導語

轉移仍然是結直腸癌(CRC)患者死亡的主要原因。免疫微環(huán)境在CRC轉移的起始和進展中的關鍵作用已引起廣泛關注。

背景介紹

今天小編為大家?guī)淼倪@篇文章，作者基于公共數(shù)據(jù)庫開發(fā)了一個三基因對特征來預測CRC的預后，并在多個驗證集中實現(xiàn)了其有效性。文章發(fā)表在《Frontiers in Immunology》上，影響因子為8.786，文章題目為：A novel prognostic signatures based on metastasis- and immune-related gene pairs for colorectal cancer。

數(shù)據(jù)介紹

共有來自癌癥基因組圖譜(TCGA)的453名CRC患者被納入作為訓練集，GSE39582、GSE17536、GSE29621、GSE71187被納入作為驗證集。

本研究技術路線如圖1所示。

圖 1

結果解析

01、鑒定差異表達的mRNA

本研究首先對TCGA-CRC公共數(shù)據(jù)庫中的612例轉錄組分析進行了差異表達分析，并鑒定出7,980個差異表達基因（圖 2A）。隨后分析了CRC樣本的轉移相關基因并鑒定了469個差異表達基因（圖 2B）。為了獲得免疫浸潤的程度，使用CIBERSORT和ESTIMATE算法來量化CRC組織中免疫細胞的活性或富集水平。CRC患者根據(jù)免疫評分和基質評分分為高免疫組、中免疫組和低免疫組（圖 2C）。本研究進一步分析了高免疫組和低免疫組之間的差異表達基因，獲得了3,177個差異表達基因（圖2D）。對上述差異表達基因進行交集，最終鑒定出161個與CRC轉移和免疫相關的差異表達基因（圖2E）。

圖 2

02、風險模型的構建和驗證

通過迭代循環(huán)和基于表達的0或1分配將161個差異基因轉化為基因對，然后通過單變量cox回歸篩選出35個預后基因對。隨后的LASSO回歸與多因素cox回歸分析共有三個基因對包含在Cox比例風險模型中（圖 2F-H）。

為了評估模型的有效性，本研究計算了接受者操作特征曲線在1、2和6年時的曲線下面積(AUC)，并取最佳AUC對應的截止值作為評估患者風險的點（圖 3A）。根據(jù)臨界值，TCGA-CRC數(shù)據(jù)集中的患者被分為高風險組和低風險組，并進行K-M分析以研究模型的預后性能。高風險組患者的生存時間明顯短于低風險組，表明三基因對模型在訓練數(shù)據(jù)集中具有良好的預后預測效率（圖 3B）。此外，模型的預后性能通過獨立驗證集GSE17536、GSE29621、GSE39582中的K-M分析進行了驗證,和GSE71187(圖 3C–F)。這些結果表明三基因對模型在訓練集和多個獨立的驗證集上具有良好的預后預測效率。

圖 3

03、風險模型的臨床評估

接下來，為了探索驗證集中模型與臨床特征之間的關系，使用Wilcoxon符號秩檢驗來分析風險組與患者年齡、性別、腫瘤分期和TNM分期之間的相關性（圖 4A）。卡方檢驗結果揭示了風險評分與轉移之間的關聯(lián)（圖 4B）。本研究發(fā)現(xiàn)基于模型的風險評分與患者年齡（圖 4C）和性別（圖 4D）無關，而腫瘤分級（圖 4E）、T分期（圖 4F）、N期（圖 4G）和M期（圖 4B、H）與風險顯著相關。考慮到從數(shù)據(jù)集中識別的基因參與免疫反應，本研究通過Spearman相關分析調查了風險模型是否與腫瘤微環(huán)境相關（圖 5A）。與低危組相比，高危組的免疫浸潤程度明顯更高（圖5B），CD8+T細胞、腫瘤相關成纖維細胞、巨噬細胞、單核細胞浸潤更多，CD4+T細胞浸潤更少（圖 5C–G）。

圖 4

此外，在分析風險評分與癌癥靶向藥物的相關性時，本研究發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑Rucaparib、Olaparib和FH535的IC50在高危組中顯著低于低危組，提示高危人群對PARP抑制劑更敏感（圖 5H）。高風險評分與臨床常用的順鉑、伊馬替尼和厄洛替尼的較低IC50相關（圖 5I）。

圖 5

04、CTSW和FABP4作為CRC的潛在治療靶點

在構成風險模型的五個基因中，本研究根據(jù)初步實驗和現(xiàn)有報告，重點關注兩個基因，CTSW和FABP4，作為CRC免疫和轉移的潛在靶點。TCGA-CRC數(shù)據(jù)按照CTSW表達量排序，前25%的高表達數(shù)據(jù)和后25%的低表達數(shù)據(jù)納入GSEA富集分析。除了豐富的免疫反應和上皮-間質轉化(EMT)相關過程外，還發(fā)現(xiàn)差異表達基因與DNA損傷和雙鏈斷裂有關（圖 6A）。本研究還通過TIMER預測了CTSW與免疫細胞的相關性，結果顯示CTSW與CD4+T、CD8+T、巨噬細胞和樹突狀細胞顯著相關（圖 6B）。為了通過實驗驗證本研究的生物信息學分析結果，通過CRISPR-Cas9生成了CTSW-KO HT-29和HCT-116細胞，并通過蛋白質印跡分析驗證了敲除效率（圖 6C）。

接下來探討了EMT相關蛋白與CTSW之間的關系。與陰性對照（NC）相比，CTSW-KO細胞中N-cadherin和MMP9的表達增加，而E-cadherin則相反，這也與之前的篩選結果一致（圖6D）。Transwell測定還證實了與對照相比，CTSW-KOCRC細胞的遷移能力增強（圖 6F）。鑒于GSEA分析結果表明CTSW表達水平與CRC腫瘤內(nèi)的DNA損傷通路之間存在關聯(lián)，接下來本研究探討了CTSW與干擾素基因(STING)通路的環(huán)GMP-AMP合酶(cGAS)刺激物之間的潛在關系，結果顯示，CTSW敲除顯著降低了cGAS、p-STING、p-TBK1和p-IRF3的蛋白表達，提示CTSW在激活免疫反應（圖 6E）。上述結果提示CTSW除免疫浸潤外與CRC轉移相關，提示其在CRC發(fā)生發(fā)展中的重要作用。

圖 6

FABP4是一種與脂肪酸攝取、轉運和代謝相關的脂肪酸結合蛋白。根據(jù)FABP4表達水平對TCGA-CRC樣本進行排序，并分別取高低25%的轉錄組數(shù)據(jù)進行GSEA分析。與CTSW的結果類似，F(xiàn)ABP4相關基因不僅與轉移和免疫反應相關，而且與DNA雙鏈斷裂和錯配修復相關（圖 7A）。TIMER的結果還表明，F(xiàn)ABP4與CD4+T、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞密切相關（圖 7B）。隨后，通過CRISPR-cas9系統(tǒng)構建FABP4基因敲除的CRC細胞，并通過蛋白質印跡法驗證（圖 7C）。發(fā)現(xiàn)Ecadherin表達上調，而N-cadherin和MMP9表達在FABP4敲低的CRC細胞中下調（圖 7D）。與NC相比，F(xiàn)ABP4敲除減弱了CRC細胞的遷移和侵襲能力，表明FABP4可能促進CRC轉移（圖 7F）。考慮到FABP4與DNA損傷修復相關，探索了FABP4與cGAS-STING通路之間的關聯(lián)。cGAS、p-STING、p-TBK1和p-IRF3的表達水平在FABP4-KO細胞中顯著降低（圖 7E）。引人注目的是，通過免疫組織化學檢查了來自35名CRC患者的組織微陣列樣本中的FABP4和CD8表達，表明FABP4表達升高的患者中CD8浸潤增加（圖 7G）。這些發(fā)現(xiàn)表明FABP4與免疫反應和轉移密切相關，可能成為CRC的潛在治療靶點。

圖 7

小編總結

基于正常/腫瘤、高/低免疫細胞浸潤和轉移/非轉移組，本研究鑒定了161個差異表達基因。經(jīng)過隨機分配和LASSO回歸分析，構建了一個包含3個轉移和免疫相關基因對的預后模型，并在訓練集和4個獨立的 CRC隊列中表現(xiàn)出良好的預后預測效率。根據(jù)這個模型，本研究對患者進行聚類，發(fā)現(xiàn)高危組與分期、T和M分期相關。此外，高危人群還表現(xiàn)出較高的免疫浸潤和對PARP抑制劑的高敏感性。此外，源自本模型的FABP4和CTSW被鑒定為參與CRC的轉移和免疫。本研究缺陷在于所用數(shù)據(jù)集不足，結果的應用有限制，仍需要更多后續(xù)的實驗證明。

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