聯(lián)改性和取代改性；這些方法進行天然果膠分子鏈斷鏈的處理,可得到分子量為2000-35000da的小分子果膠,酯化度2-30％,水解的作用一是將果膠直鏈切斷以降低分子量，二是降低酯化度，直鏈切斷的過程中采用的工藝，會導致果膠的活性降低，服用后得到的效果僅有10％左右。過去，因為小分子果膠只有歐美、日本等國家的極少數(shù)企業(yè)掌握核心生產技術，我國小分子果膠產業(yè)長期受限于國外技術壟斷，產品絕大多數(shù)以進口為主，所以迫切需要自主研發(fā)、技術領先的國產小分子果膠充實國內市場，我們完全可以充分利用我國豐富的柑橘資源，生產出優(yōu)質的小分子柑橘果膠，滿足國內日益增長的市場需求，可苦于技術的限制，使得這一市場基本被國外企業(yè)占領。申請人范曉青申請了中國發(fā)明專利(cn200610050803.3.cn200610051667.x,cn201010226113.5.cn201110028976.6)公開了低分子柑桔果膠的新用途，該低分子柑桔果膠由干柑桔皮提取果膠后采用氫氧化鈉和氫氧化鉀催化獲得低分子柑桔果膠。其采用將果膠直鏈切斷以降低分子量的方式,會導致果膠的活性降低。本發(fā)明的發(fā)明人高海峰申請的中國發(fā)明專利申請(申請?zhí)朿n201610531658.4,公開日：2016.12.07)公開了一種柑橘罐頭加工工藝中同步提取果膠及多酚的方法,分別通過不同級別的分離裝置分離出柑橘罐頭加工工藝水中的高分子果膠、低分子果膠以及多酚、單糖等物質，避免了傳統(tǒng)罐頭加工中工藝水難處理造成環(huán)境污染及物質浪費，且各個不同分子量物質的分離采用的分離提取方式也都不同，比如超濾、納濾等，不會使回收工藝太過復雜。本發(fā)明還提供了一種柑橘罐頭工藝水中提取果膠及多酚的系統(tǒng)，根據(jù)高分子果膠、低分子果膠以及多酚、單糖分子量大小不同，采用不同的膜裝置用于過濾的分離裝置，促使分離出的上述物質純度較高，系統(tǒng)中包含除鹽裝置能有效的去除工藝水中的重金屬以及鹽類，避免了這些物質對提取后的高分子果膠、低分子果膠以及酚、單糖的污染。便秘是臨床上常見的癥狀之一。隨著生活節(jié)奏的加快,人們的工作壓力越來越大,加上生活不規(guī)律與飲食結構的變化，經加工精制的低纖維食品不斷增多，導致了腸道蠕動減弱、直腸肌肉無力等，出現(xiàn)便秘。長期的便秘可使腸道細菌發(fā)酵而產生的致癌物質刺激腸黏膜上皮細胞，導致異形增生,易誘發(fā)癌變。為此，申請人申請中國發(fā)明專利申請(申請?zhí)枺?017102129097,申請h：2017-04-01)公開了一種新型柑橘橘絡提取物，該提取物包括柑橘橘絡提取高分子果膠后的萃取液經過物理分離制備的小分子果膠和柑橘黃酮，所述的提取物每100ml含小分子果膠32000mg,柑橘黃酮^400mgo本發(fā)明的柑橘橘絡提取物小分子果膠和柑橘黃酮屬于天然的復合成分對潤腸通便有很好的效果。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的是提供一種新型柑橘橘絡提取物，該柑橘橘絡提取物中小分子果膠是一種從柑橘橘絡中直接提取出的水溶性多糖，保持了果膠的活性，柑橘黃酮是從柑橘橘絡中直接分離提取出的黃酮類物質的總稱。本發(fā)明的第二個目的是提供一種上述的柑橘橘絡提取物的制備方法，本發(fā)明的第三個目的是提供上述的柑橘橘絡提取物的醫(yī)藥用途。本發(fā)明的第四個目的是提供上述的柑橘橘絡小分子果膠的醫(yī)藥用途。為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案：一種新型柑橘橘絡提取物，該提取物包括柑橘橘絡在提取高分子果膠后的萃取液經過物理分離制備的小分子果膠和柑橘黃酮，所述的提取物每100ml含小分子果膠32000mg,柑橘黃酮3400mgo作為優(yōu)選，所述的小分子果膠的摩爾質量為50000da以下。作為再優(yōu)選，所述的小分子果膠的摩爾質量為1000-50000da之間。為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案：一種制備所述的柑橘橘絡提取物的方法，該方法包括以下的步驟：1)原料的處理將柑橘橘絡原料，進入酸提罐，并加熱至40-50℃,調節(jié)ph至3.5-4.5,保溫3～5小時；2)過濾浸提后的液體，經過濾濾出殘渣,取濾液進入萃取罐,濾渣進行二次浸提；3)萃取浸提后的液體進入萃取罐,加入萃取液,進行高分子果膠萃取，萃取后的萃取液進入壓榨裝置,將得高分子果膠；4)回收萃取液萃取液經過萃取回收裝置回收,萃取液殘留部分為小分子果膠和黃酮的原料液；5)超濾i含有小分子果膠和黃酮的原料經過超濾濾出大于5萬分子量的果膠和雜質；6)超濾n選用1000分子量的超濾分離和濃縮超濾i濾后的濾液,得到小分子果膠液；7)納濾選用納濾膜分離黃酮液,將超濾n的透過濾進入納濾膜進行分離后濃縮,得柑橘黃酮液。為了實現(xiàn)上述的第三個目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案：上述的柑橘橘絡提取物用于制備潤腸通便、調節(jié)腸道菌群或改善腸道黏膜屏障功能的藥物、食品或保健品中的應用。為了實現(xiàn)上述的第四個目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案：本發(fā)明還公開了柑橘橘絡小分子果膠用于制備潤腸通便、調節(jié)腸道菌群或改善腸道黏膜屏障功能的藥物、食品或保健品中的應用，所述的柑橘橘絡小分子為果膠柑橘橘絡在提取高分子果膠后的萃取液經過物理分離制備的小分子果膠。優(yōu)選，所述的柑橘橘絡小分子果膠的摩爾質量為50000da以下，再優(yōu)選,所述的柑橘橘絡小分子果膠的摩爾質量為1000-50000da之間。本發(fā)明所述的柑橘橘絡小分子果膠的是柑橘橘絡提取物中物理分離制備的小分子果膠。其制備方法包括但不限于以下兩種方法：1、采用如中國發(fā)明專利申請(申請?zhí)枺?017102129097,申請0:2017-04-01)公開的技術方案獲得；2、采用本發(fā)明的發(fā)明人高海峰申請的中國發(fā)明專利申請(申請?zhí)朿n201610531658.4,公開0:2016.12.07)公開方法獲得。本發(fā)明柑橘橘絡小分子果膠是一種從柑橘橘絡中直接提取出的水溶性多糖，本方法制備的柑橘橘絡小分子果膠，摩爾質量在1000-50000道爾頓，獨有的世界級膜分離生產技術，很好了保持了果膠的活性。其區(qū)別于國內外市場改性小分子果膠的特性主要有:純天然、無添加、高活性，即不破壞果膠自身的化學結構活性。本發(fā)明小分子果膠來源于植物細胞壁，是一種通過at,4糖昔鍵連接起來的聚半乳糖醛酸的長鏈多糖聚合物，是一種純天然膳食纖維,不能被人體內消化液中的酶類所分解,部分可在大腸內被微生物發(fā)酵分解為短鏈脂肪酸,從而降低腸道ph值,抑制腸道有害菌生長，促進有益菌增殖，增強大腸蠕動功能。同時還可吸收本身容積2.5倍的水分，使糞便變軟而易于排出，解除便秘之憂，排毒效果快速顯著。柑橘黃酮是從柑橘橘絡中直接分離提取出的黃酮類物質的總稱，黃酮類物質具有抗氧化、抗血栓、抗腫瘤、抗菌消炎、抗病毒和排毒等多種作用，對物質代謝有調節(jié)作用。本發(fā)明的柑橘橘絡提取物小分子果膠和柑橘黃酮屬于天然的復合成分對潤腸通便有很好的效果。本發(fā)明富含小分子果膠的柑橘橘絡提取物具有較好的改善腸道黏膜屏障功能的作用，機制與增加連接蛋白表達和短鏈脂肪酸合成有關，研究還發(fā)現(xiàn)了小分子果膠具有調節(jié)腸道菌群的作用。附圖說明圖1是本柑橘橘絡小分子果膠對腸道菌群的影響試驗流程圖。圖2為以樣本相似性對默認豐度最高30個0tu信息的熱圖。圖3為門水平菌群結構變化圖。圖4為綱水平菌群結構變化圖。圖5為目水平菌群結構變化圖。圖6為科水平菌群結構變化圖。圖7為屬水平菌群結構變化圖。圖8本發(fā)明實施例1的工藝流程圖。具體實施方式實施例1如圖8示的一種制備柑橘橘絡提取物的方法，該方法包括以下的步驟：1)原料的處理柑橘橘絡經過粉碎、清洗、甩干后進入酸提罐，并加熱至40-50℃,用酸(hc1)調節(jié)ph至3.5-4.5,保溫4小時。2)過濾浸提后的液體，經過濾濾出殘渣，取濾液進入萃取罐，濾渣進行二次浸提。3)萃取浸提后的液體進入萃取罐,加入萃取液,進行高分子果膠萃取，萃取后的萃取液進入壓榨裝置,將得高分子果膠。4)回收萃取液萃取液經過萃取回收裝置回收,萃取液殘留部分為小分子果膠和黃酮的原料液。5)超濾i含有小分子果膠和黃酮的原料經過超濾濾出大于5萬分子量的果膠和雜志。6)超濾n選用1000分子量的起濾分離和濃縮超濾i濾后的濾液，得到1000-5萬的小分子果膠液。7)納濾選用納濾膜分離黃酮液,將起濾n的透過濾進入納濾膜進行分離后濃縮,得柑橘黃酮液。實施例21.1材料實施例1獲得，成品為褐色懸濁液。經過測定，每100ml含小分子果膠32000mg,柑橘黃酮(vp)3400mg,總固形物^4500mgo1.2動物與分組清潔級(ii級)昆明種雄性小白鼠150只，體重為22～25g,由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。設0.2、0.4、0.8ml/(25g·bw)(分別相當于人體推薦量的5、10、20倍)三個劑量的實驗組，同時設便秘模型對照組和陰性對照組，每組15只動物。1.3方法按照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003年版)中“通便功能檢驗方法”進行,具體方法如下：1.3.1小腸運動實驗各實驗組按0.8毫升/只經口給予受試物，陰性和模型對照組給予等量的蒸餡水，每天灌胃1次，連續(xù)7天。末次給樣的當天下午,各組動物禁食不禁水16h,次日早晨給予模型對照組和三個實驗組劑量為5mg/(kg·bw)的復方地芬諾酯溶液(常州康普藥業(yè)制藥責任公司生產，批號＝1604014)[0.2ml/(10g·bw)】，陰性對照組給予等量蒸餡水。等待30min后，三個劑量組給予含相應受試物的墨汁(取印度墨水1ml,加入49ml蒸餡水配制成2％墨汁，灌胃劑量為0.1ml/10g·bw。用墨汁與灌胃液勾兌，灌胃總量保持1ml),模型對照組和陰性對照組給予2％墨汁。給予墨汁25min后頸椎脫臼處死動物,打開腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管，置于大張白色塑料紙上，輕輕將小腸拉成直線進行測量。腸管長度為“小腸總長度”，從幽門至墨汁前沿為“墨汁推進長度”。按下列公式計算墨汁推進率(p),并進行數(shù)據(jù)轉換(x)后再統(tǒng)計分析。墨汁推進率(p)＝(墨汁推進長度/小腸總長度)x100％；x＝sinv_po1.3.2排便實驗給受試物方法同小腸運動實驗。末次給樣的當天下午,各組動物禁食不禁水16h,次日早晨給予模型對照組和三個實驗組劑量為10mg/(kg·bw)的復方地芬諾酯溶液[0.2ml/(10g·bw)】，陰性對照組給予等量蒸餡水。等待30min后，三個劑量組給予含相應受試物的洋紅溶液(取洋紅粉末lg,加入49ml蒸餡水配制成2％洋紅，灌胃劑量為0.1ml/10g·bw。用洋紅與灌胃液勾兌成混合液,灌胃總量保持1ml),模型對照組和陰性對照組給予2％洋紅，同時開始計時。從灌胃洋紅開始,觀察記錄每只動物首次排紅便所需時間、6h排便粒數(shù)并稱重。1.3.3統(tǒng)計學處理采用spss軟件進行方差分析及兩兩檢驗。2結果2.1柑橘橘絡提取物對小鼠體重的影響從表1、2結果可見，各劑量組小鼠在實驗前后的體重與陰性對照組及模型對照組比較，均無顯著性差異(p〉0.05),表明該提取物對小鼠體重增長無顯著影響。表1小鼠小腸運動實驗前后體重比較(x±s)注:表中各組間比較差異均無顯著性意義(p〉0.05)。表2小鼠排便實驗前后體重比較g+s)注:表中各組間比較差異均無顯著性意義(p〉0.05)o2.2柑橘橘絡提取物對小鼠小腸運動的影響由表3可見,便秘模型對照組小鼠的墨汁推進率顯著低于陰性對照組(p<0.05),表示便秘模型建立成功。低、中劑量組小鼠的墨汁推進率高于模型對照組(p<0.05),經數(shù)據(jù)轉換后統(tǒng)計分析,5倍、10倍劑量組與便秘模型組相比具有顯著差異(p<0.05)，其中10倍組的效果要好于5倍組,表明該提取物具有促進小鼠的小腸運動的作用。表3柑橘橘絡提取物對小鼠小腸運動的影響(x+s)注：1.ap〈o.05,表示各組墨汁推進率與便秘模型對照組比較有顯著性差異；2.bp<0.05,表示各組墨汁推進率轉換值x與便秘模型對照組比較有顯著性差異。2.3柑橘橘絡提取物對小鼠排便時間、排便頻率和排便量的影響由表4可見,便秘模型對照組的小鼠首便時間大于陰性對照組(p<0.01),而糞便的粒數(shù)小于陰性對照組(p<0.0d。各劑量組的首便時間比便秘模型對照組有所縮短，其中5倍、10倍劑量組與模型對照組相比差異有極顯著性意義(p<0.01),20倍組與模型組相比差異有顯著性意義(p<0.05)；各劑量組糞便粒數(shù)大于便秘模型對照組,其中5倍、10倍組與模型對照組差異有極顯著性意義(p<0.01),20倍組與模型組相比差異有顯著性意義(p〈0.05)；各劑量組糞便重量均大于便秘模型對照組，并有極顯著性差異(p<0.01)。以上結果表明，三個劑量組受試樣品能明顯縮短便秘小鼠的首便時間，并增加其所排便數(shù)量及重量。注：與便秘模型對照組相比，*pv0.05,**pv0.01；ap<0.05,aap<0.01；#p<0.05,##p<0.01。實施例3柑橘橘絡小分子果膠對腸道黏膜屏障功能的影響實驗老鼠分組ac組是空白對照組,健康群體；aa組是模型對照組,菌群失調患者群體；tc組是陰性對照，健康群體正常飲食；ta組是菌群失調群體但給予正常飲食；tp組是菌群失調群體給予本發(fā)明柑橘橘絡提取物中小分子果膠(杭州絡通生物科技有限公司生產)治療組；1、短鏈脂肪酸指標短鏈脂肪酸(scfa)對人體健康具有重要意義，能夠影響結腸上皮細胞的轉運，促進結腸細胞和小腸細胞的代謝、生長、分化，為腸粘膜上皮細胞及肌肉、腎、心、腦提供能量,增加腸道血供，影響肝紙質與碳水化合物的調控等。短鏈脂肪酸對于維持大腸的正常功能和結腸上皮細胞的形態(tài)和功能具有重要作用，短鏈脂肪酸還可促進鈣的吸收。主要看tp組與ta組的差異，反應的是小分子果膠對于菌群失調患者的治療作用。表5短鏈脂肪酸指標短鏈脂肪酸acaatctatp丙酸1.75±0.320.49±0.410.72±0.211.41±0.112.41土0.25*丁酸1.61±0.500.28±0.040.56±0.140.60±0.210.99土0.01*乙酸6.19±0.971.59±0.226.02±0.258.66±3.109.53±1.60異戊釀i1.30土0.63i0.27土0.21|。.54土0.36|0.70土0.23|0.69土0.05*pvo.05,tp組與ta組相比表5中tp組的丙酸、丁酸、乙酸明顯高于ta組。本發(fā)明的本柑橘橘絡小分子果膠具有較好的改善腸道黏膜屏障功能的作用，機制與增加連接蛋白表達和短鏈脂肪酸合成有關。2、血清中各項指標二胺氧化酶(dao)是人類和哺乳動物小腸粘膜上層絨毛中具有高度活性的細胞內酶，在組胺和多種多胺代謝中起作用，其活性與粘膜細胞的核酸和蛋白合成密切相關，能夠反映腸道機械屏障的完整性和受損傷程度。白介素10ul-10)是一種多細胞源、多功能的細胞因子，調節(jié)細胞的生長與分化,參與炎性反應和免疫反應，是目前公認的炎癥與免疫抑制因子。在腫瘤、感染、器官移植、造血系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,與血液、消化、尤其是心血管系統(tǒng)疾病密切相關。內毒素(lps)是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分，叫做脂多糖。脂多糖對宿主是有毒性的。內毒素只有當細菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細胞后才釋放出來，所以叫做內毒素。表6血清中各項指標血清acaatctatpdao368.88±35.20454.35±76.99316.18±39.25437.63±71.74208.74±78.90*d-la124.71±35.80227.86±57.6997.25±16.59168.51±29.9097.72±33.78*il-1043.38±8.5460.66±8.6741.25±7.6050.64±8.7032.96±9.38*tnf-a394.16±49.95642.80±74.40485.74±88.32547.15±76.33318.89±62.17*ifn-r75.47±41.29140.29±27.52116.74±16.74103.37±8.8291.55±24.01lps52.54±36.3890.98±7.9768.39±8.8172.16±13.6822.90±8.20**pv0.05.tp組與ta組相比tp組的dao、d-la、lps明顯低于ta組。表7血清炎性因子含量變化(pg/ml)tp組的il-10(白介素10).tnf-a(腫瘤壞死因子a)、ifn-r(干擾素-r)明顯低于3、組織大腸中各項指標表8組織大腸中各項指標組織-大腸*pvo.05,tp組與ta組相比tp組的dao、d-la、lps明顯低于ta組。實施例4柑橘橘絡小分子果膠對腸道菌群的影響實驗老鼠分組c：實驗開始之前的糞便，ac：灌水7天后的對照糞便，aa：灌抗生素7天后的模型組糞便，tc：對照組14天之后的糞便，ta：模型組14天之后的糞便，tp：模型組灌橘絡飲料14天后的糞便。試驗方法如圖1所示。實驗結果如下：1、如圖2所示，16s測序結果優(yōu)化處理后共得到203個物種操作單元(otu),圖2為以樣本相似性對默認豐度最高30個otu信息的熱圖，tp組0tu21,0tu25,0tu8等的豐度高于ta組。2、門水平菌群結構變化如圖3所示:小分子果膠可降低擬桿菌門、變形菌門的同時可提高厚壁菌門和防線菌門的數(shù)量(如表9所示)o表9phylumc貳tctatpbacteroidetes58.6466761.943330,09333372.3866782.2471,3proteobacteria4.67333318.5299.3633311.113334.8433334.423333firtnicutes29.4833313.976670.31.12.0666711.7366723.29333actinobacteria5.6566670：.0466670.0733331.7733330.3166670.823333verrucomicrobia1.0466674.970.0033330q.0733330.016667deferribacteres0.156667q02.650.7866670.026667unclassified0.3366670.540:000euryarchaeota000.156667000cyanobacteria0000.00666700.113333tenericutes0.003333000003、綱水平菌群結構變化如圖4所示：小分子果膠抑制gama,beta變形菌綱的數(shù)量,提高球菌,丹毒絲菌,coriobacteria菌綱的數(shù)量。4、目水平菌群結構變化如圖5所示:樣品聚類結果表明小分子果膠組菌群結構與正常對照組菌群結構相似。可以提高乳酸桿菌、雙歧桿菌,丹毒絲菌等目的數(shù)量，降低擬桿菌目的數(shù)量。5、科水平菌群結構變化如圖6所示：小分子果膠可提高綠菌科、雙岐菌科、乳酸菌科、脫硫菌科等有益菌的數(shù)量，降低脫鐵桿菌、產堿桿菌科等的數(shù)量.6、屬水平菌群結構變化如圖7所示:小分子果膠可抑制e.coli、螺旋菌、真桿菌等,同時可提高無害梭菌、脫硫桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、羅伊氏菌、毛螺菌等的豐度。上圖有統(tǒng)計學意義變化的五種菌屬。當前第1頁12

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