1.本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物制劑或口腔保健品技術(shù)領域，具體而言，涉及一種益生菌與茶多酚復配的組合物、制劑及其應用。

背景技術(shù)：

2.口腔疾病的發(fā)生與口腔致病菌的粘附定殖以及生物膜的形成密切關聯(lián)。尤其是致病菌形成的生物膜，對外界環(huán)境有很強的適應性?？谇恢虏【粌H能夠引起口腔微生態(tài)失衡，從而誘發(fā)口腔疾病，也是阿爾茨海默癥、肺炎、腫瘤和糖尿病等疾病誘發(fā)因素之一。伴放線放線桿菌是一種具有高致病潛力的革蘭氏陰性口腔致病細菌，易在口腔中滋生定殖形成結(jié)構(gòu)復雜的牙菌斑生物膜，引發(fā)牙周病。另外，伴放線放線桿菌能夠分泌合成多種高毒力因子，引起牙周炎的發(fā)生和發(fā)展，進而造成牙齦出血，牙齒松動、口臭等癥狀。有研究報道，伴放線放線桿菌與胃癌、白血癥等病癥也有一定相關性。
3.近年來，運用益生菌預防和治療口腔疾病受到越來越多的關注。相比于傳統(tǒng)的機械療法及藥物療法，益生菌能夠起到調(diào)節(jié)口腔微生態(tài)平衡、抑制生物膜以及破壞致病菌毒力等作用。益生菌改善口腔健康主要是通過與口腔致病菌競爭結(jié)合位點，阻礙致病菌的定殖，從而使致病菌從口腔中排出。益生菌產(chǎn)生的代謝物質(zhì)，如有機酸、細菌素等，能夠有效抑制致病菌的生長以及生物膜的形成。有研究表明將益生菌進行滅活處理后仍可對機體發(fā)揮相應的功效，且效果優(yōu)于活菌。副干酪乳桿菌是口腔微生物群中最常見的乳桿菌，其滅活菌粉能與口腔致病菌產(chǎn)生凝聚沉淀。有研究同時表明益生菌與致病菌共凝聚能力與益生菌的疏水性有很大關系，可能是因為菌體表層蛋白影響了菌體表面性質(zhì)。然而，益生菌滅活菌粉對口腔致病菌的共凝聚機理目前尚不清楚。
4.茶多酚作為綠色無污染的天然抑菌劑在食品中應用廣泛。茶多酚能夠抑制口腔致病菌生物膜的形成，通過破壞細菌膜和細菌壁、抑制核酸合成等方式殺死致病菌，而且能夠抑制致病菌產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物及促炎相關基因表達?，F(xiàn)有研究表明茶多酚對口腔致病菌有抑制作用，目前已經(jīng)廣泛用于牙膏產(chǎn)品中。
5.目前研究表明，雖然益生菌與茶多酚均是目前市場上防治口腔疾病的常用活性成分，然而，將茶多酚與益生菌復配使用對抑制口腔致病菌的協(xié)同抑菌機理研究目前未見報道。由于口腔疾病的發(fā)展具有長期性、緩慢性的特點，目前市場上對于口腔疾病的預防或治療尚未開發(fā)出十分安全、有效的藥品或口腔保健品。與此同時，市場上用于防治口腔疾病的藥品或口腔保健品普遍存在抑菌效果不佳、抑菌機理不明確的問題。因此，針對上述缺陷，亟需開發(fā)一種抑菌效果更好、機理明確的預防和/或治療口腔疾病的藥品或口腔保健品，這對口腔疾病的防治具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

6.本發(fā)明的主要目的在于提供了一種益生菌與茶多酚復配的組合物、制劑及其應用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的常見的防治口腔疾病的藥品或口腔保健品存在抑菌效果不佳、抑
菌機理不明確的問題。
7.為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的目的之一是提供一種益生菌與茶多酚復配的組合物，該組合物包括：益生菌、茶多酚。
8.進一步地，該組合物由下列重量份的原料組成：益生菌1～100份、茶多酚1～100份。
9.進一步地，該組合物由下列重量份的原料組成：益生菌1～50份、茶多酚1～50份。
10.進一步地，該組合物由下列重量份的原料組成：益生菌1～10份、茶多酚1～10份。
11.進一步地，該組合物由下列重量份的原料組成：益生菌4～8份、茶多酚1～6份。
12.進一步地，該組合物由下列重量份的原料組成：益生菌8份、茶多酚1份；或，所述組合物按下列重量份的原料組成：益生菌4份、茶多酚1份；或，所述組合物按下列重量份的原料組成：益生菌2份、茶多酚1份；或，所述組合物按下列重量份的原料組成：益生菌4份、茶多酚3份。
13.進一步地，所述益生菌與茶多酚復配的組合物中，所述益生菌為酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳桿菌、雙歧桿菌或放線菌中的一種或幾種。
14.進一步地，所述益生菌與茶多酚復配的組合物中，所述益生菌為乳桿菌。
15.進一步地，所述益生菌與茶多酚復配的組合物中，所述益生菌為副干酪乳桿菌。
16.進一步地，所述益生菌與茶多酚復配的組合物中，所述益生菌的濃度為0.001g/ml～0.05g/ml。
17.進一步地，所述益生菌與茶多酚復配的組合物中，所述益生菌的濃度為0.01g/ml～0.03g/ml。
18.進一步地，所述益生菌與茶多酚復配的組合物中，所述益生菌的濃度為0.01g/ml。
19.進一步地，所述益生菌與茶多酚復配的組合物中，所述茶多酚的濃度為0.001g/ml～0.05g/ml。
20.進一步地，所述益生菌與茶多酚復配的組合物中，所述茶多酚的濃度為0.001g/ml～0.01g/ml。
21.進一步地，所述益生菌與茶多酚復配的組合物中，所述茶多酚的濃度為0.0025g/ml。
22.進一步地，所述益生菌與茶多酚復配的組合物中，益生菌與茶多酚的重量比為1:1～8:1，優(yōu)選地，所述益生菌與茶多酚的重量比為4:3～8:1，優(yōu)選地，益生菌與茶多酚的重量比為8:1。
23.根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種益生菌與茶多酚復配的制劑，該制劑是制備牙膏、漱口水、消毒液、口腔噴霧或含片。
24.進一步地，所述益生菌與茶多酚復配的制劑中，所述制劑為牙膏。
25.根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種益生菌與茶多酚復配的口腔保健品，所述口腔保健品是制備牙膏、漱口水、消毒液、口腔噴霧或含片。
26.進一步地，所述益生菌與茶多酚復配的口腔保健品中，所述口腔保健品為牙膏。
27.根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種上述組合物在制備用于預防和/或治療口腔疾病的制劑或口腔保健品中的用途。
28.進一步地，所述口腔疾病為牙周炎、齲齒、牙石、牙菌斑、牙齦出血、牙齒松動、牙本
質(zhì)敏感、牙齒不潔白或口臭中的一種或幾種。
29.根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種益生菌與茶多酚復配的組合物在制備抑菌的制劑或口腔保健品中的應用。
30.進一步地，所述抑菌為抑制伴放線放線桿菌、變異鏈球菌和具核梭桿菌中的一種或多種。
31.進一步地，所述抑菌是通過共凝聚和/或殺菌作用。
32.本發(fā)明建立了可量化的益生菌和茶多酚復配模型，確定了其對口腔致病菌的抑菌機理及其在牙膏中的功效作用。通過實驗確立益生菌與茶多酚的最佳配比，運用掃描電鏡(sem)、原子力顯微鏡(afm)、傅里葉紅外光譜(ft-ir)、表面電荷分析等多種材料學和生物化學分析手段進行生物膜抑制量等特性指標測定、菌體形態(tài)觀察、細菌表面成分及粗糙度分析，探究益生菌和茶多酚對伴放線放線桿菌的協(xié)同抑菌機理。實驗結(jié)果表明，益生菌與茶多酚的最佳配比為2:1，對致病菌生物膜的抑制率提高至71.7％，復配模型通過共凝聚和殺菌雙重作用抑制伴放線放線桿菌的生長。比對益生菌、茶多酚單獨添加以及益生菌和茶多酚復配抑菌模型在牙膏中對三種常見致病菌(伴放線放線桿菌、變異鏈球菌和具核梭桿菌)的抑菌作用結(jié)果的差異性，為益生菌干粉復配茶多酚抑菌模型在牙膏等口腔清潔護理用品中的應用，提供充分的理論依據(jù)與運用技術(shù)的支撐。綜上，本發(fā)明闡明了益生菌與茶多酚的協(xié)同抑菌機理，驗證了益生菌和茶多酚復配抑菌模型在牙膏中的抑菌作用。
33.與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明組合物有益的技術(shù)效果如下：
34.1、本發(fā)明代表性選用的副干酪乳桿菌能夠與伴放線放線桿菌產(chǎn)生共凝聚作用，減少致病菌在口腔中的定殖。當與茶多酚協(xié)同作用時，不僅能夠與致病菌產(chǎn)生共凝聚作用，還能夠起到殺滅致病菌的作用。同時建立益生菌與茶多酚協(xié)同抑菌模型，大大提升了對致病菌生物膜形成的抑制作用。
35.2、研究益生菌與茶多酚對伴放線放線桿菌的抑菌機理。本發(fā)明通過運用多種材料學和生物化學手段，可量化地觀測益生菌和致病菌的表面形態(tài)、化學組分和表面粗糙度，多維度分究并闡明了益生菌與茶多酚對伴放線放線桿菌的抑菌機理。
36.3、將研究建立的益生菌與茶多酚復配抑菌模型運用在牙膏中，同時與單獨添加益生菌或茶多酚的牙膏比對，益生菌與茶多酚復配抑菌模型對口腔常見的三株致病菌(伴放線放線桿菌、變異鏈球菌和具核梭桿菌)的抑菌作用增強。由此可見，益生菌協(xié)同茶多酚具有顯著的口腔益生特性，在口腔清潔護理用品方面有廣大應用前景。
附圖說明
37.為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
38.圖1為益生菌作用后伴放線放線桿菌的降低量(不同的小寫字母表示數(shù)據(jù)之間具有顯著差異性，p《0.05)。
39.圖2為不同益生菌添加量下伴放線放線桿菌降低量(不同的小寫字母表示數(shù)據(jù)之間具有顯著差異性，p《0.05)。
40.圖3為益生菌與茶多酚不同配比處理后伴放線放線桿菌的降低量(不同的小寫字母表示數(shù)據(jù)之間具有顯著差異性，p《0.05)。
41.圖4為不同處理下伴放線放線桿菌生物膜抑制率(不同的小寫字母表示數(shù)據(jù)之間具有顯著差異性，p《0.05)。
42.圖5為掃描電鏡圖(a，伴放線放線桿菌；b，益生菌；c，益生菌+伴放線放線桿菌；d，茶多酚+伴放線放線桿菌；e，益生菌：茶多酚(2:1)+伴放線放線桿菌)。
43.圖6為不同菌體的傅里葉近紅外光譜圖(a，益生菌；b，致病菌；c，益生菌和致病菌共凝聚；d，茶多酚和致病菌共凝聚)
44.圖7為菌體的2d原子力顯微鏡光學圖片(a,致病菌；b，益生菌)和3d粗糙度輪廓圖(c,致病菌；d，益生菌)。
45.圖8為益生菌和茶多酚的協(xié)同抑菌機理示意圖。
具體實施方式
46.下面將結(jié)合本技術(shù)實施例，對本技術(shù)實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本技術(shù)一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本技術(shù)中的實施例，本領域技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本技術(shù)保護的范圍。
47.需要說明的是，在不沖突的情況下，本技術(shù)中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將結(jié)合實施例來詳細說明本發(fā)明。
48.以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述，這些實施例不能理解為限制本技術(shù)所要求保護的范圍。
49.試劑與儀器：
50.選用現(xiàn)牙膏中常用的兩款益生菌：副干酪乳桿菌干粉、復合益生菌干粉；血平板和0.5％結(jié)晶紫染色液購于常德比克曼生物科技有限公司，2.5l厭氧罐c-31、二氧化碳產(chǎn)氣袋c-3和厭氧產(chǎn)氣袋購于上海創(chuàng)凌生物科技有限公司；baclight
tm
細菌活性檢測試劑盒7012購于陜西捷科達科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(ph7.2-7.4)、2.5％戊二醛固定液(分析純)、氯化鈉(分析純)、茶多酚(95％)購于國藥集團化學試劑有限公司，牙膏樣品由蘇州市金茂日化學品有限公司提供。
51.菌液制備：本試驗中選用的伴放線放線桿菌atcc 29523購自廣東省科學院微生物研究所，使用血平板培養(yǎng)基(tsa+5％脫纖維蛋白羊血)進行培養(yǎng)，在37℃、5％co2環(huán)境下培養(yǎng)48h，用磷酸緩沖鹽液(pbs，ph 7.2-7.4)調(diào)節(jié)菌體濃度至1
×
109cfu/ml備用。
52.主要儀器設備如表1所示：
53.表1主要儀器
[0054][0055]
數(shù)據(jù)分析：試驗中，使用spss 18.0軟件以5％的顯著性水平對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)表達形式為平均值
±
標準偏差，所有試驗均設置3個重復試驗。
[0056]
實施例1確定益生菌最佳有效添加量
[0057]
通過測定兩種益生菌干粉產(chǎn)品的抑菌性能，以選取抑菌效果勝出的益生菌。采用lv等(xin,lv.,pan,hu.,ying dang.,etc.purification and partial characterization of a novel bacteriocin produced by lactobacillus casei tn-2isolated from fermented camel milk(shubat)of xinjiang uygur autonomous region,china[j].food control,2014,43(5):276-283.)所用的牛津杯雙層平板法，首先配置濃度為0.02g/ml的副干酪乳桿菌和復合益生菌菌液。配置含100μl伴放線放線桿菌菌液(濃度約為1
×
109cfu/ml)的血平板(tsa+5％脫纖維蛋白羊血)，吸取100μl制備好的益生菌菌液加入牛津杯孔中，培養(yǎng)皿于37℃培養(yǎng)48h后測量抑菌圈直徑。
[0058]
同時，通過共凝聚試驗方法進一步測定益生菌對伴放線放線桿菌的作用效果。在arellano-ayala(k,arellano-ayala.,f,j,ascencio-valle.,p,gutierrez-gonzalez.,etc.hydrophobic and adhesive patterns of lactic acid bacteria and their antagonism against foodborne pathogens on tomato surface(solanum lycopersicum l.)[j].journal of applied microbiology,2020,129:876-891.)和fadare(o,s,fadare.,v,singh.,o,i.,enabulele.,etc.in vitro evaluation of the synbiotic effect of probiotic lactobacillus strains and garlic extract against salmonella species.lwt-food science and technology,2022,153,112439)等所用的方法基礎上進行方法優(yōu)化：將副干酪乳桿菌益生菌干粉和復合益生菌干粉配置成濃度為0.02g/ml的菌液，分別與制備好的伴放線放線桿菌菌懸液按照1:1體積混合，靜置0.5h和1h后輕輕吸取100μl上清液，用十倍稀釋法稀釋，吸取100μl不同比例的稀釋液涂布，37℃下培養(yǎng)48h后計數(shù)。最后，通過比較抑菌圈直徑以及伴放線放線桿菌降低量，選出作用效果較好的益生菌進行下一步試驗，試驗重復三次。
[0059]
結(jié)果顯示：相同濃度下，副干酪乳桿菌與復合益生菌對伴放線放線桿菌的抑制作用沒有顯著差異(表2)，但是抑菌效果均明顯小于茶多酚(p《0.05)。如圖1所示，將濃度均為0.02g/ml的副干酪乳桿菌和復合益生菌與伴放線放線桿菌菌懸液等比例混合放置0.5h后，
伴放線放線桿菌的降低量沒有顯著差異(p》0.05)。放置1h后，經(jīng)副干酪乳桿菌處理后的伴放線放線桿菌降低量為0.22
±
0.02log
10
cfu/ml，顯著高于復合益生菌作用后伴放線放線桿菌的降低量(0.17
±
0.02log
10
cfu/ml)，據(jù)此，選用副干酪乳桿菌進行下一步研究。
[0060]
表2 不同物質(zhì)對伴放線放線桿菌的抑制作用
[0061][0062][0063]
注：平均值
±
標準偏差是三次重復試驗的結(jié)果，每列不同的小寫字母(a,b)表示數(shù)據(jù)之間具有顯著差異性(p《0.05)。
[0064]
將篩選出的益生菌干粉按照0.3％、0.5％、0.7％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％和4％(m/v)的添加量用pbs緩沖液配置成不同濃度的益生菌溶液。按照上述方法操作，通過比較靜置1h后伴放線放線桿菌的菌落降低量選出合適的益生菌添加量，試驗重復三次。
[0065]
結(jié)果表明：將不同濃度的副干酪乳桿菌與伴放線放線桿菌混合作用1h后，當益生菌添加量小于1.0％(0.01g/ml)時，伴放線放線桿菌的降低量沒有顯著差異(p》0.05)，隨著益生菌濃度增高，伴放線放線桿菌的降低量增加(圖2)。然而，當益生菌添加量大于3.0％(0.03g/ml)時，伴放線放線桿菌的降低量逐漸減少。因此，副干酪乳桿菌最適的添加量范圍為1.0％～3.0％。
[0066]
實施例2建立益生菌和茶多酚最佳抑菌模型
[0067]
測定茶多酚對伴放線放線桿菌的最小抑菌濃度(mic)，配置濃度為0.02g/ml的茶多酚溶液，按照二倍稀釋法稀釋(l,zhang.,l,wang.,l,h,yi.,etc.a novel antimicrobial substance produced by lactobacillus rhamnous ls8[j].food control,2017,73:754-760.)，與伴放線放線桿菌的菌懸液按照1:1的比例混合，置于96孔板中于37℃培養(yǎng)48h，以肉眼觀察無細菌生長為最小抑菌濃度。結(jié)果表明：茶多酚的最小抑菌濃度(mic)為2.5mg/ml。
[0068]
另外，按照副干酪乳桿菌的添加量為1％配置益生菌溶液，配置最小抑菌濃度的茶多酚溶液，與益生菌溶液按2:1、1:1、1:2、1:3的體積比例混合，即益生菌與茶多酚的重量比為8:1、4:1、2:1、4:3，之后與伴放線放線桿菌的菌懸液按照1:1的體積比例混合，靜置1h,輕輕吸取上清進行計數(shù)，陽性對照為添加等量的益生菌或茶多酚，陰性對照為添加等量的pbs緩沖液。通過比較伴放線放線桿菌的降低量確定益生菌與茶多酚的最佳比例，試驗重復三次。
[0069]
結(jié)果表明：當益生菌(0.01g/ml)和最小抑菌濃度的茶多酚體積比例為2:1時，即重量比為8:1時，茶多酚和益生菌協(xié)同作用下伴放線放線桿菌的降低量顯著高于單獨的益生菌或茶多酚(圖3)。另外，隨著茶多酚量的增加，茶多酚作用后伴放線放線桿菌的降低量顯著增加，這是因為茶多酚具有殺菌作用(y,li.,x,g,jiang.,j,q,hao.,etc.tea polyphenols:application in the control of oral microorganism infectious diseases.archives of oral biology,2019,102:74-82.)，隨著茶多酚濃度增加，茶多酚和益生菌復配以后的抑菌效果低于單獨的茶多酚。這和上述益生菌和茶多酚的抑菌試驗結(jié)
果一致，進一步表明益生菌的抑菌作用主要依靠共凝聚作用，而茶多酚依靠殺菌作用抑制伴放線放線桿菌的生長。因此，益生菌和茶多酚最佳抑菌模型為益生菌(0.01g/ml)和茶多酚比例為2:1。
[0070]
實施例3益生菌和茶多酚復配抑菌模型的抑菌機理研究-對伴放線放線桿菌生物膜量分析測定
[0071]
參照秦蘇佳(秦蘇佳,徐晚晴,張秋香,等.植物乳桿菌ccfm8724對致齲雙菌生物膜的抑制作用[j].食品與發(fā)酵工業(yè),2020，46(13):127～132.)和phumat等(p,phumat.,s,khongkhunthian.,p,wanachantararak.,etc.comparative inhibitory effects of 4-allylpyrocatechol isolated from piper betle on streptococcus intermedius,streptococcus mutans,and candida albicans.archives of oral biology,2020,113,104690.)采用的方法，對伴放線放線桿菌生物膜量作分析測定。用tsb液體培養(yǎng)基配置最佳配比的益生菌和茶多酚溶液，將配置的益生菌、茶多酚以及益生菌和茶多酚最佳復配模型溶液吸取100μl置于96孔板中，與100μl的伴放線放線桿菌菌懸液等比例混合。陰性對照為tsb培養(yǎng)基與伴放線放線桿菌菌懸液按照等比例混合，37℃下培養(yǎng)48h。之后吸取出培養(yǎng)液，用pbs清洗兩遍，加入50μl濃度為0.5％的結(jié)晶紫避光染色15min，洗滌晾干后用200μl 95％乙醇溶解結(jié)晶紫，用酶標儀在od
595nm
下測吸光度，試驗重復三次。生物膜抑制率計算公式為：
[0072][0073]
牙菌斑生物膜是引起牙周炎的初始因素，抑制致病菌生物膜的形成能夠有效治療牙周病(w,j,kim.,y,soh.,s,m,heo.recent advances of therapeutic targets for the treatment of periodontal disease.biomolecules&therapeutics,2021,29:263-267.)。通過生物膜形成量的測定，可知益生菌和茶多酚均能有效抑制致病菌生物膜的形成，抑制率分別達到62.3％和61.4％(圖4)。益生菌和茶多酚最佳配比抑菌模型對伴放線放線桿菌生物膜量的抑制率上升為71.7％，顯然高于單獨益生菌或茶多酚的抑制率(圖4)。
[0074]
實施例4益生菌和茶多酚復配抑菌模型的抑菌機理研究-掃描電鏡形貌分析
[0075]
利用掃描電鏡觀察用益生菌和茶多酚處理后伴放線放線桿菌細胞表面形態(tài)。參考song等(y,y,song.,l,h,zhang.,l,m,dong.,etc.ph-responsive smart wettability surface with dual bactericidal and releasing properties.acs applied materials&interfaces,2021,13:46065-46075.)描述的方法，將益生菌和茶多酚最佳配比抑菌模型與伴放線放線桿菌菌懸液等比例混合，靜置1h后棄去上清。陽性對照為添加等量益生菌或茶多酚，陰性對照為添加等量的pbs緩沖液。處理組和對照組的菌體沉淀用2.5％戊二醛4℃過夜固定，接著用pbs(0.1mol/l，ph 7.2)清洗兩次，然后用30％、50％、70％、80％、90％和100％的乙醇脫水，最后干燥噴金并進行形態(tài)觀察。
[0076]
如圖5a所示，單獨的伴放線放線桿菌菌體比較完整，表面較為平整。大部分益生菌菌體完整，少部分菌體有輕微凹陷(5b)，分析是因為益生菌制備成干粉時，對菌體有部分損傷。然而，單獨的益生菌和伴放線放線桿菌菌落分散或者單純疊加一起，沒有共凝聚現(xiàn)象。經(jīng)過益生菌處理以后，益生菌和致病菌菌體粘連一起，表明益生菌與致病菌菌體之間產(chǎn)生共凝聚現(xiàn)象(圖5c)。而茶多酚處理以后，菌體表面變得凹凸不平，有部分菌體破裂，細胞內(nèi)物質(zhì)流出(圖5d)，說明茶多酚對致病菌具有殺菌作用，破壞了細菌細胞完整性(y,han.,j,
ch
2-基團都具有較低的表面能，這在疏水性聚合物中非常豐富。伴放線放線桿菌表面也同時具有-ch
2-和-ch3官能團。因此具有相似低表面能基團的益生菌和伴放線放線桿菌會發(fā)生共凝聚，二者共凝聚后未測出-ch
2-和-ch3基團，說明含有低表面能基團的位點由于物質(zhì)共凝聚被遮擋，紅外光譜只能檢測表面官能團，難以準確測定物質(zhì)內(nèi)部基團。而茶多酚和伴放線放線桿菌共凝聚后依然能檢測出-ch
2-和-ch3基團，說明二者共凝聚不是由于低表面能官能團，而是靜電吸附作用。
[0086]
實施例7益生菌和茶多酚復配抑菌模型的抑菌機理研究-細菌表面粗糙度測定
[0087]
細菌表面粗糙度與細菌粘附力大小有關。除了表面成分，本研究也從表面結(jié)構(gòu)上分析了共凝聚機理。配置濃度為0.02g/ml益生菌溶液，參考sandin(j,n,sandin.,s,p,aryal.,t,wilkop.,etc.near simultaneous laser scanning confocal and atomic force microscopy(conpokal)on live cells.jove journal of visualized experiments,2020,162,e61433.)等和韋蕾(韋蕾.原子力顯微鏡研究對硝酸銀和納米銀對細菌的抑菌機理[d].廣西大學,2019.)所用的方法測定細菌表面粗糙度。具體方法為：將益生菌溶液與伴放線放線桿菌(109cfu/ml)菌液分別用2.5％戊二醛固定30min，隨后取5μl滴在云母片上，自然晾干后用原子力顯微鏡測定兩株細菌表面粗糙度。
[0088]
圖7a和c是致病菌的2d原子力顯微鏡光學圖片和3d粗糙度輪廓圖。致病菌表面的平均面粗糙度ra＝11.5nm。圖7b和d是益生菌的2d原子力顯微鏡光學圖片和3d粗糙度輪廓圖。益生菌表面的平均面粗糙度ra＝19.5nm。益生菌比伴放線放線桿菌菌體表面粗糙，結(jié)果表明益生菌粘附作用更強，在口腔內(nèi)能與致病菌競爭粘附位點，減少致病菌的粘附。
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因此綜合上述分析，益生菌和茶多酚的協(xié)同抑菌機理如圖8所示，共有的疏水基團導致益生菌和致病菌發(fā)生共凝聚，將致病菌從口腔內(nèi)帶走，同時天然抑菌物質(zhì)茶多酚也能夠輔助殺死致病菌，與益生菌起到協(xié)同抑菌的增強疊加效應。
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實施例8評價益生菌與茶多酚復配抑菌模型在牙膏中抑菌作用
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8.1試驗方法
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為了評價益生菌與茶多酚在牙膏中對致病菌的抑菌效果，將益生菌與茶多酚按照最佳配比加入牙膏中。除了伴放線放線桿菌atcc 29523，同時選取變異鏈球菌cgmcc 12499和具核梭桿菌atcc 25586，兩株菌均由江蘇大學食品學院提供，將兩株菌接種于血平板上，置入含有80％n2、10％h2、10％co2的厭氧袋中37℃培養(yǎng)48h，調(diào)節(jié)菌體濃度為109cfu/ml。采用高鷹等(高鷹,寧科功,蔡英,等.副干酪乳桿菌對口腔致病菌選擇性抑制作用[j].口腔護理用品工業(yè),2016,26(5):26～28.)的方法稀釋牙膏樣品，具體方法為：稱取0.5g牙膏溶于1ml pbs(ph 7.2-7.4)溶液中，充分振蕩溶解，去除溶液中氣泡。之后分別與三株致病菌菌懸液按照1:1比例混合，靜置培養(yǎng)1h后輕輕吸取上清進行涂布計數(shù)，陽性對照為添加等量的益生菌或茶多酚牙膏，陰性對照為未添加益生菌和茶多酚的牙膏。通過比較致病菌降低量來評價益生菌與茶多酚在牙膏中的抑菌功效，試驗重復三次。
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8.2試驗結(jié)果
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表4為益生菌、茶多酚單獨添加以及益生菌和茶多酚共同添加在牙膏中對口腔常見三種致病菌的作用結(jié)果。添加益生菌和茶多酚后，牙膏對致病菌的抑制作用增強(表4)。同時驗證，將益生菌與茶多酚復配抑菌模型運用在牙膏中，與單獨添加益生菌或茶多酚的牙膏相比，能夠進一步提升致病菌的降低量。從而能更有效地發(fā)揮抑制口腔常見的牙周炎
等致病菌的功效作用。
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表4 不同物質(zhì)在牙膏中對伴放線放線桿菌的抑制作用
[0096][0097]
注：平均值
±
標準偏差是三次重復試驗的結(jié)果，每列不同的小寫字母(a,b)表示數(shù)據(jù)之間具有顯著差異性(p《0.05)。
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本發(fā)明建立了可量化的益生菌和茶多酚復配模型，確定了其對口腔致病菌的抑菌機理及其在牙膏中的功效作用。通過實驗確立益生菌與茶多酚的最佳配比，運用掃描電鏡(sem)、原子力顯微鏡(afm)、傅里葉紅外光譜(ft-ir)、表面電荷分析等多種材料學和生物化學分析手段進行生物膜抑制量等特性指標測定、菌體形態(tài)觀察、細菌表面成分及粗糙度分析，探究益生菌和茶多酚對伴放線放線桿菌的協(xié)同抑菌機理。實驗結(jié)果表明，益生菌與茶多酚的最佳配比為2:1，對致病菌生物膜的抑制率提高至71.7％，復配模型通過共凝聚和殺菌雙重作用抑制伴放線放線桿菌的生長。比對益生菌、茶多酚單獨添加以及益生菌和茶多酚復配抑菌模型在牙膏中對三種常見致病菌(伴放線放線桿菌、變異鏈球菌和具核梭桿菌)的抑菌作用結(jié)果的差異性，為益生菌干粉復配茶多酚抑菌模型在牙膏等口腔清潔護理用品中的應用，提供充分的理論依據(jù)與運用技術(shù)的支撐。綜上，本發(fā)明闡明了益生菌與茶多酚的協(xié)同抑菌機理，驗證了益生菌和茶多酚復配抑菌模型在牙膏中的抑菌作用。
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以上對本技術(shù)實施例進行了詳細介紹，本文中應用了具體個例對本技術(shù)的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明僅用于幫助理解本技術(shù)的方法及其核心思想。同時，本領域技術(shù)人員依據(jù)本技術(shù)的思想，基于本技術(shù)的具體實施方式及應用范圍上做出的改變或變形之處，都屬于本技術(shù)保護的范圍。綜上所述，本說明書內(nèi)容不應理解為對本技術(shù)的限制。

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