導(dǎo)讀  

背景&目標(biāo)：流行病學(xué)和小鼠研究表明，膳食乳化劑促進(jìn)了與微生物群失調(diào)相關(guān)的疾病的發(fā)展。雖然這些化合物對腸道微生物群和腸道健康的不利影響已在動物和體外模型中得到證實(shí)，但這些食品添加劑對健康人類的影響仍不清楚。

方法：為了在人類中檢驗(yàn)這一概念，我們對普遍存在的合成乳化劑羧甲基纖維素（CMC）進(jìn)行了雙盲對照飲食研究，其中健康成人連續(xù)11天僅食用無乳化劑飲食（n = 9）或每天添加15 g CMC（n = 7）的相同飲食。

結(jié)果：與對照受試者相比，食用CMC會適度增加餐后腹部不適和腸道菌群組成紊亂，從而降低其多樣性。此外，飲食CMC的受試者表現(xiàn)出糞便代謝組的變化，特別是短鏈脂肪酸和游離氨基酸的減少。此外，我們確定了2名飲食CMC的受試者，他們表現(xiàn)出微生物群侵入通常無菌的內(nèi)粘液層的增加，這是腸道炎癥的一個主要特征，并且微生物群組成發(fā)生了明顯變化。

結(jié)論：這些結(jié)果支持了在加工食品中廣泛使用CMC可能通過改變腸道微生物組和代謝組而導(dǎo)致一系列慢性炎癥性疾病發(fā)病率增加的觀點(diǎn)。

圖文摘要

論文ID

原名：Randomized controlled-feeding study of dietary emulsifier carboxymethylcellulose reveals detrimental impacts on the gut microbiota and metabolome

譯名：飲食乳化劑羧甲基纖維素的隨機(jī)對照飼養(yǎng)研究揭示了其對腸道微生物群和代謝組的不利影響

期刊：Gastroenterology

IF：22.682  

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)果

我們招募了16名受試者，根據(jù)缺乏疾病史或代謝綜合征的現(xiàn)有證據(jù)（見方法），他們被隨機(jī)分配到含有CMC（n = 7）或?qū)φ眨╪ = 9）的飲食中，研究者和受試者均對分配不知情（圖1A和表S1）。兩組在年齡、性別、體重指數(shù)和血壓方面相似（圖1B）。

在篩選時，兩組受試者均使用主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示相似的飲食，以可視化受試者在研究登記時提供的各種食物回憶反應(yīng)（圖S1）。在研究第4-14天，所有受試者食用3份布朗尼蛋糕和3份冰糕，每份中不含或含有2.5 g CMC。兩組受試者的體重均下降約1 kg并在血糖控制方面有適度改善，兩組之間的改善程度無顯著差異，但CMC飲食組的血清胰島素水平略有下降（圖1C-D）。CMC的攝入與嚴(yán)重不良事件或血清炎癥細(xì)胞因子水平的改變無關(guān)，也不會對食欲、食物消耗或腹脹產(chǎn)生明顯影響（圖1E和S2）。

此外，已用作腸道通透性間接測量的抗脂多糖和抗鞭毛蛋白IgG抗體的水平在對照或CMC飲食的受試者的研究過程中沒有變化（圖S3）。CMC的攝入確實(shí)與餐后腹痛的適度顯著增加相關(guān)（圖1F，P = 0.019）。

圖1. 羧甲基纖維素?cái)z入對代謝參數(shù)的影響。

A，在攝入CMC之前、期間和之后進(jìn)行日常監(jiān)測和樣本采集的住院研究示意圖，以及口服葡萄糖耐量試驗(yàn)、腸活檢和糞便采集的時間。

B，研究開始時研究參與者的生物形態(tài)學(xué)特征。

C，飲食乳化劑CMC攝入對各種代謝參數(shù)的影響，在干預(yù)前和干預(yù)后測量。

D-F，飲食乳化劑CMC攝入量對體重（D）、PROMISE脹氣/腹脹（E）和腹痛（F）評分的影響，在干預(yù)前和干預(yù)后測量。

OGTT，口服葡萄糖耐量試驗(yàn)。使用Mann-Whitney檢驗(yàn)確定顯著性；*P < 0.05與對照組相比。

1 微生物群組成

通過16S rRNA基因測序?qū)γ咳帐占募S便樣本的微生物群組成進(jìn)行表征。與之前的研究一致，樣本之間成對距離（未加權(quán)的UniFrac）的PCoA顯示受試者內(nèi)部存在強(qiáng)烈的聚類，表明腸道微生物群組成的個體間差異程度超過了飲食短期改變的影響（圖2A，Permanova P = .001）。因此，作為關(guān)注CMC對每個受試者的潛在影響的一種方法，我們使用在第4天上午采集的樣本，即受試者在研究中開始服用CMC的那一天，對所有微生物群組成數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。該方法顯示，在干預(yù)期間飲食CMC的受試者的微生物群組成發(fā)生了更大的變化，導(dǎo)致PCoA圖在食用CMC 10天后顯示出明顯的基于處理的聚類（圖2B，Permanova第0天P = 0.928，第9天P = 0.228，第14天P = 0.002）。此外，對從第4天早上開始的Bray-Curtis距離變化的分析顯示，與對照組相比，CMC組在干預(yù)期間的微生物群變化趨勢更大（圖2C，P = .102）。這些微生物群組成的相對變化在對照組和CMC組之間的每日糞便重量（圖S4）或糞便細(xì)菌密度沒有顯著變化（圖2D，飲食效應(yīng)P = 0.503）。在干預(yù)期間，門和目水平分析未顯示CMC組和對照組之間存在顯著差異（圖S5）。對CMC組和對照組之間差異最顯著的序列變異（SVs）的調(diào)查顯示，與第4天相比，對照組受試者在第14天的SVs普遍穩(wěn)定，相對值非常接近1（圖S6），而這些SVs的相對豐度受CMC消耗量的顯著影響，包括普氏棲糞桿菌（Faecalibacterium prausnitzii）和瘤胃球菌（Ruminococcus sp.）的減少，以及羅斯氏菌（Roseburia sp.）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）的增加（圖S6）。雖然很難將功能性后果可靠地歸因于這些改變，但我們注意到，食用CMC會導(dǎo)致普氏棲糞桿菌的損失，這與健康有關(guān)，并且已知會介導(dǎo)有益代謝物的產(chǎn)生，如短鏈脂肪酸。 

CMC還降低了微生物群的豐富度，這是各種疾病狀態(tài)的標(biāo)志，如均勻度（圖2E，飲食效應(yīng)P = 0.070，第9天P = 0.059，第14天P = 0.032）和Shannon指數(shù)（飲食效應(yīng)P = 0.151，第14天P = 0.091）的降低所示。為了進(jìn)一步研究CMC對微生物群組成的影響，我們接下來對飲食CMC前10天或之后不久（分別為第4天和第14天）收集的糞便樣本進(jìn)行鳥槍宏基因組測序。質(zhì)量過濾讀長被分配到分類群和功能。使用Bray-Curtis距離的PCoA分析來比較受試者聚類中所有樣本在分類和功能上的差異（圖3A和S7A），反映了使用16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)觀察到的模式。盡管如此，根據(jù)分類法（圖S7B-C），尤其是基于功能的分析（圖3B-C，Bray-Curtis距離的PCoA分析），對照組和CMC飲食組受試者的樣本在處理后仍存在明顯的聚類。通過Maaslin2確定的驅(qū)動此類聚集的顯著改變的功能類別包括多種微生物代謝途徑，表明CMC誘導(dǎo)的微生物群組成改變可能對微生物群功能產(chǎn)生廣泛影響（圖3D）。

圖2. 羧甲基纖維素?cái)z入對微生物群組成的影響。

A，通過16S rRNA基因測序評估的研究參與者微生物群的未加權(quán)UniFrac距離矩陣的主坐標(biāo)分析。所有時間點(diǎn)都包含在表示中，樣本由參與者著色。

B，根據(jù)第4天的值對每個SVs進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，研究參與者微生物群組成在第0、9和14天的Bray-Curtis距離矩陣的主坐標(biāo)分析，樣本按組著色。

C，每組微生物群落結(jié)構(gòu)隨時間的變化，通過從第4天到隨后幾天的Bray-Curtis距離測量。

D，16S qPCR評估的糞便細(xì)菌負(fù)荷。

E，在第0、9和14天，CMC干預(yù)組與對照組的均勻度和Shannon α多樣性測量值的變化。使用雙向方差分析對Bonferroni后檢驗(yàn)（E圖）、多重t檢驗(yàn)（E圖）或PERMANOVA分析（A-B圖）的多次比較進(jìn)行校正，以確定顯著性。

 圖3. 羧甲基纖維素?cái)z入對糞便宏基因組的影響。A，通過鳥槍測序評估研究參與者宏基因組（uniref90類別）的Bray-Curtis差異的主坐標(biāo)分析。第4天和第14天包含在表示中，樣本由參與者著色。B-C，研究參與者宏基因組在第4天（B）和第14天（C）的Bray-Curtis距離矩陣的主坐標(biāo)分析，通過鳥槍法測序評估，樣本按組著色。

2 糞便代謝組的變化

為了研究CMC對微生物群影響的功能性后果，我們首先檢測了糞便中已知介導(dǎo)宿主微生物群相互作用的分子水平。使用TLR4和TLR5報(bào)告細(xì)胞分別顯示，飲食CMC不會影響糞便中脂多糖和鞭毛蛋白的水平（圖4A，B，Bonferroni多重比較試驗(yàn)的混合效應(yīng)分析，4A的飲食效應(yīng)P = 0.413，4B的飲食效應(yīng)P = 0.220，Bonferroni校正了所有天數(shù)的P>0.1）。糞便lipocalin-2（一種炎癥標(biāo)志物）的水平?jīng)]有顯著變化（圖4C，Bonferroni多重比較試驗(yàn)的混合效應(yīng)分析，飲食效應(yīng)P = .258，Bonferroni校正P>1，所有天數(shù)）。接下來，我們試圖廣泛地研究CMC改變糞便代謝組的程度，糞便代謝組既受腸道微生物群的影響，又介導(dǎo)其對宿主的許多影響。我們使用了一種基于1H NMR的靶向分析，能夠定量測定健康人糞便中可靠檢測到的約40種代謝物，其中許多代謝物可能受到腸道微生物群的影響。

總體而言，微生物群代謝功能的人際異質(zhì)性遠(yuǎn)小于物種組成的異質(zhì)性，我們比較了對照組和CMC飲食受試者之間的糞便代謝組，未進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以糾正受試者之間的基礎(chǔ)差異。因此，在飲食CMC之前（第4天），研究組的糞便代謝組沒有明顯的聚類（圖4D，Permanova第0天P = 0.573）。相比之下，在飲食CMC后，這種方法顯示出明顯的區(qū)分對照與CMC喂養(yǎng)受試者的糞便代謝組的能力（圖4D，Permanova第9天P = 0.001，第14天P = 0.001）。同時，在第14天顯示每個受試者的每個代謝物的個體值（圖S8），以及通過熱圖查看各組隨時間的平均值（圖4E），表明CMC飲食的受試者的糞便代謝組平均耗盡了一系列微生物群相關(guān)的代謝物，包括短鏈脂肪酸和必需氨基酸。在開始飲食CMC后3天內(nèi)，這些變化非常明顯，在整個飲食CMC期間保持不變，并且在大約1個月后（第48天）對受試者重新取樣時，這些變化已經(jīng)消失（圖4E）。

此外，基于NMR的糞便氨基酸濃度檢測表明，糞便中大量氨基酸的數(shù)量減少，如圖S9所示。盡管糞便細(xì)菌密度（圖2D，調(diào)整后的P = 0.503）或每個受試者產(chǎn)生的總糞便質(zhì)量沒有顯著差異（圖S4，對照組的組內(nèi)糞便重量變化P = 0.903，CMC組的組內(nèi)糞便重量變化P = 0.990），但CMC受試者糞便中代謝物的消耗發(fā)生了，反對它反映了細(xì)菌的損失或糞便稀釋。CMC也沒有直接抑制基于NMR的氨基酸檢測（圖S10），這表明這些代謝物的減少并不反映技術(shù)上的人為因素，而是CMC飲食耗盡了一系列與微生物群相關(guān)的代謝物。

圖4. 羧甲基纖維素?cái)z入對糞便代謝組的影響。

A，用HEK-TLR4報(bào)告細(xì)胞測量的從第0天到隨后幾天糞便中生物活性LPS水平的變化。

B，用HEK-TLR5報(bào)告細(xì)胞測量的從第0天到隨后幾天糞便中生物活性鞭毛蛋白水平的變化。

C，從第0天到隨后的幾天，糞便中炎癥標(biāo)志物L(fēng)ipocalin-2水平的變化。

D，研究參與者糞便代謝組在第0、9和14天的Euclidean距離的主坐標(biāo)分析，樣本按組著色。

E，在研究過程中展示參與者糞便代謝組的熱圖。

F，在對照組和CMC處理組中，從第0天到隨后的幾天，糞便中羧甲基纖維素水平的變化。

G，對照組從第0天到隨后的幾天糞便中羧甲基纖維素水平的變化。

使用雙向方差分析(Bonferroni post-test)或重復(fù)t檢驗(yàn)（用假發(fā)現(xiàn)率方法對panel G進(jìn)行校正）對多個比較進(jìn)行校正，從而確定顯著性；*P< 0.05與圖F的對照組相比，*P<0.05與圖G的第0天相比。

3 一種新的CMC定量分析方法

使用放射性標(biāo)記CMC進(jìn)行的動物研究表明，大多數(shù)標(biāo)記在糞便中被消除了，表明該化合物吸收不良。因此，我們開發(fā)了一種新的基于1H NMR的分析方法，該方法檢測到接受含CMC飲食的受試者糞便中含有大量看似完整的CMC，并與食用對照飲食的受試者和正常飲食的受試者進(jìn)行了比較（圖4F和S11）。雖然通過本試驗(yàn)測得的CMC非零水平可能反映了背景（即，另一種具有類似CMC光譜特性的糞便代謝物），但食用無添加劑飲食的參與者的水平顯著降低（除第13天外的所有時間點(diǎn)P<0.05），并在研究后第48天和第107天的后續(xù)增加表明，讀數(shù)捕捉到了參與我們研究之前或之后食用的加工食品中所含的CMC（圖4G）。

進(jìn)一步符合CMC不被吸收的觀點(diǎn)，在尿液中無法檢測到CMC，尿液代謝組的改變也與CMC的攝入有關(guān)（圖S12）。因此，我們的結(jié)果與CMC未被吸收但顯著改變宿主-微生物群關(guān)系的觀點(diǎn)一致。

4 腸粘膜與微生物群之間的距離和CMC敏感受試者的鑒定

一系列慢性炎癥疾?。ò↖BD、代謝綜合征和癌癥）中宿主微生物群相互作用改變的一個特征是腸道微生物群侵入通常接近無菌的內(nèi)部粘液層。因此，我們假設(shè)，我們假設(shè)CMC的攝入可能導(dǎo)致微生物群減少細(xì)菌-上皮距離，這是通過共聚焦顯微鏡在干預(yù)期之前或之后收集的Carnoy溶液中保存的遠(yuǎn)端結(jié)腸活檢中測量到的。平均而言，對照組或CMC組的細(xì)菌上皮距離在研究過程中沒有改變。然而，CMC組中的2名個體受試者顯示該參數(shù)顯著降低，因此他們的活檢顯示CMC暴露后細(xì)菌非常接近上皮（圖5A和S13），這讓人想起了在IBD患者中所做的觀察。應(yīng)用Fisher精確檢驗(yàn)觀察到，在研究過程中，7名CMC飲食的受試者中有2名和9名對照受試者中有0名表現(xiàn)出這種表型變化，得出的雙尾P值為0.175，雖然不符合統(tǒng)計(jì)顯著性的一般標(biāo)準(zhǔn)，但仍表明其有合理的可能性是CMC處理的結(jié)果。

因此，我們檢測了是否有任何臨床和/或微生物群參數(shù)可以讓我們深入了解這些看似CMC敏感的受試者。盡管這些受試者在臨床參數(shù)或炎癥標(biāo)志物方面沒有不同的反應(yīng)，但相對于CMC組中的其他參與者，他們在飲食CMC后的微生物群組成的相對變化明顯更大（圖5B-C，組效應(yīng)P = 0.004）。此外，這些受試者的糞便LPS水平顯著升高（圖5D，組效應(yīng)P = 0.005）。使用Bray-Curtis距離的β多樣性檢測對功能水平的宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，相對于CMC組的其他參與者，這兩名參與者在CMC攝入后的微生物群功能相對變化明顯更大（圖5G，P = 0.0002）。

臨床試驗(yàn)開始時進(jìn)行的形態(tài)特征分析表明，CMC敏感受試者均為男性，與CMC組的其他成員相比年齡較大，沒有任何其他顯著差異（體重、身高、BMI、SBP、DBP，圖5H）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明，一些個體可能因攝入CMC而容易發(fā)生宿主微生物群相互作用的改變，未來的研究有必要調(diào)查對腸道健康的長期影響。

圖5. 對羧甲基纖維素?cái)z入的反應(yīng)的受試者間變異性。

A，膳食乳化劑CMC攝入對微生物群定位（最近細(xì)菌與上皮表面的距離）的影響，在干預(yù)前和干預(yù)后測量。

B，對于來自CMC處理組的每個研究參與者，從第4天到隨后的幾天，Bray-Curtis距離矩陣的變化。

C，Bray-Curtis距離矩陣的變化，對于CMC-Insensitive和CMC-Sensitive組，從第4天到隨后的幾天。

D，用HEK-TLR4報(bào)告細(xì)胞測量的從第0天到隨后幾天糞便中生物活性LPS水平的變化。E，用HEK-TLR5報(bào)告細(xì)胞測量的從第0天到隨后幾天糞便中生物活性鞭毛蛋白水平的變化。

F，從第0天到隨后的幾天，糞便中炎癥標(biāo)志物L(fēng)ipocalin-2水平的變化。

G，通過 Bray-Curtis距離測量的膳食乳化劑CMC攝入對糞便宏基因組的影響。

H，研究開始根據(jù)CMC敏感性狀態(tài)對研究參與者進(jìn)行生物形態(tài)學(xué)表征。使用單向方差分析校正了Bonferroni后檢驗(yàn)的多次比較（圖A和G）或雙向方差分析校正了Bonferroni后檢驗(yàn)的多次比較（圖C、D、E和F）。

NS，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討論

20世紀(jì)中期以后，慢性炎癥疾病發(fā)病率的增加與高度加工食品的消費(fèi)量的增加大致相當(dāng)，長期以來一直暗示此類食品的某些成分可能會促進(jìn)炎癥。對腸道微生物群在驅(qū)動炎癥中的作用的認(rèn)識導(dǎo)致人們對能夠擾亂宿主-微生物群關(guān)系的食品添加劑產(chǎn)生興趣。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，一些飲食乳化劑可以在體外和動物模型中影響微生物群，從而促進(jìn)炎癥性疾病，這表明這些化合物可能是這一概念的一個具體例子。然而，這些物質(zhì)在多大程度上實(shí)際增加了人類食用的劑量和頻率的疾病風(fēng)險(xiǎn)，仍然不太清楚。

我們的研究結(jié)果表明，食用一種廣泛使用的食品添加劑，即合成乳化劑羧甲基纖維素（CMC），以一種看似有害的方式影響人類的微生物群，這是填補(bǔ)這一知識空白的一步。

基于流行病學(xué)的食品添加劑研究在評估特定食品添加劑后果方面的能力有限，原因很多。首先，這些成分在商業(yè)制備的食品中的濃度并沒有被廣泛的報(bào)道，這使得定量估計(jì)人類的食品添加劑消耗量極具挑戰(zhàn)性。此外，加工食品通常含有多種潛在有害成分，這使得關(guān)聯(lián)的驅(qū)動因素難以識別。

由于需要長時間的隨訪，評估食品添加劑對疾病發(fā)病率影響的隨機(jī)對照試驗(yàn)非常具有挑戰(zhàn)性。盡管如此，它們?nèi)匀皇氰b定特定影響成分的換黃金標(biāo)準(zhǔn)手段，例如人工甜味劑。事實(shí)上，控制飲食研究，如我們的研究，是在嚴(yán)格控制的環(huán)境下研究人類對短期飲食暴露的生理反應(yīng)的理想方法。我們的設(shè)計(jì)使我們能夠關(guān)注與慢性病相關(guān)的微生物群變化，其中已經(jīng)提出了因果關(guān)系。我們觀察到腸道微生物群、糞便代謝組的顯著變化，以及在一部分參與者中，微生物群侵占了腸道上皮。CMC飲食后糞便代謝組的主要變化是據(jù)稱有益代謝物的損失。我們認(rèn)為這種變化可能反映了關(guān)鍵分類群的喪失和/或微生物群落內(nèi)穩(wěn)態(tài)的普遍破壞。我們還證明，可以通過量化糞便中的CMC水平來測定CMC的攝入量，從而提供了一種工具來促進(jìn)長期研究，以解決CMC暴露在發(fā)達(dá)國家促進(jìn)慢性病日益流行的程度。

本研究中使用的CMC劑量（15 g/人/天）可能超過大多數(shù)人的CMC攝入量，但可能接近飲食主要由含有大量乳化劑的高度加工食品組成的人的乳化劑消耗總量，其中許多似乎對體外培養(yǎng)的人類微生物群產(chǎn)生不利影響。雖然本研究集中在一種特定的食品添加劑CMC上，但獲得的結(jié)果支持了將這一范式應(yīng)用于其他低濃度飲食乳化劑及其混合物的必要性，從而更好地模擬其在加工食品中的使用。此外，我們認(rèn)為重要的是要識別乳化劑在體外對人體微生物群的高度異質(zhì)性影響在體內(nèi)的重現(xiàn)程度。

最后，雖然我們的研究沒有發(fā)現(xiàn)CMC敏感/CMC不敏感的參與者，但我們的結(jié)果表明，微生物群對這種食品添加劑的反應(yīng)可能是高度個性化的。雖然需要后續(xù)研究來更好地了解這種個體間的差異性，并評估其在驅(qū)動微生物群介導(dǎo)的疾病狀態(tài)中的作用，但我們的發(fā)現(xiàn)認(rèn)為，特定的食品添加劑可能會擾亂宿主-微生物群的關(guān)系，從而促進(jìn)個體亞群中的疾病。如果我們的結(jié)果在長期隨訪的大型研究中得到證實(shí)，那么確定的機(jī)制可能會為健康的食物選擇提供信息，并促進(jìn)更健康的加工食品的開發(fā)。

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研究和應(yīng)用環(huán)保型飼料是飼料業(yè)發(fā)展必然趨勢.pdf全文

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