不孕不育 是一種非常普遍的疾病，影響著全球約7000萬人的生活。據(jù)世界衛(wèi)生組織 （WHO） 統(tǒng)計(jì)，目前全世界的育齡夫婦中約有9%在與生育問題作斗爭，其中男性因素占約50%。少、弱精癥或畸形精子癥的高發(fā)是男性不育的主要原因，男性精子質(zhì)量呈逐年下降的趨勢已經(jīng)變成一項(xiàng)世界性的問題。
2021年4月20日，清華大學(xué)藥學(xué)院 陳立功 課題組在 Cell Reports 在線發(fā)表了題為： SLC22A14 is a mitochondrial riboflavin transporter required for sperm oxidative phosphorylation and male fertility 的研究論文。該研究揭示了 SLC22A14 是作為精子細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以通過轉(zhuǎn)運(yùn)核黃素調(diào)節(jié)長鏈脂肪酸β-氧化，從而維持精子內(nèi)的能量穩(wěn)態(tài)， 其表達(dá)缺陷參與雄性不育疾病的發(fā)生。溶質(zhì)載體 （SLC） 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族是人類基因組中第二大膜蛋白家族，是細(xì)胞內(nèi)最大的一類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，可以分布在細(xì)胞內(nèi)從核膜到細(xì)胞質(zhì)膜的各種生物膜結(jié)構(gòu)上。SLC 易感位點(diǎn)已被發(fā)現(xiàn)與多種代謝性疾病有強(qiáng)烈相關(guān)性，這些疾病包括胰島素抵抗、2 型糖尿病、高血壓、慢性腎病、痛風(fēng)、哮喘、炎癥性腸病、癌癥、癡呆和焦慮癥等。
SLC22A14是在哺乳動物中進(jìn)化保守的SLC22亞家族成員，特異性地表達(dá)在雄性生殖細(xì)胞中。本研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了Slc22a14 基因敲除的小鼠，發(fā)現(xiàn)雄性純合子敲除小鼠是不育的，然而SLC22A14 的生物學(xué)功能和底物卻完全未知，其致病機(jī)制尚不清楚。作者首先利用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng) （CASA ） 和體外受精試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)了Slc22a14 敲除引發(fā)精子的運(yùn)動能力嚴(yán)重受損，致使精子無法穿透透明帶使卵母細(xì)胞受精。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Slc22a14 敲除精子ATP水平顯著降低，證實(shí)Slc22a14在某種程度上參與了精子的能量代謝。精子的運(yùn)動主要依靠鞭毛主段的擺動產(chǎn)生助推作用，而鞭毛主段富含糖酵解酶類，因此一直以來，精子尾部的糖酵解被認(rèn)為是人類和小鼠精子運(yùn)動的主要能量來源。然而，越來越多的證據(jù)表明脂肪酸代謝在精子能量生成中的重要性。SLC22A14調(diào)節(jié)精子能量代謝過程示意圖針對附睪尾部精子的代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)分析表明Slc22a14敲除的精子內(nèi)長鏈脂肪酸氧化和TCA 循環(huán)的中間代謝物顯著減少，并且發(fā)生了長鏈游離脂肪酸和甘油三酯的蓄積，而糖酵解過程發(fā)生代償性升高，但仍不能彌補(bǔ)ATP生成的不足。作者接下來采用放射性和非放射性同位素示蹤技術(shù)，檢測了碳同位素標(biāo)記的葡萄糖和脂肪酸底物在精子內(nèi)的代謝情況，同時(shí)利用能量代謝分析儀評估了精子細(xì)胞耗氧量和胞外產(chǎn)酸值的變化，最終證實(shí)Slc22a14 敲除的精子內(nèi)長鏈脂肪酸β-氧化 （FAO） 和氧化磷酸化 （OXPHOS） 途徑均存在缺陷，并且糖脂氧代謝途徑發(fā)生了重編程。作者發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸約占精子內(nèi)總脂質(zhì)含量的25%，并且多種FAO相關(guān)蛋白質(zhì)在精子內(nèi)呈高豐度表達(dá)，而盡管FAO產(chǎn)ATP的量只占正常精子ATP生成總量的30%，但它對精子的運(yùn)動和生育能力是不可或缺的。作為一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，SLC22A14的細(xì)胞內(nèi)定位是什么以及通過轉(zhuǎn)運(yùn)何種底物來發(fā)揮作用的呢？作者利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)和超高分辨率顯微成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，SLC22A14是定位于精子線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。精子是高度特化的一類細(xì)胞，無法大量體外擴(kuò)增，并且在體外存活時(shí)間短，很難分離出有活性的線粒體。因此，作者采用SLC22A14過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系作為研究模型，結(jié)合線粒體代謝組學(xué)、放射性或非放射性同位素標(biāo)記底物攝取實(shí)驗(yàn)以及核黃素缺乏的小鼠模型，鑒定出了核黃素為SLC22A14的底物之一。核黃素是FMN和FAD的前體，是FAO、TCA 循環(huán)、ETC 復(fù)合物I 和II 的輔因子。此外，作為抗氧化劑，核黃素還可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。Slc22a14基因敲除干擾核黃素進(jìn)入線粒體基質(zhì)的運(yùn)輸過程，導(dǎo)致FMN和FAD耗竭和黃素酶活性降低，從而抑制ATP的合成，誘發(fā)精子功能損傷以及雄性不育。SLC22A14位于線粒體內(nèi)膜，通過轉(zhuǎn)運(yùn)核黃素介導(dǎo)精子的長鏈脂肪酸氧化過程并影響精子的受精能力該研究首次對精子這一特殊細(xì)胞類型的能量代謝展開較為系統(tǒng)的研究，填補(bǔ)了精子能量代謝領(lǐng)域和線粒體核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究領(lǐng)域的部分空白 。一方面，作為精子特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，SLC22A14 可以潛在地應(yīng)用到以控制精子代謝為靶標(biāo)的男性避孕藥的開發(fā)；另一方面，對SLC22A14 的研究可為臨床男性不育診治提供理論依據(jù)。清華大學(xué)藥學(xué)院陳立功研究員為本文的通訊作者。藥學(xué)院已畢業(yè)博士生匡文華為本文第一作者。實(shí)驗(yàn)室成員張杰、蘭洲、馬志龍、程麗麗、趙心彬、羅琪和孟子裔，新加坡A*STAR研究所范昊研究員、中科院動物所李衛(wèi)研究員、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院紀(jì)家奎研究員等為本項(xiàng)研究工作做出了重要貢獻(xiàn)。此項(xiàng)工作得到比爾梅琳達(dá)蓋茨基金會、科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國自然基金委重大研究計(jì)劃和北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心的基金支持。 論文鏈接： https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109025

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