導(dǎo)語

轉(zhuǎn)移仍然是結(jié)直腸癌(CRC)患者死亡的主要原因。免疫微環(huán)境在CRC轉(zhuǎn)移的起始和進(jìn)展中的關(guān)鍵作用已引起廣泛關(guān)注。

背景介紹

今天小編為大家?guī)淼倪@篇文章，作者基于公共數(shù)據(jù)庫開發(fā)了一個三基因?qū)μ卣鱽眍A(yù)測CRC的預(yù)后，并在多個驗證集中實現(xiàn)了其有效性。文章發(fā)表在《Frontiers in Immunology》上，影響因子為8.786，文章題目為：A novel prognostic signatures based on metastasis- and immune-related gene pairs for colorectal cancer。

數(shù)據(jù)介紹

共有來自癌癥基因組圖譜(TCGA)的453名CRC患者被納入作為訓(xùn)練集，GSE39582、GSE17536、GSE29621、GSE71187被納入作為驗證集。

本研究技術(shù)路線如圖1所示。

圖 1

結(jié)果解析

01、鑒定差異表達(dá)的mRNA

本研究首先對TCGA-CRC公共數(shù)據(jù)庫中的612例轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)行了差異表達(dá)分析，并鑒定出7,980個差異表達(dá)基因（圖 2A）。隨后分析了CRC樣本的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因并鑒定了469個差異表達(dá)基因（圖 2B）。為了獲得免疫浸潤的程度，使用CIBERSORT和ESTIMATE算法來量化CRC組織中免疫細(xì)胞的活性或富集水平。CRC患者根據(jù)免疫評分和基質(zhì)評分分為高免疫組、中免疫組和低免疫組（圖 2C）。本研究進(jìn)一步分析了高免疫組和低免疫組之間的差異表達(dá)基因，獲得了3,177個差異表達(dá)基因（圖2D）。對上述差異表達(dá)基因進(jìn)行交集，最終鑒定出161個與CRC轉(zhuǎn)移和免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因（圖2E）。

圖 2

02、風(fēng)險模型的構(gòu)建和驗證

通過迭代循環(huán)和基于表達(dá)的0或1分配將161個差異基因轉(zhuǎn)化為基因?qū)?，然后通過單變量cox回歸篩選出35個預(yù)后基因?qū)?。隨后的LASSO回歸與多因素cox回歸分析共有三個基因?qū)Π贑ox比例風(fēng)險模型中（圖 2F-H）。

為了評估模型的有效性，本研究計算了接受者操作特征曲線在1、2和6年時的曲線下面積(AUC)，并取最佳AUC對應(yīng)的截止值作為評估患者風(fēng)險的點（圖 3A）。根據(jù)臨界值，TCGA-CRC數(shù)據(jù)集中的患者被分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，并進(jìn)行K-M分析以研究模型的預(yù)后性能。高風(fēng)險組患者的生存時間明顯短于低風(fēng)險組，表明三基因?qū)δＰ驮谟?xùn)練數(shù)據(jù)集中具有良好的預(yù)后預(yù)測效率（圖 3B）。此外，模型的預(yù)后性能通過獨立驗證集GSE17536、GSE29621、GSE39582中的K-M分析進(jìn)行了驗證,和GSE71187(圖 3C–F)。這些結(jié)果表明三基因?qū)δＰ驮谟?xùn)練集和多個獨立的驗證集上具有良好的預(yù)后預(yù)測效率。

圖 3

03、風(fēng)險模型的臨床評估

接下來，為了探索驗證集中模型與臨床特征之間的關(guān)系，使用Wilcoxon符號秩檢驗來分析風(fēng)險組與患者年齡、性別、腫瘤分期和TNM分期之間的相關(guān)性（圖 4A）。卡方檢驗結(jié)果揭示了風(fēng)險評分與轉(zhuǎn)移之間的關(guān)聯(lián)（圖 4B）。本研究發(fā)現(xiàn)基于模型的風(fēng)險評分與患者年齡（圖 4C）和性別（圖 4D）無關(guān)，而腫瘤分級（圖 4E）、T分期（圖 4F）、N期（圖 4G）和M期（圖 4B、H）與風(fēng)險顯著相關(guān)?？紤]到從數(shù)據(jù)集中識別的基因參與免疫反應(yīng)，本研究通過Spearman相關(guān)分析調(diào)查了風(fēng)險模型是否與腫瘤微環(huán)境相關(guān)（圖 5A）。與低危組相比，高危組的免疫浸潤程度明顯更高（圖5B），CD8+T細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤更多，CD4+T細(xì)胞浸潤更少（圖 5C–G）。

圖 4

此外，在分析風(fēng)險評分與癌癥靶向藥物的相關(guān)性時，本研究發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑Rucaparib、Olaparib和FH535的IC50在高危組中顯著低于低危組，提示高危人群對PARP抑制劑更敏感（圖 5H）。高風(fēng)險評分與臨床常用的順鉑、伊馬替尼和厄洛替尼的較低IC50相關(guān)（圖 5I）。

圖 5

04、CTSW和FABP4作為CRC的潛在治療靶點

在構(gòu)成風(fēng)險模型的五個基因中，本研究根據(jù)初步實驗和現(xiàn)有報告，重點關(guān)注兩個基因，CTSW和FABP4，作為CRC免疫和轉(zhuǎn)移的潛在靶點。TCGA-CRC數(shù)據(jù)按照CTSW表達(dá)量排序，前25%的高表達(dá)數(shù)據(jù)和后25%的低表達(dá)數(shù)據(jù)納入GSEA富集分析。除了豐富的免疫反應(yīng)和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)過程外，還發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因與DNA損傷和雙鏈斷裂有關(guān)（圖 6A）。本研究還通過TIMER預(yù)測了CTSW與免疫細(xì)胞的相關(guān)性，結(jié)果顯示CTSW與CD4+T、CD8+T、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞顯著相關(guān)（圖 6B）。為了通過實驗驗證本研究的生物信息學(xué)分析結(jié)果，通過CRISPR-Cas9生成了CTSW-KO HT-29和HCT-116細(xì)胞，并通過蛋白質(zhì)印跡分析驗證了敲除效率（圖 6C）。

接下來探討了EMT相關(guān)蛋白與CTSW之間的關(guān)系。與陰性對照（NC）相比，CTSW-KO細(xì)胞中N-cadherin和MMP9的表達(dá)增加，而E-cadherin則相反，這也與之前的篩選結(jié)果一致（圖6D）。Transwell測定還證實了與對照相比，CTSW-KOCRC細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)（圖 6F）。鑒于GSEA分析結(jié)果表明CTSW表達(dá)水平與CRC腫瘤內(nèi)的DNA損傷通路之間存在關(guān)聯(lián)，接下來本研究探討了CTSW與干擾素基因(STING)通路的環(huán)GMP-AMP合酶(cGAS)刺激物之間的潛在關(guān)系，結(jié)果顯示，CTSW敲除顯著降低了cGAS、p-STING、p-TBK1和p-IRF3的蛋白表達(dá)，提示CTSW在激活免疫反應(yīng)（圖 6E）。上述結(jié)果提示CTSW除免疫浸潤外與CRC轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示其在CRC發(fā)生發(fā)展中的重要作用。

圖 6

FABP4是一種與脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)運和代謝相關(guān)的脂肪酸結(jié)合蛋白。根據(jù)FABP4表達(dá)水平對TCGA-CRC樣本進(jìn)行排序，并分別取高低25%的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA分析。與CTSW的結(jié)果類似，F(xiàn)ABP4相關(guān)基因不僅與轉(zhuǎn)移和免疫反應(yīng)相關(guān)，而且與DNA雙鏈斷裂和錯配修復(fù)相關(guān)（圖 7A）。TIMER的結(jié)果還表明，F(xiàn)ABP4與CD4+T、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞密切相關(guān)（圖 7B）。隨后，通過CRISPR-cas9系統(tǒng)構(gòu)建FABP4基因敲除的CRC細(xì)胞，并通過蛋白質(zhì)印跡法驗證（圖 7C）。發(fā)現(xiàn)Ecadherin表達(dá)上調(diào)，而N-cadherin和MMP9表達(dá)在FABP4敲低的CRC細(xì)胞中下調(diào)（圖 7D）。與NC相比，F(xiàn)ABP4敲除減弱了CRC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，表明FABP4可能促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移（圖 7F）?？紤]到FABP4與DNA損傷修復(fù)相關(guān)，探索了FABP4與cGAS-STING通路之間的關(guān)聯(lián)。cGAS、p-STING、p-TBK1和p-IRF3的表達(dá)水平在FABP4-KO細(xì)胞中顯著降低（圖 7E）。引人注目的是，通過免疫組織化學(xué)檢查了來自35名CRC患者的組織微陣列樣本中的FABP4和CD8表達(dá)，表明FABP4表達(dá)升高的患者中CD8浸潤增加（圖 7G）。這些發(fā)現(xiàn)表明FABP4與免疫反應(yīng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能成為CRC的潛在治療靶點。

圖 7

小編總結(jié)

基于正常/腫瘤、高/低免疫細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移/非轉(zhuǎn)移組，本研究鑒定了161個差異表達(dá)基因。經(jīng)過隨機(jī)分配和LASSO回歸分析，構(gòu)建了一個包含3個轉(zhuǎn)移和免疫相關(guān)基因?qū)Φ念A(yù)后模型，并在訓(xùn)練集和4個獨立的 CRC隊列中表現(xiàn)出良好的預(yù)后預(yù)測效率。根據(jù)這個模型，本研究對患者進(jìn)行聚類，發(fā)現(xiàn)高危組與分期、T和M分期相關(guān)。此外，高危人群還表現(xiàn)出較高的免疫浸潤和對PARP抑制劑的高敏感性。此外，源自本模型的FABP4和CTSW被鑒定為參與CRC的轉(zhuǎn)移和免疫。本研究缺陷在于所用數(shù)據(jù)集不足，結(jié)果的應(yīng)用有限制，仍需要更多后續(xù)的實驗證明。

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