摘要：完整的腸道屏障是維持腸道健康的先行和必要條件。乳鐵蛋白因其具有多種生物活性而備受推崇。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外大量研究報(bào)道了乳鐵蛋白通過(guò)修復(fù)腸黏膜、調(diào)節(jié)免疫功能和腸道菌群等來(lái)維持腸道穩(wěn)態(tài)。該研究主要對(duì)乳鐵蛋白的生物學(xué)特性、乳鐵蛋白對(duì)腸屏障的作用以及乳鐵蛋白的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

腸道是人體主要的消化器官，具有雙重作用，一方面參與對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，維持機(jī)體健康，另一方面也能抵抗有害物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后造成的損傷和功能障礙[1]。腸道屏障系統(tǒng)包括腸上皮細(xì)胞和緊密連接在內(nèi)的物理屏障，以免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子為主的免疫屏障，以腸道菌群為主的生物屏障和以黏蛋白和抗菌肽為主的化學(xué)屏障。研究發(fā)現(xiàn)，由于應(yīng)激、感染和病原體入侵等引起的腸道屏障功能失調(diào)與多種疾病有關(guān)，如炎癥性腸病、腸應(yīng)激綜合癥、腹腔疾病和糖尿病等[2,3]。近年來(lái)，有逐步增多的利用乳鐵蛋白等天然產(chǎn)物達(dá)到保護(hù)腸道屏障的研究[4-6]。

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族，存在于包括乳汁、唾液和精液等生物體液中[7]，作為食源性天然產(chǎn)物，具有多種生物學(xué)活性。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)LF通過(guò)修復(fù)腸黏膜、增強(qiáng)免疫功能以及調(diào)節(jié)腸道菌群等來(lái)維護(hù)腸道健康，對(duì)腸道物理、免疫、生物和化學(xué)屏障均有一定的保護(hù)作用。因此，本文基于最新的研究成果，主要對(duì)LF的生物學(xué)特性，LF對(duì)腸道屏障的作用和機(jī)制以及LF的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

1 乳鐵蛋白的生物學(xué)特性

1.1 乳鐵蛋白的分布

LF廣泛存在于人乳和牛乳中，其中人初乳中含量高達(dá)5 g/L，牛初乳中含量為1～3 g/L。隨著泌乳時(shí)間的延長(zhǎng)，哺乳動(dòng)物合成LF的能力逐漸減弱，在成熟母乳中含量約為2～3 g/L，成熟牛乳中含量?jī)H為0.03～0.49 g/L[8]。LF在豬、馬、山羊和兔子等乳中的含量較人乳和牛乳低的多。此外，哺乳動(dòng)物的唾液、淚液、精液、血液、膽汁和滑液等體液中同樣存在LF，但其含量甚微[9]。

1.2 乳鐵蛋白的結(jié)構(gòu)

LF分子量約為80 ku，是由690個(gè)左右的氨基酸殘基組成的單一多肽鏈。目前來(lái)源于人、鼠、牛、馬、豬、山羊、綿羊、水牛和駱駝乳中的LF氨基酸序列已被報(bào)道，其中牛乳L(zhǎng)F含有703個(gè)氨基酸殘基，與人乳中的氨基酸序列具有高達(dá)69%的同源性[10]。LF的單一多肽鏈折疊成兩個(gè)基本對(duì)稱且高度同源的結(jié)構(gòu)域（N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域），每個(gè)結(jié)構(gòu)域分別包含兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，即N-1、N-2、C-1、C-2，鐵離子的結(jié)合位點(diǎn)位于每個(gè)結(jié)構(gòu)域間縫隙內(nèi)（圖1）[11]。每個(gè)LF可結(jié)合兩分子Fe3+和兩分子HCO3-或者CO32-。根據(jù)結(jié)構(gòu)上鐵結(jié)合量的不同（2個(gè)、1個(gè)或無(wú)鐵離子），LF理論上分為完全飽和型LF（holo-LF）、不完全飽和型LF（single-LF）和缺鐵型LF（apo-LF）三類，含鐵量的不同，往往會(huì)影響其三維空間結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能和熱穩(wěn)定性。

圖1 乳鐵蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖
Fig.1 Three-dimensional structure of lactoferrin

1.3 乳鐵蛋白的生物學(xué)功能

LF具有多種生理功能，如參與機(jī)體鐵代謝[12]、廣譜抗菌[13]、抗病毒[14]、抗寄生蟲活性[15]、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力[16]等。LF還能螯合易引起氧化損傷的Fe3+，發(fā)揮抗氧化作用[17]。LF對(duì)成骨同樣具有重要作用，可以防止骨質(zhì)流失，增強(qiáng)骨密度和骨強(qiáng)度[18]。此外，LF是一種具有實(shí)用價(jià)值的抗腫瘤藥物，可以作為抗腫瘤藥物治療多種腫瘤，還可以作為免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于腫瘤的輔助治療。除對(duì)腫瘤有作用外，對(duì)糖尿病、心血管疾病等代謝紊亂的疾病也有一定的預(yù)防作用[19,20]。除了以上提到的生物學(xué)功能外，有大量研究報(bào)道，LF可通過(guò)調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖和分化、顯著促進(jìn)腸道中益生菌和常駐共生菌的生長(zhǎng)等途徑促進(jìn)腸道健康[21,22]。

2 乳鐵蛋白對(duì)腸道屏障的作用

LF對(duì)腸道屏障的作用主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：通過(guò)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖、提高緊密連接蛋白的表達(dá)、改善腸道組織形態(tài)修復(fù)受損后的腸道物理屏障；通過(guò)激活腸道免疫細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌發(fā)揮對(duì)腸道免疫屏障的保護(hù)作用；通過(guò)正向調(diào)控腸道菌群的分布保護(hù)腸道生物屏障；通過(guò)增強(qiáng)黏蛋白表達(dá)以及調(diào)節(jié)抗菌肽的分泌來(lái)發(fā)揮對(duì)腸道化學(xué)屏障的保護(hù)作用。

2.1 乳鐵蛋白對(duì)腸道物理屏障的作用

如圖2所示，物理屏障受損后，LF可從以下三個(gè)方面發(fā)揮對(duì)物理屏障的保護(hù)作用，分別為①促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖；②提高緊密連接蛋白的表達(dá)，修復(fù)緊密連接；③改善腸道組織形態(tài)，提高絨毛高度和隱窩深度的比值。

圖2 受損腸道物理屏障(a)和乳鐵蛋白修復(fù)后的腸道物理屏障(b)
Fig.2 Damaged intestinal physical barrier (a) and intestinal physical barrier after lactoferrin repair (b)

2.1.1 腸道物理屏障的結(jié)構(gòu)功能

腸道物理屏障由單層柱狀上皮細(xì)胞以及上皮細(xì)胞之間的多蛋白復(fù)合物—緊密連接組成，它們位于細(xì)胞旁間隙的頂端區(qū)域，控制分子通過(guò)跨細(xì)胞和細(xì)胞旁途徑的運(yùn)輸，是腸道抵御外來(lái)污染的第一道屏障[23]。各種危害因子都會(huì)影響腸道物理屏障的維持，一旦其功能失調(diào)或“滲漏”，內(nèi)毒素和細(xì)菌等有害物質(zhì)就會(huì)滲透到血流中，對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重傷害，甚至?xí)鸺膊24]。其中，腸上皮細(xì)胞（Intestinal Epithelial Cells，IECs）在食物消化、營(yíng)養(yǎng)吸收（如離子、水、糖、肽和脂質(zhì)）、保護(hù)人體免受微生物感染等方面發(fā)揮重要作用[25]。細(xì)胞旁的空隙被緊密連接（Tight Junction，TJ）所封閉，由復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)維持[26]。TJ是調(diào)節(jié)物理屏障的關(guān)鍵，由不同的連接分子組成，如跨膜蛋白（閉合蛋白Claudin、咬合蛋白Occludin和連接黏附分子）以及細(xì)胞質(zhì)支架蛋白（閉合小環(huán)蛋白，Zonula Occludens，Zos），調(diào)節(jié)相鄰細(xì)胞中水、離子和大分子的細(xì)胞旁通透性，其功能障礙與多種局部和全身疾病有關(guān)[27]。

2.1.2 乳鐵蛋白促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖

腸上皮是人體最大的黏膜表面，覆蓋約400 m2的表面積，單層細(xì)胞組織成隱窩和絨毛。在黏液層下方，IECs形成了連續(xù)的物理屏障，保護(hù)宿主免受感染和持續(xù)暴露于潛在的炎癥刺激。Caco-2細(xì)胞源自于人結(jié)腸癌細(xì)胞系，其表現(xiàn)出許多與小腸上皮細(xì)胞相似的特性，具有微絨毛結(jié)構(gòu)、刷狀邊緣以及細(xì)胞間緊密連接等，是目前應(yīng)用最廣泛、最經(jīng)典的模型之一。研究發(fā)現(xiàn)，牛LF和人LF均能促進(jìn)體外Caco-2細(xì)胞增殖，這可能歸因于細(xì)胞凋亡的減少[28]。凋亡被發(fā)現(xiàn)與自噬密切相關(guān)，過(guò)度自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的增加。LF可通過(guò)抑制過(guò)度自噬減少黃曲霉毒素誘導(dǎo)的IECs凋亡，具體表現(xiàn)在caspase-3、caspase-9等凋亡蛋白的表達(dá)量降低[29]。此外，LF可以通過(guò)減少絲裂原活化蛋白激酶途徑介導(dǎo)的氧化應(yīng)激來(lái)減輕IECs的細(xì)胞毒性和DNA損傷[30]。Nguyen等[31]發(fā)現(xiàn)，相比于高劑量（10 g/L）的LF，低劑量（0.1～1 g/L）的LF可以更好地發(fā)揮有益作用，上調(diào)參與糖酵解、能量代謝和蛋白質(zhì)合成的丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶和丙酮酸脫氫酶的表達(dá)，促進(jìn)能量產(chǎn)生并有助于IECs增殖，這表明可能存在最佳的LF濃度。在鮮牛奶中提取純化的LF主要呈apo形式，具有高度的鐵結(jié)合能力，可以與人IECs結(jié)合并內(nèi)化[32]，且apo-LF可以激活細(xì)胞增殖的主要途徑，即ERK1/2信號(hào)通路與PI3K/Akt信號(hào)通路[33]。

2.1.3 乳鐵蛋白提高緊密連接蛋白的表達(dá)

TJ在靠近頂端表面的相鄰上皮細(xì)胞之間形成一條連續(xù)的包圍帶，使相鄰的細(xì)胞緊密貼合在一起，形成細(xì)胞間天然的物理屏障，防止微生物和其他抗原在上皮細(xì)胞旁擴(kuò)散。研究表明，腸內(nèi)補(bǔ)充LF可以上調(diào)TJ蛋白Occludin和Claudin-4的表達(dá)，降低腸道通透性，從而保持腸道完整性[34]。此外，豬LF衍生肽LFP-20降低MyD88和AKT水平，抑制NF-κB信號(hào)通路，調(diào)節(jié)脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激過(guò)程中TJ蛋白閉合小環(huán)蛋白1（Zonula Occludens 1，ZO-1）、Occludin和Claudin-1的表達(dá)，可以用作保護(hù)腸道屏障功能的預(yù)防劑[35]。在大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞IEC-6中，艱難梭菌毒素B導(dǎo)致TJ蛋白線性結(jié)構(gòu)斷裂明顯，熒光顯微鏡下可見斷續(xù)的線狀片段，少見完整的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，LF使TJ蛋白結(jié)構(gòu)恢復(fù)完整，顯微鏡下呈連續(xù)的線狀帶分布[36]。

跨上皮電阻值（Trans-Epithelial Electrical Resistance，TEER）和細(xì)胞旁通透性通常被用來(lái)量化描述TJ的變化[37]。目前這部分的研究多集中于體外Caco-2細(xì)胞模型。Hirotani等研究發(fā)現(xiàn)，400 μg/mL和1000 μg/mL的LF顯著抑制LPS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞層TEER降低與細(xì)胞單層通透性的增強(qiáng)[38]。與泌乳中期牛LF相比，泌乳早期牛LF可增加Caco-2細(xì)胞層的TEER，這也與促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）-8的減少相關(guān)[39]。Gao等[40]研究發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素M1誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞旁通透性增加，100 μg/mL的LF預(yù)處理后，顯著抑制細(xì)胞旁通透性的增加，改善腸屏障功能。

2.1.4 乳鐵蛋白改善腸道組織形態(tài)

小腸上皮是由數(shù)百萬(wàn)個(gè)隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)組成的，絨毛是腸黏膜皺襞的指狀突起，周圍有稱為隱窩的多處內(nèi)陷[41]。腸絨毛高度、隱窩深度以及兩者的比值是衡量機(jī)體消化吸收功能的重要指標(biāo)。其中絨毛高度與細(xì)胞數(shù)量呈顯著相關(guān)性，絨毛變高時(shí)，腸上皮成熟細(xì)胞數(shù)量增加，與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸和吸收面積增大，對(duì)養(yǎng)分的吸收能力增強(qiáng)。而隱窩深度的增加會(huì)減弱營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力[42]。相關(guān)研究表明，補(bǔ)充牛LF增加了小鼠空腸絨毛高度以及幾種腸刷狀緣膜酶活性的表達(dá)[28]。出生后14 d飼喂含有牛LF配方奶的仔豬，其空腸隱窩細(xì)胞顯著增殖[43]。此外，絨毛高度和隱窩深度的比值（V/C）綜合反映了小腸的功能狀態(tài)，比值下降表明黏膜受損，消化吸收能力下降。在斷奶仔豬飼糧中添加250 mg/kg和500 mg/kg LF，十二指腸、空腸和回腸的V/C顯著增加[44]。

2.2 乳鐵蛋白對(duì)腸道免疫屏障的作用

LF發(fā)揮腸道免疫屏障的保護(hù)作用離不開其對(duì)免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)（圖3），具體的作用機(jī)制如下所述。

圖3 乳鐵蛋白發(fā)揮腸道免疫屏障保護(hù)作用的機(jī)制圖
Fig.3 Mechanism diagram of lactoferrin exerting the protective effect of intestinal immune barrier

2.2.1 腸道免疫屏障的結(jié)構(gòu)功能

腸道被認(rèn)為是人體內(nèi)重要的免疫器官，腸道免疫屏障主要由腸道漿膜層免疫細(xì)胞與免疫細(xì)胞因子組成，可通過(guò)參與自然免疫和適應(yīng)性免疫來(lái)維持局部和系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)。其中，免疫細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的“看門人”，對(duì)于啟動(dòng)預(yù)防感染的保護(hù)性反應(yīng)非常重要，主要包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（Dendritic Cell，DC）、自然殺傷細(xì)胞和漿細(xì)胞等[45]。其中T淋巴細(xì)胞可分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，介導(dǎo)病原體清除[46]，CD4+T細(xì)胞因功能的不同，又可以分為Th1、Th2、Th3、Treg、Tr1、Tfh、Th17、Th9和Th22等Th細(xì)胞亞群，這些細(xì)胞具有獨(dú)特的發(fā)育和調(diào)節(jié)途徑，在免疫和免疫介導(dǎo)的病理中發(fā)揮著獨(dú)特的作用[47]。除T細(xì)胞外，B細(xì)胞同樣是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其數(shù)量可以反映黏膜體液免疫的狀態(tài)，在免疫系統(tǒng)中執(zhí)行多重功能，包括遞呈抗原，分泌抗體和各種細(xì)胞因子等[48]。此外，細(xì)胞因子被認(rèn)為在免疫系統(tǒng)中起著決定和調(diào)節(jié)作用，可以結(jié)合相應(yīng)的受體調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)或抑制炎癥反應(yīng)[49]。

2.2.2 乳鐵蛋白激活腸道免疫細(xì)胞

受LF影響的主要免疫細(xì)胞群體為T細(xì)胞、B細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞（Antigen-Presenting Cells，APC），LF與免疫細(xì)胞之間的相互作用會(huì)對(duì)Th1和Th2反應(yīng)、細(xì)胞因子微環(huán)境和體液反應(yīng)的平衡產(chǎn)生顯著影響[50]。研究發(fā)現(xiàn)，口服LF與不同小鼠小腸固有層中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和IgM+ B細(xì)胞、IgA+B細(xì)胞增加有關(guān)，而結(jié)腸中僅有CD8+T細(xì)胞顯著增加[51,52]，表明小鼠LF處理對(duì)每個(gè)區(qū)域的影響不同。Wei等[53]研究發(fā)現(xiàn)，LF基因敲除小鼠的B細(xì)胞呈現(xiàn)早期發(fā)育障礙，其早期分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)異常，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)LF缺失會(huì)加劇B細(xì)胞相關(guān)疾病的病情，相應(yīng)的補(bǔ)充LF具有減弱病癥的療效。APC，即單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、DC等，對(duì)于維持組織穩(wěn)態(tài)和對(duì)病原體的先天反應(yīng)以及將先天免疫應(yīng)答與適應(yīng)性免疫應(yīng)答聯(lián)系起來(lái)至關(guān)重要。在LF的介導(dǎo)作用下，單核細(xì)胞在分化為DC的過(guò)程中觸發(fā)耐受性程序，產(chǎn)生調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，抑制T細(xì)胞增殖，從而阻止了炎癥反應(yīng)，發(fā)揮強(qiáng)大的抗炎活性[54]。

2.2.3 乳鐵蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌

細(xì)胞因子在腸道免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，其中一部分具有抗炎作用，如IL-4和IL-10等，而另一部分則具有促炎作用，如腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）-α、IL-6、IL-8和IL-1β等，多個(gè)體內(nèi)和體外研究報(bào)告了LF對(duì)其表達(dá)的控制。TNF-α是炎癥性腸病和腸屏障功能障礙的誘發(fā)劑，已知它會(huì)引起細(xì)胞外凋亡，影響TJ結(jié)構(gòu)，改變Claudin蛋白表達(dá)和亞細(xì)胞定位。Hering等[55]利用兩種不同的體外腸道細(xì)胞模型證明了在TNF-α誘導(dǎo)的屏障功能擾亂期間，牛LF的屏障保護(hù)作用，包括恢復(fù)其TEER以及TJ蛋白的表達(dá)量。Hu等[56]研究發(fā)現(xiàn)，在豬體外IPEC-J2細(xì)胞（小腸上皮細(xì)胞）模型中，LPS處理誘導(dǎo)IL-1β、IL-8與TNF-α的分泌，降低IL-10的表達(dá)量，增加細(xì)胞通透性，并增強(qiáng)活性氧的產(chǎn)生。LF處理顯著逆轉(zhuǎn)上述趨勢(shì)，可通過(guò)減弱NF-κB/MAPK途徑維持腸道屏障完整性，緩解LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。在大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞IEC-6與人Caco-2細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)了上述現(xiàn)象[57,58]。此外有研究表明，不同濃度的LF具有不同的炎癥反應(yīng)。低劑量LF通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶促進(jìn)細(xì)胞增殖，限制IL-8分泌并阻止NF-κB和HIF1a活化，發(fā)揮抗炎作用，緩解患?jí)乃佬孕∧c結(jié)腸炎的豬的疾病程度，而高劑量LF則呈現(xiàn)相反的作用。推測(cè)可能是因?yàn)榈蛣┝縇F更有利于未成熟腸道發(fā)揮LF-LPS結(jié)合作用（LF-LPS復(fù)合物對(duì)許多病原體具有殺菌活性），并限制過(guò)量未結(jié)合的LF刺激不必要的免疫反應(yīng)[59]。

2.3 乳鐵蛋白對(duì)腸道生物屏障的作用

2.3.1 腸道生物屏障的結(jié)構(gòu)功能

微生物遍布人體，主要分布在外表面和內(nèi)表面，包括胃腸道、皮膚、唾液、口腔黏膜和結(jié)膜[60]。最近的一項(xiàng)研究估計(jì)，以年齡在20～30歲之間，體質(zhì)量70 kg，身高170 cm的人作為參考，其體內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)為3.8×1013 CFU[61]，另外絕大多數(shù)細(xì)菌居住在結(jié)腸中，估計(jì)約有1014種[62]。腸道菌群形成了一種相互依賴并與其他微生物相互作用的微生物系統(tǒng)，其生態(tài)平衡形成了生物屏障，而共生微生物群和致病微生物群之間的不平衡容易引起腸道菌群的失調(diào)，導(dǎo)致感染以及各種代謝疾病。

2.3.2 乳鐵蛋白正向調(diào)控腸道菌群的分布，保護(hù)生物屏障

LF通過(guò)破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、螯合細(xì)菌所需要的三價(jià)鐵、抑制微生物與宿主細(xì)胞的黏附和防止生物膜形成等機(jī)制具有廣泛的抗菌活性。一系列體內(nèi)和體外研究揭示LF可以正向調(diào)控腸道菌群的分布，發(fā)揮生物屏障保護(hù)作用（表1）。與喂養(yǎng)普通全脂牛奶相比，喂食含重組人LF的牛轉(zhuǎn)基因奶的仔豬其十二指腸至結(jié)腸的微生物多樣性呈增加趨勢(shì)，結(jié)腸中沙門氏菌以及整個(gè)腸道中大腸桿菌的濃度降低，回腸中的雙歧桿菌和整個(gè)腸道中的乳酸桿菌的濃度也隨著人LF的增加而增加[63]。重組豬LF具有與上述同樣的效果[64]。此外，無(wú)菌小鼠飲食牛奶中添加2%牛LF，可以顯著抑制依賴碳水化合物的腸桿菌科的增殖[65]。體外研究發(fā)現(xiàn)，牛LF，尤其是apo-LF，對(duì)體外食源性病原體的生長(zhǎng)具有抑制作用，對(duì)鼠李糖乳桿菌ATCC 7469、羅伊氏乳桿菌ATCC 23272、發(fā)酵乳桿菌ATCC 11739、棒狀乳桿菌ATCC 25602、嗜酸乳桿菌BCRC 14065、嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697、雙歧桿菌ATCC 29521和乳酸片球菌ATCC 8081等8種益生菌菌株沒(méi)有抑制作用，可能是因?yàn)橐嫔奶厥饧?xì)胞結(jié)構(gòu)或代謝物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞免受牛LF的活性影響[66,67]。LF對(duì)大腸桿菌不僅具有重要的抑制和殺菌效果，還表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗黏附作用，可以抑制大腸桿菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞和腸黏膜的黏附作用[68]。此外，即使在pH值為2.5～3.5的酸性條件下，LF仍可對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌發(fā)揮較好地殺滅作用[69]。以上提示我們LF或可作為潛在的益生元，正向調(diào)控腸道菌群的分布，為預(yù)防炎癥性腸病和腸易激綜合癥等消化道疾病提供新的思路。

表1 乳鐵蛋白對(duì)腸道生物屏障的影響
Table 1 Effect of lactoferrin on intestinal biological barrier

乳鐵蛋白(LF)類型 作用模型 影響 參考文獻(xiàn)重組人LF 7日齡新生仔豬微生物多樣性↑；沙門氏菌、大腸桿菌↓；雙歧桿菌、乳酸桿菌↑[63]重組豬LF 28日齡斷奶小母豬 沙門氏菌、大腸桿菌↓；雙歧桿菌、乳酸菌↑ [64]牛LF 無(wú)菌小鼠 抑制細(xì)菌增殖 [65]apo-LF牛LF水解物益生菌菌株食源性病原體8種益生菌菌株不受影響；抑制食源性病原體的生長(zhǎng) [66]牛LF 益生菌菌株、病原體所選益生菌不受抑制；顯著抑制病原體生長(zhǎng) [67]牛LF 人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2大腸桿菌O157:H7↓ [68]LF(來(lái)源于粗奶酪乳清) 細(xì)菌菌株 大腸桿菌↓；枯草芽孢桿菌↓ [69]

2.4 乳鐵蛋白對(duì)腸道化學(xué)屏障的作用

經(jīng)一系列體內(nèi)和體外研究證明（表2），乳鐵蛋白主要通過(guò)增強(qiáng)黏蛋白表達(dá)以及調(diào)節(jié)抗菌肽的分泌來(lái)發(fā)揮對(duì)腸道化學(xué)屏障的保護(hù)作用。

表2 乳鐵蛋白對(duì)腸道化學(xué)屏障的影響
Table 2 Effect of lactoferrin on intestinal chemical barrier

乳鐵蛋白（LF）類型 作用模型 影響 參考文獻(xiàn)牛LF 小鼠結(jié)腸炎模型 MUC2↑ [75]牛LF 新生哺乳仔豬 盲腸MUC1、MUC4↑，結(jié)腸MUC4↑ [76]LF 豬空腸上皮細(xì)胞IPEC-J2MUC1、MUC4、MUC20↑ [77]牛LF 小鼠結(jié)腸炎模型 β-防御素（HBD-2）↓ [75]LF 仔豬 抗菌肽（PMAP、Prophenin、PR-39、Protegrin-1）↑ [78]

2.4.1 腸道化學(xué)屏障的結(jié)構(gòu)功能

腸道化學(xué)屏障主要指由腸黏膜上皮細(xì)胞分泌的抗菌相關(guān)蛋白質(zhì)（如黏蛋白和抗菌肽）的黏液層，該黏液層厚且復(fù)雜，可防止腸道微生物與宿主腸上皮細(xì)胞的直接接觸[70]。其中，黏蛋白是由一種特化的腸上皮細(xì)胞-杯狀細(xì)胞分泌，覆蓋于腸道表面黏液層，促進(jìn)了腸道內(nèi)容物的清除，隔離并控制腸道微生物的入侵和定植，對(duì)維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有關(guān)鍵作用。此外，為了應(yīng)對(duì)病原菌、真菌和寄生蟲等的挑戰(zhàn)，潘氏細(xì)胞產(chǎn)生了多種抗菌蛋白，其具有廣泛不同的一級(jí)序列并能快速殺死或滅活微生物[71]。

2.4.2 乳鐵蛋白增強(qiáng)黏蛋白的表達(dá)

迄今為止，共鑒定出22種黏蛋白，主要分為兩類：分泌性黏蛋白（MUC2、MUC5AC、MUC5B和MUC6等）以及跨膜黏蛋白（MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC12和MUC17等）[72]。

黏蛋白在正常組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，一旦異常表達(dá)就會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥，甚至癌癥[73]。在小腸和大腸中，MUC2是杯狀細(xì)胞合成和分泌的主要分泌性黏蛋白。此前一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，MUC2基因敲除小鼠在四周大時(shí)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良現(xiàn)象，微生物群落的豐度比正常小鼠更為復(fù)雜，且在第178天，出現(xiàn)慢性結(jié)腸炎、增生、腺瘤和腺癌，且結(jié)腸上皮細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子顯著增加[74]。Wang等[75]用右旋糖酐硫酸鈉（DSS）構(gòu)建小鼠結(jié)腸炎模型，牛LF進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)DSS組相比，DSS與牛LF聯(lián)合處理組中MUC2顯著升高，表明牛LF可以促進(jìn)結(jié)腸黏膜的修復(fù)。此外，趙方舟[76]對(duì)新生仔豬進(jìn)行LF干預(yù)發(fā)現(xiàn)，其盲腸黏蛋白MUC1和MUC4的相對(duì)基因表達(dá)量顯著提高，結(jié)腸黏蛋白MUC4的相對(duì)基因表達(dá)量同樣出現(xiàn)了顯著提高現(xiàn)象，在一定程度上提高了腸道化學(xué)屏障的防御功能。LF同樣可以提高體外模型IPEC-J2細(xì)胞中目標(biāo)基因MUC1、MUC4和MUC20的表達(dá)量，可能是通過(guò)MEK1/2和p38信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮腸道屏障保護(hù)作用，維持腸道環(huán)境的穩(wěn)定[77]。

2.4.3 乳鐵蛋白調(diào)節(jié)抗菌肽分泌

抗菌肽具有抗菌和免疫調(diào)節(jié)特性，可保護(hù)腸道免受感染。目前關(guān)于LF影響腸道中抗菌肽分泌的報(bào)道并不多。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，β-防御素2（Human β Defensin 2，HBD-2）在細(xì)菌、TNF和LPS等刺激下，其表達(dá)量會(huì)顯著增強(qiáng)。而在結(jié)腸炎小鼠模型中，牛LF可顯著抑制HBD-2的表達(dá)[75]。王燕[78]通過(guò)體內(nèi)仔豬飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LF可以提高抗菌肽（PMAP、Prophenin、PR-39和Protegrin-1）基因的表達(dá)，發(fā)揮屏障保護(hù)作用，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)了上述結(jié)果。

3 乳鐵蛋白的應(yīng)用

腸道是一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境，暴露于多種飲食成分。當(dāng)前，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到飲食成分在基本營(yíng)養(yǎng)之外發(fā)揮的各種有益作用，這也導(dǎo)致了功能性食品概念的發(fā)展。LF是最具特征的多功能生物活性蛋白，鑒于其對(duì)腸道健康和宿主的整體福祉產(chǎn)生的有益影響，已經(jīng)在以下幾個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

3.1 嬰兒配方奶粉

母乳被公認(rèn)為是嬰兒的最佳營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，但是全世界仍有大部分嬰兒接受部分或全部嬰兒配方奶粉的喂養(yǎng)，對(duì)于無(wú)法母乳喂養(yǎng)的嬰兒，進(jìn)一步改善嬰兒配方奶粉的成分就顯得格外重要。同時(shí)，因母乳中LF含量明顯高于牛乳，所以刺激了在以牛乳為基礎(chǔ)的嬰兒配方奶粉中添加牛LF的趨勢(shì)。

LF對(duì)嬰幼兒的健康益處被廣泛熟知。一項(xiàng)前瞻性研究顯示，在中國(guó)四川省成都市6家婦幼保健院隨機(jī)選取260名4～6個(gè)月的嬰兒（前期為純母乳喂養(yǎng)），分別喂養(yǎng)含牛LF的強(qiáng)化配方奶粉和不含牛LF的強(qiáng)化奶粉。結(jié)果顯示，在純母乳喂養(yǎng)的嬰兒中，攝入含牛LF的強(qiáng)化乳與更高的全身鐵含量和更有效的腸道鐵吸收有關(guān)[79]。同時(shí)，六項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)證明，LF對(duì)極低出生體重嬰兒的壞死性小腸結(jié)腸炎II期或III期和遲發(fā)性敗血癥具有有益作用[80]。

LF在1939年首次分離得到，而第一款銷售的含牛LF的嬰兒配方奶粉可追溯到1986年[81]。2013年起實(shí)施的，中國(guó)國(guó)標(biāo)GB 14880-2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》已將LF列為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，允許其添加在嬰兒配方奶粉中，添加量應(yīng)小于1.0 g/kg。遺憾的是，因LF分離純化的難度以及價(jià)格高昂，中國(guó)近幾年才開始逐漸在嬰兒配方奶粉中添加LF。但隨著市場(chǎng)的發(fā)展，相信LF的添加技術(shù)會(huì)越來(lái)越成熟。

3.2 食品添加劑

來(lái)自牛乳的LF為人類所使用的主要LF，已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）指定為公認(rèn)安全的食品添加劑。作為天然抗菌劑，LF可抑制食源性病原菌的生長(zhǎng)，如腸出血性大腸埃希氏菌（O157:H7）[82]、沙門氏菌[83]、志賀氏菌等[84]；作為保鮮劑，LF質(zhì)量濃度超過(guò)3 mg/mL會(huì)令冷鮮肉表面呈現(xiàn)為亮紅狀態(tài)，提高其色澤及感官效果，其原因在于LF可以抑制氧合肌紅蛋白的氧化速度，保護(hù)高鐵肌紅蛋白的還原系統(tǒng)，抑制丙二醛和硫代巴比妥酸的生成[85]；作為乳化劑，LF與多酚生成的共價(jià)復(fù)合物可以提高β-胡蘿卜素乳狀液的穩(wěn)定性[86]；作為防腐劑，LF已被FDA批準(zhǔn)用于新鮮肉類，可以有效防止微生物的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)貨架保質(zhì)期[87]。

3.3 飼料添加劑

目前，傳統(tǒng)抗生素在養(yǎng)殖業(yè)濫用造成的藥物殘留等問(wèn)題已成為困擾全世界的難題。而LF因其強(qiáng)大的生物活性，被認(rèn)為是一種極具開發(fā)潛力的綠色飼料添加劑。作為飼料添加劑，LF的優(yōu)點(diǎn)主要包括以下幾點(diǎn)：（1）耐熱性良好，加工過(guò)程不易變性。牛LF的熱變性溫度為70 ℃，且加熱后，其熱穩(wěn)定性高于山羊LF[88]。（2）提高飼養(yǎng)動(dòng)物免疫力與身體機(jī)能。研究表明，市售的牛LF可作為有益的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，支持健康羔羊的免疫系統(tǒng)，提高雛雞的生產(chǎn)性能[89,90]。（3）增強(qiáng)飼養(yǎng)動(dòng)物抗病能力。與其它的天然蛋白質(zhì)和肽相比，牛LF對(duì)于牛病毒性腹瀉的療效最高，且在病毒感染的早期和整個(gè)過(guò)程中都有效[91]。這也給相關(guān)企業(yè)和技術(shù)人員以啟示，如果能將LF廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼養(yǎng)中，其帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)效益和市場(chǎng)價(jià)值將不容小覷。

4 結(jié)語(yǔ)

腸道是人體消化吸收的主要場(chǎng)所，每天攝入食物的99%靠腸道吸收。因此，一個(gè)完整的腸道屏障對(duì)腸道健康具有舉足輕重的作用。腸道屏障功能出現(xiàn)異常會(huì)使不該進(jìn)入體內(nèi)的物質(zhì)（如病原菌和毒素等）入侵，造成消化吸收功能紊亂，腸道內(nèi)細(xì)菌、內(nèi)毒素易位，促進(jìn)感染發(fā)生，引發(fā)各種疾病。LF作為一種多功能生物活性蛋白，對(duì)保護(hù)腸道物理屏障、免疫屏障、生物屏障和化學(xué)屏障具有顯著的效果。本文主要對(duì)乳鐵蛋白作用于單獨(dú)腸道屏障的作用進(jìn)行了綜述，但隨著研究的進(jìn)一步深入，不少研究者逐漸認(rèn)識(shí)到，腸道四種屏障并不是單純獨(dú)立地存在于腸道中，而是互相影響，協(xié)同參與宿主免疫反應(yīng)。目前關(guān)于LF對(duì)四種屏障發(fā)揮協(xié)同作用的相關(guān)研究還比較匱乏，這也提示我們未來(lái)或許需要更多的基礎(chǔ)研究和臨床研究來(lái)揭示此部分的作用機(jī)制。相信在LF活性功能的不斷闡明以及生產(chǎn)純化工藝逐漸成熟的背景下，LF將會(huì)進(jìn)一步造福于食品加工業(yè)和畜牧業(yè)發(fā)展。

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